材料和试剂

无菌平端22G针头（例如，利文斯通，目录号：DN22GX1.25B）
25和75 cm 2细胞培养瓶（Corning，目录号s ：430168和430720）
175 cm 2细胞培养瓶（Sarstedt ，目录号：83.3912）
显微镜载玻片（Hurst Scientific，目录号：WGDFCE90）
15和50 ml离心管（Corning，目录号s ：430791和430829）
一次性500毫升瓶顶真空过滤器（Corning，目录号：431118）和无菌收集瓶
一般塑料消耗品（血清移液管，吸液移液管，1.7 m l微量离心管，20 m l注射器，移液管头；Sarstedt或Corning）
新鲜的（不到10天）人血红细胞（RBC），血型为O + （澳大利亚红十字会的生命线）
从至少5种相同血型的供体中收集热灭活的人血清（澳大利亚红十字会的生命线）
恶性疟原虫3D7-gABCG2-GFP ; 表达GFP标签的配子配体ATP结合盒转运蛋白家族成员2（gABCG2）蛋白的恶性疟原虫3D7菌株寄生虫（PlasmoDB登录号PF3D7_1426500）（Tran等，2014）
RPMI 1640 Medium，GlutaMAX TM Supplement，HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：72400120）
庆大霉素10 mg / ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15710072）
D-（+）-葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：G7021）
次黄嘌呤（Sigma - Aldrich，目录号：H9377）
氢氧化钠（NaOH，Sigma - Aldrich，目录号：S5881）
Milli - Q水（来自任何可用的净化系统的新鲜水）
AlbuMAX TM II富脂BSA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11021045）
WR99210（Jacobus制药）
D-山梨糖醇（Sigma - Aldrich，目录号：S6021）
甲醇（用于吉姆萨染色）（默克，目录号：1060092511）
Giemsa的解决方案（Merck，目录号：109240500）
浸油（Sigma - Aldrich，目录号：56822）
N-乙酰基-D-葡萄糖胺（GlcNAc ; Carbosynth ，目录号：MA00834）
Hoechst 33342（Sigma - Aldrich，目录号：B2261）
1×磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4（PBS ；参见配方）
45％D-（+）-葡萄糖（w / v）（参见食谱）
1 M NaOH （请参阅食谱）
200 mM次黄嘌呤（参见食谱）
不完整的培养基（ICM ；请参阅食谱）
5％AlbuMAX II（w / v）（参见食谱）
热灭活的人血清（请参见食谱）
完全培养基（CCM ；请参阅食谱）
5％D-山梨糖醇（w / v）（参见食谱）
完整培养基，添加50 mM GlcNAc （请参阅食谱）
10 mg / ml Hoechst 33342 （请参阅食谱）
1 × PBS，含10 mM葡萄糖（请参阅食谱）
含10 mM葡萄糖的1×PBS中的10 µg / ml Hoechst 33342 （请参阅食谱）

设备

生物安全柜（爱德华兹集团的Safemate Vision Class II）
真空泵和液体抽吸系统（单缸TC501，Sparmax ）
37°C恒温箱（SEM台式恒温箱）
疟疾气体混合物（1％氧气2 ，5％CO 2 ，94％N 2 ; BOC，目录号：CCS402562G2）
水浴（WB7，Ratek ）
用100×物镜化合物显微镜（Olympus，米Odel等：BX41）
台式离心机15个50毫升管（Beckman Coulter公司，米Odel等：Allegra的X-15R）
台式离心机，用于微量离心管（Thermo Scientific，型号：Heraeus Pico 17）
带有无菌旋塞阀的CS色谱柱（Miltenyi Biotec ，目录号：130-041-305）
SuperMACS TM II分离器（Miltenyi Biotec ，目录号：130-044-104）
BD FACSAria TM细胞分选仪（BD Biosciences）

软件

BD FACSDiva TM软件（BD Biosciences）

程序

无性恶性疟原虫的维持
1.在完全培养基中，在细胞培养瓶中以4％的血细胞比容和少于5％的寄生虫血症维持无性恶性疟原虫转基因寄生虫（3D7-gABCG2-GFP）。该转基因菌株在2nM WR99210的存在下得以维持。监视器原虫每隔一天用姬姆萨染色涂片厚（迈尔和地毯，2013年）（注1）。计数至少300个细胞（最好使用血细胞计数器或计数计数器）以确定培养物中的寄生虫血症。

2.用完全培养基（CCM）代替培养基，并每隔2天将培养物分裂为0.2％的寄生虫血症。齐平的疟疾气体混合物中的培养瓶1％氧气2 ，5％CO 2 ，和94％N 2 30秒，关闭盖紧紧，孵育在37℃下（标准培养条件）（迈尔和地毯，2013 ）。

3.为了产生大量高度纯化的雄性和雌性配子细胞，将细胞培养物扩展到至少60 ml，然后继续配子细胞的生产（注2）。

雄配子和雌配子的产生（图1）

图1.流程图概述了过程的时间表

第六天从60 ml培养液开始，培养液的3-5％主要是环寄生性贫血和4％的血细胞比容。按如下步骤进行山梨醇同步化处理（Lambros和Vanderberg ，1979）。将培养物分成两半，转移到两个50 ml离心管中，在室温（RT）下以800 × g离心7分钟。丢弃上清液，并将每个细胞沉淀重悬于10 ml的5％D-山梨糖醇中。在37°C下孵育10分钟。在室温下以800 × g离心7分钟，弃去上清液，然后将每个细胞沉淀重悬于30 ml CCM中。合并两个试管的悬浮液，并在标准条件下孵育培养物。
第-5天。从吉姆萨（Giemsa）染色的浓稠涂片（注3）的清晨（同步后12-18 h ）确定寄生虫血症。在1个175 cm 2大细胞培养瓶中，在1％滋养体寄生虫和4％血细胞比容下将培养液扩展至200 ml 。用疟疾气体混合物冲洗培养瓶，并在标准条件下孵育。
第四天从吉姆萨染色浓密的涂片确定寄生虫病。培养应在3-5％的环寄生虫病中进行。如果寄生虫血症较低，则培养寄生虫进行另一个复制周期，而不允许寄生虫毒素超过5％的滋养体。如下进行山梨醇同步化（Lambros和Vanderberg ，1979）。小心吸出培养基从烧瓶中，而不会干扰RBC层和重悬细胞于30ml 5％d的-山梨糖醇。将悬浮液转移到离心管中。用10毫升5％的d洗烧瓶-山梨糖醇，并将其加入到离心管中，以防止细胞的损失。在37°C下孵育10分钟。在室温下将培养物以800 × g离心7分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于30 ml CCM中。将悬浮液放回175 cm 2细胞培养瓶中，用30 ml 5％D-山梨醇冲洗，用CCM加至200 ml，用疟疾气体混合物冲洗，并在标准条件下孵育过夜。
第-3天。从吉姆萨染色浓密的涂片中确定寄生虫病。在两个175 cm 2细胞培养瓶（每个瓶中包含200 ml培养物）中，在2％滋养体寄生虫和4％血细胞比容下将培养物扩展至400 ml ，用疟疾混合气体冲洗，并在标准条件下孵育过夜。
第-2天。从吉姆萨染色浓密的涂片中确定寄生虫病。理想情况下，培养应处于10-12％的环形阶段寄生虫血症（注4）。小心地取出50毫升的从每个细胞培养瓶培养基而不扰乱细胞和加入50mL的新鲜CCM（只更换介质体积的25％继续强调培养物）。用疟疾气体混合物冲洗烧瓶，并在标准条件下孵育培养物过夜。
第-1天。从吉姆萨染色浓密的涂片中确定寄生虫病。重悬培养并将等体积分成六个175 cm 2细胞培养瓶。用新鲜的CCM加满每个烧瓶至200 ml，并用新鲜的红细胞将血细胞比容调节至4％（这将在6个烧瓶中产生1200 ml的细胞培养物）。用疟疾气体混合物冲洗烧瓶，并在标准条件下孵育培养物。
第0天。
如下进行山梨醇同步化（Lambros和Vanderberg ，1979）。从每个烧瓶中小心吸出培养基，并将每个烧瓶中的细胞重悬于30 ml的5％D-山梨糖醇中。将悬浮液转移到离心管中，用10 ml的5％山梨糖醇洗涤每个烧瓶，并将其添加到离心管中以防止细胞丢失。在37°C下孵育10分钟。在室温下将培养物以800 ×g离心7分钟，弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于30 ml CCM中（产生约25％血细胞比容的细胞悬液）。
使用SuperMACS分离器和CS色谱柱除去滋养体或裂殖体阶段的异步寄生虫和自发定殖的配子细胞（注5）。
组装的根据制造商的在生物安全柜的指令（图2）CS柱和磁分离器。为避免意外刺针，请使用钝的末端针头（22G拔起针头，注意6），并用钳子夹住针头护套的末端，而不要取下护套。

图2.用于SuperMACS TM磁选机的CS色谱柱的组装

用25ml的80％乙醇（如果消毒柱它先前已被使用）（注7），冲洗，用25ml的1×PBS的（pH值7.4 ，加热到37 ℃下），然后素用25ml ICM的（通过将储液器注满并用注射器将液体从色谱柱中吸出，将温度升至37°C ）。要除去气泡，请在注射器上装入ICM，将其重新安装到旋塞阀上，然后向上冲洗ICM穿过色谱柱。绘制ICM回注射器中，直到该ICM水平正好处于过滤器上方。重复冲洗该柱，直到所有气泡被除去，然后通过针排出多余的ICM直到所述ICM水平仅仅是过滤器上方。由于气泡会减少色谱柱的结合表面，因此请确保色谱柱从此处开始永远不会干dry（液体表面必须始终保持在过滤器上方）。
将柱子放在磁铁之间，并在针（流动电阻器）下方放置一个收集管。将一个烧瓶的25％血细胞比容RBC悬浮液加载到色谱柱上（图3 ）。逐滴通过色谱柱排干（用旋塞阀将流速调节至约3 ml / min），收集流出液，该流出液包含未感染的红血球和参与配子形成的环。

图3.在磁场中装有25％的红细胞比容RBC悬浮液的CS色谱柱。旋塞阀阻止向下流过针头。逐渐将其顺时针旋转以缓慢排出培养液。

将50 ml CCM （加热到37°C ）装满色谱柱，并通过流动电阻器将其排放到收集管中，直到流出物不再是红色为止。
将所有流出物转移到175 cm 2的细胞培养瓶中，并用CCM加满200 ml。用疟疾气体混合物冲洗烧瓶，并在标准条件下孵育。
从磁体之间移出色谱柱，并通过将25 ml ICM加载到色谱柱上，将液体吸入注射器中，然后丢弃进行冲洗。重复直到冲洗液不再呈褐色。用6 ml ICM填充储槽，使其流过色谱柱和针头。
重复小号TEPS B7 B（三-六），直到所有的培养瓶已被纯化。
冲洗用25ml的1×PBS，将50ml的柱的高压灭菌的中号ILLI - Q水，通过将液体到注射器和废弃和25ml 100％乙醇它。用6 ml 100％乙醇填充储液槽，使其自由流过色谱柱和针头。风干生物安全柜中的色谱柱。拆卸色谱柱和旋塞阀，然后将其存储在密封的无菌塑料袋中以备重复使用。丢弃用过的针头和注射器。
每日1作为第0天（描述执行山梨醇同步小号TEP乙7一），但重悬每个烧瓶中的RBC沉淀在30ml含50 CCM（约8毫升积细胞体积）毫N-乙酰基d葡糖胺（GlcNAc ）。将悬浮液转移至175 cm 2的细胞培养瓶中，用含50 mM GlcNAc的CCM加满200 ml，用疟疾气体混合物冲洗培养瓶，并在标准条件下孵育[注8; Fivelman等。（2007）] 。
天小号2 - 6.更换该培养物中的日常用补充有50新鲜CCM介质毫的GlcNAc ，冲洗以疟疾气体混合物中的烧瓶中，在标准条件下孵育。
如在第1天（天描述7.执行山梨醇同步小号TEP乙8）。
第8天（注9）。
如在第0天（描述执行山梨醇同步小号TEP乙7a）中，创建约25％的细胞悬浮液的血细胞比容在ICM。
使用SuperMACS分离器和CS柱纯化成熟的配子细胞。分别纯化和洗脱每个烧瓶中的配子细胞。
按照相同的程序，在小号TEP乙7B（我- ⅲ）。为了最大程度地提高产量，将废水重新装到色谱柱上，然后逐滴排放到废液瓶中。成熟的配子细胞（大部分为IV期）保留在色谱柱中（注10）。
在柱子上加入50 ml加热至37°C的ICM，并通过针头排入废液瓶，直到流出液不再呈红色。
从磁体之间移走色谱柱，并通过向色谱柱中加载25 ml CCM并通过针头滴入收集管的方式将其洗脱，从而洗脱保留的配子细胞。将废水转移到175 cm 2的细胞培养瓶中，用疟疾气体混合物冲洗该瓶，并在标准条件下孵育。
重复小号TEPS B11B（我- III ），直到所有的培养物已被纯化，加入从所有培养物的流出物进入相同175厘米2细胞培养瓶（得到约imately 150毫升配子体悬浮液）。
在微量离心管中放置一小部分经过磁铁纯化的培养物（约1 ml），并以2,000 × g离心1分钟。吸出上清，重悬在5颗粒μ升CCM的。使用此准备吉姆萨-染色涂片确认配子体的存在，并确定他们的舞台视觉。
漂洗，干燥，和列存储为小号TEP乙7B（VIII）。

男女配子细胞的荧光激活细胞分选（FACS）（表1）
准备配子体样品小号的FACS。
重悬富含磁铁的配子细胞。在微量离心管（GFP单色对照）中放置一小份（〜1 ml ）。将其余的细胞转移到50 ml离心管中，在RT下以800 ×g离心10分钟。
丢弃上清液并将所有细胞重悬于3 ml的1×PBS中，其中含10 mM葡萄糖和10μg / ml Hoechst 33342。
在黑暗中于37°C孵育样品15分钟，然后在1 ml的1×PBS中洗涤两次，并在2,000× g的条件下旋转1分钟。最后一次洗涤后，将样品重悬以在3 ml的含有10 mM葡萄糖的1x PBS中分选。
准备用于FACS的单色控件
重悬无性3D7-gABCG2-GFP寄生虫的培养物，并将2×0.5 ml的4％血细胞比容细胞悬液转移到两个微量离心管中。
保留一小部分（〜1 ml）重悬浮的富含磁铁的配子细胞培养物。
将上述三个试管以2,000 ×g离心1分钟。弃去微量离心管的上清液。
要制备Hoechst单色对照，将等分的无性3D7-gABCG2-GFP寄生虫重悬于1 ml的含有10 mM葡萄糖和10 µg / ml Hoechst 33342的1x PBS中。在37°C下将样品孵育15分钟。深色，在2,000 × g中以1分钟旋转1分钟的1×PBS中洗涤两次。最后一次洗涤后，将对照重悬于1 ml的含有10 mM葡萄糖的1x PBS中。
重悬配子体等分试样并在1ml的1×PBS的含有10mM葡萄糖制备GFP单其它无性寄生虫等分颜色控制和未染色的对照，分别。

表1.用于FACS的单色控件和样本

门控策略和FACS
在FACS Diva中创建一个新实验。在流式细胞仪窗口中，选择以下途径：FSC A，H ，和W; SSC A，H ，和W; 太平洋蓝A（或用于记录Hoechst 33342的相应通道）和Alexa Fluor 488 A（或用于记录GFP的相应通道）。创建一个带有点图的工作表（图4 ），注意这些图仅显示父门中包含的事件。
加载并运行未染色的（仅Hoechst 33342 ）和仅GFP的对照s 。调整电压以使事件进入范围（图4 ）。根据您的实验条件调整单细胞门。赫司特仅控制应该含有未感染的红细胞没有染色，环级感染红血细胞具有低染色，和高度染色trophozoite-和裂殖体感染的红细胞。在Hoechst单色控件中，将配子细胞门的Hoechst强度设置为中等种群。GFP单色对照将包含具有两个GFP强度水平的细胞。设置雌性配子体细胞门的GFP强度，以匹配高GFP强度的细胞。雄性配子体细胞门应与未染色对照的GFP强度匹配。
加载并运行配子细胞样品。如果需要，调整选通策略。准备在37 °C下装有2 ml CCM的收集管，然后开始将雄性和雌性浇口中的细胞分选到各个收集管中（注11）。如果需要多个收集管（> 10 ml），请将完整的收集管存放在37°C下。
检查的纯度的，通过使用相同的门控策略分析每个子集排序的样本。
由于配子细胞是在非常低的细胞密度下收集的，因此该方案的大多数应用都需要将最终离心力为1,800 × g，持续10分钟，以沉淀收集的配子细胞。该方案可产生每种性别2至1200万个配子细胞。

图4. ř具有代表性FACS工作表用于选择单个细胞的门控策略。（A）和分类配子体（B和C）。通过Hoechst 33342和GFP染色鉴定的雄性（蓝门）和雌性（红门）配子细胞的点图（B）和轮廓图（C）。

笔记

所有步骤均应使用标准的无菌技术，适当的生物危害遏制程序以及适用于恶性疟原虫活体寄生虫的个人防护设备执行。
培养可以在盘子或烧瓶中进行。随着培养物体积的增加，建议使用培养瓶以便于处理。
力争每天大约在同一时间（20-24小时内）进行培养，以保持营养素的可用性相当稳定。
高寄生物血症通过限制可用营养素和/或代谢废物的积累而引起“压力”。这充当配子体定型的信号。
作为无性寄生虫和配子体在红血细胞成熟和消化主机血红蛋白，自由下摆ë转化为顺磁性疟原虫色素晶体。结果，成熟的无性寄生虫和配子细胞保留在放置在磁场中的柱子中，而环状阶段的寄生虫和未感染的红血球则通过该柱子。
针规的大小可以通过所需的流速来选择。色谱柱制造商建议使用22G针，流速为3 ml / min。
仅可将色谱柱重复用于同一细胞系，以防止任何潜在的污染。该色谱柱最多可重复使用5次用于大规模培养（1,200 ml ），或者直到磁富集失去效力为止。
加入的GlcNAc到的以50mM防止寄生虫侵入红细胞和罐培养基，因此，可用于防止无性寄生虫增殖（Fivelman等人，2007）。这个步骤去除了文化中仍然存在的所有成熟的无性恋阶段。配子体细胞不会受到影响，因为它们对5％D-山梨糖醇溶液不敏感。
还可以通过减少承诺后配子细胞在培养中的天数来收获较早发育阶段的较年轻配子细胞。
注意将细胞保持在37°C，因为温度下降会激活成熟的配子细胞，导致配子形成。将所有溶液预热至37°C，并在37°C下进行分选以保持最佳条件。使用载玻片加热装置将烧瓶放在生物安全柜中，并在可能的情况下将其加热到37 °C的离心机。
瞄准少于20,000个事件/秒。如果浓度太高，则用PBS稀释。

菜谱

1×PBS
溶解9.1克的氯化钠，0.144克的KH 2 PO 4 ，和0.42克的的Na 2 HPO 4在800毫升的MilliQ水
用HCl调节pH值至7.4，并用水补足至1 L
高压灭菌
存放在RT
45％D-（+）-葡萄糖（w / v）
将45 g D-（+）-葡萄糖溶解在50 ml温暖的Milli - Q水中，加满100 ml
使用0.22 µm过滤器灭菌
在-20 °C下储存2 ml等分试样
1 M氢氧化钠
将4 g NaOH溶解在80 ml Milli - Q水中，加满100 ml
使用0.22 µm过滤器灭菌
存放在RT
200 mM次黄嘌呤
将2.72克次黄嘌呤溶于80毫升1M氢氧化钠中，加至100毫升
使用0.22 µm过滤器灭菌
在-20°C下储存1.2 ml等分试样
不完整的培养基
甲DD2毫升45％d的- （+） -葡萄糖（W / V），1.2毫升的200mM次黄嘌呤，和1ml 10mg / ml的庆大霉素吨ö500毫升RPMI 1640培养基中，GlutaMAXTM补编，HEPES。
储存在4°C
5％的AlbuMAX II（w / v）
将25 g AlbuMAXTM II高脂BSA溶于500 ml RPMI 1640培养基，GlutaMAX TM Supplement，HEPES中，同时在37°C摇动
使用0.22 µm过滤器灭菌，并在-20°C下储存37.5 ml等分试样
热灭活的人血清
在无菌条件下收集至少五名供体的血清，并在水浴中将其加热至56°C，同时不时摇动以均匀分布热量
保持血清在56°C至少1小时
让其冷却至RT 。在-20°C下储存12.5 ml等分试样
完整的培养基
甲DD37.5毫升5％Albumax II和12.5 ml热的-灭活人血清吨○瓶不完全培养基。
储存在4°C
5％D-山梨糖醇（w / v）
将50克D-山梨糖醇溶解在800毫升Milli - Q水中，加满1升水
使用0.22 µm过滤器灭菌
储存在4°C
完整培养基，添加50 mM GlcNAc
将6.1 g GlcNAc粉末溶解在500 ml不完全培养基中
消毒使用0.22微米的过滤器，再加入37.5毫升5％Albumax II和12.5毫升热-灭活的人血清
储存在4°C
10毫克/毫升赫斯特33342
将100毫克Hoechst 33342溶于10毫升Milli - Q水中
使用0.22 µm过滤器灭菌
在-20°C下储存100 µl等分试样
1 ×含10 mM葡萄糖的PBS
甲DD2毫升45％d的- （+） -葡萄糖（W / V）吨Ö500毫升的1×PBS 。
储存在4°C
含10 mM葡萄糖的1×PBS中的10 µg / ml Hoechst 33342
加入5微升的10毫克/毫升的Hoechst 33342至4995微升1×PBS与10mM葡萄糖在使用前立即。

致谢

作者要感谢来自博士的协助Harpeet沃赫拉和迈克尔先生Devoy用流式细胞仪及从PHUONG陈医生，谁产生的gABCG2-GFP的细胞系。我们感谢澳大利亚红十字会提供人类红细胞和血清。资金由澳大利亚研究理事会（DP180103212）提供。MCR得到了澳大利亚政府研究培训计划奖学金和澳大利亚国立大学的支持。该协议基于Ridgway等人最初描述的方法。（2020年）。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。

伦理

人类红细胞和血清的使用已得到澳大利亚国立大学人类伦理委员会的批准，规程为HEC＃2017/351。

参考

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