材料和试剂

细菌菌株
1.大肠杆菌OP50

2.从Ahringer或Vidal RNAi文库中获得的大肠杆菌HT115（具有RNAi功能）（Kamath等人，2003； Rual等人，2004）

蠕虫毒株
1. N2布里斯托尔（野生型）

2. WY703（fdIs2 { 3XESRE :: GFP; pFF4 [ rol-6 （su1006 ）]}）（Kuzmanov et al。，2014）

3. SLR115 { dvIs67 [ Ptbb-6 :: GFP + PMYO-3 :: DsRed的]}（蒙卡奇等人，2016）

4. NVK93（houIs002 { pJY323 [ P hsp-16.1 :: GFP]; pRF4 [ rol-6 （gf ）]}）（Kuzmanov等，2014）

5. WY756（fdEx139 { pJY312 [ P hsp-16.1（dd）:: GFP]; pRF4 }）（Kuzmanov等，2014）

试剂（在商店- [R oom的TEM perature ）
1. LB汤米勒（Luria- Bertani汤）（USBiological Life Science，目录号：L1520）

2.琼脂（USBiological Life Science，目录号：A0930）

3. NaCl （USBiological Life Science，目录号：S5000）

4.蛋白胨（USBiolog iCal的生命科学，目录号：P3300 ）

5. CaCl 2 （西格玛，目录号：C1016-500G ）

6. MgSO 4 （Fisher Scientific，目录号：M63-500）

7.胆固醇（西格玛，目录号：C8667-5G）

8. KH 2 PO 4 （ACROS Organics，目录号：7778-77-0）

9. K 2 HPO 4 （USBiological Life Science，目录号：P5100）

10. 5％小号裂果ħ ypochlorite小号olution （Ricca的，目录号：7495.5-32 ）

11.氢氧化钠（NaOH）颗粒（VWR ，目录号：97064-476 ）

12. N-乙酰半胱氨酸（ACROS Organics ，目录号：AC160280250 ）

ř eagent小号（在商店-20 ℃下）
1.羧苄青霉素（Fisher Scientific ，目录号：50-213-247 ）

2.四环素（西格玛（Sigma），目录号：87128 ）

3. IPTG （GoldBio ，目录号：I2481C50 ）

4.鱼藤酮（Sigma ，产品目录号：R8875 ）

缓冲区和媒体（另请参阅食谱）
1.线虫克rowth米EDIA（NGM）板

2.蜗轮b浸出小号olution

3. S B asal

4.磷酸盐b uffer

其他材质
细胞培养微板中，96 -孔，半区域，黑色（格雷纳生物一个，目录号：675090 ）
微孔板，96 -孔，非处理的聚苯乙烯（Fisher Scientific公司，目录号：07-000-124 ）
15 ml锥形无菌聚丙烯离心管（Fisher Scientific，目录号：12-565-268 ）
50 ml锥形无菌聚丙烯离心管（Fisher Scientific，目录号：12-565-270 ）
0.6 m l微量离心管（Fisher Scientific，目录号：05-408-120 ）
1.5米升微量离心管（Fisher Scientific公司，目录号：05-408-129 ）
2.0米升微量离心管（Fisher Scientific公司，目录号：05-408-138 ）
培养皿，聚苯乙烯，排气，60 × 15毫米（Fisher Scientific，目录号：07-000-339 ）
培养皿，聚苯乙烯，通风的，94 × 16 mm （Fisher Scientific，目录号：07-000-323 ）
移液器吸头，200 µl （VWR，目录号：89140-886 ）
移液管尖端，1 ，000μ升（VWR，目录号：89140-918 ）
移液器吸头，10 µl （VWR，目录号：89425-650 ）
血清移液管，10米升（Thermo Scientific的，目录号：170356 ）
血清移液管，25米升（Thermo Scientific的，目录号：170357 ）

设备

1. COPAS FlowPilot BioSorter （Union Biometrica ）

2.大颗粒（LP）采样器（Union Biometrica ）

3. Cytation5细胞成像多模式阅读器（BioTek ）

4. EL406洗衣机分配器（BioTek ）

5.管旋转器/旋转器（Fisher Scientific，目录号：11-676-341 ）

6.离心机，Megafuge TM 8小型台式机（Thermo Scientific，目录号：75007210 ）

软件

可以从Union Biometrica （https://www.unionbio.com/copas/software.aspx）购买设备来获得用于COPAS FP BioSorter仪器的FlowPilot软件。
通过从BioTek购买设备即可获得适用于Cytation5细胞成像多模式阅读器的Gen5软件（版本3.0）（https://www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-software-features-for -成像显微镜/概述/）
Microsoft Excel用于COPAS FlowPilot BioSorter输出分析
R（https://cran.r-project.org/）和RStudio（https://rstudio.com/products/rstudio/）用于数据可视化和统计分析

程序

秀丽隐杆线虫的维护
1.使用次氯酸盐方法从妊娠雌雄同体中分离卵子，方法如下：

用15 ml的S Basal从2-4个10 cm NGM板中洗涤妊娠雌雄同体。
倒S中基础蠕虫到15微米升锥形管中。
将试管以1,000 × g离心30 s。
吸出上清液，留下蠕虫沉淀（体积：〜0.1-0.5 ml ）。
添加3.5米升蠕虫漂白剂溶液（见食谱）的，剧烈振荡，并等待一分钟。
将试管以1,000 × g离心30 s。
通过将上清液从试管中倒出或使用吸气器将其除去。
添加3.5米升蠕虫漂白剂溶液（见食谱）的和剧烈震荡。
通过解剖显微镜监测蠕虫角质层的裂解。定期剧烈摇晃。大多数蠕虫会在四到五分钟内溶解，留下受蛋壳保护的卵。不要将蠕虫漂白超过7分钟，因为卵会开始死亡。
将试管以1,000 × g离心30 s，除去上清液。
洗涤蛋15米升号第基底三次以除去漂白的所有痕迹。
添加5-6米升小号基底的管中。
将试管在室温下旋转16-24小时，以使卵孵化以获得同步的L1种群。
2.按照以下步骤计算步骤A 1中试管中蠕虫的浓度：

将80 µ L的S Basal放入0.6 ml的微量离心管中。
轻轻摇动步骤A 1中装有L1幼虫的试管，取20 µl这些L1幼虫，将其加入0.6 ml的微量离心管中（稀释5倍）。
上下移液几次，以使蠕虫平均分散在S Basal中。
从微量离心管中取出10 µl ，将其以线形点在空白的NGM板上。
计算在三条不同的线中的L1幼虫的数量，并对获得的数量进行平均。
将平均数除以2得到原始管中每微升的蠕虫数（或除以10并乘以5以补偿稀释）。
要计算播种所需的蠕虫数量，将所需的蠕虫数量除以每微升的蠕虫数量。例如，要从每微升含30个蠕虫的试管中转移6,000个L1幼虫，请使用200μl （6,000 / 30）的L1幼虫。
3.转移〜6000同步L1幼虫到2-4与接种10厘米NGM板大肠杆菌OP50。

4.将蠕虫在20°C下生长72小时，以进行下一轮卵分离。如果与温度不育的蠕虫一起使用，请改为在15 °C下孵育约120 h。

NGM-OP50板的制备
在37°C的摇床培养箱中以225 rpm的转速搅拌，将LB肉汤中的大肠杆菌OP50生长16 h，直至饱和培养物。
在4°C下以3,260 × g离心细菌培养30分钟。
通过除去上清液并添加S Basal来浓缩细菌（每升培养物40 ml L S Basal，达到25倍浓度）。
将2 ml浓缩细菌接种到每个10 cm NGM平板上。使用前，让OP50草坪干燥。这些板可在4°C的密闭容器中存放数周。

表达RNAi的细菌的制备
1.生长的RNAi表达大肠杆菌在LB补充有12.5微克/米升四环素和25微克/米升羧苄青霉素用于在震荡培养箱中16小时，在37℃下用225rpm下搅拌。

2.在补充有25μg / ml羧苄青霉素的LB中以100倍稀释液进行传代培养，并在37°C的摇床中以225 rpm的搅拌摇动生长另外6 h。

3.在室温下以3,260 × g离心细菌培养20分钟。

4.通过除去上清液并添加S Basal来浓缩细菌（每升培养液加入40 ml l S Basal，达到25倍浓度）。

5.将细菌接种到补充有25μg / ml羧苄青霉素和1 mM IPTG的NGM平板上（每10 cm平板2 ml浓缩培养物，每6 cm平板0.5 ml浓缩培养物）。

6.对于双RNAi实验，请使用分光光度计测量每种培养物的光密度（OD 600 ）。稀释培养物，使培养物的最终混合物与种子相同，如步骤C 5中所述。

越来越多的秀丽隐杆线虫用于实验设置
1.使用大肠杆菌OP50

吸管〜6000个L1蠕虫到与接种10厘米NGM板大肠杆菌OP50。
将含有蠕虫的平板在20 °C的培养箱中培养46 h 。
2.使用表达RNAi的大肠杆菌

分别将大约2,000或6,000个L1蠕虫吸移到准备好的6 cm或10 cm RNAi板上。
在20°C下孵育平板4 6小时。
3.对于任何食品SOURSE

从NGM板中将同步幼虫蠕动，用S Basal清洗到15 ml锥形管中。
将离心管以1,000 × g的速度离心30 s。
去除液体和，增加14米升小号基础。
重复小号TEPS D2一和D2 b两次以除去过量的细菌。
去除液体，并添加1.8米升（如果6厘米板用）或5米升（如果10cm平板中使用）s基础实现〜1个蜗杆/密度μ升。
吸移管100 μ升蠕虫（〜100个蠕虫）到每个孔中的96孔板（半区，黑色，透明底）。
通过使用Cytation5（程序F ）进行图像蠕虫和/或使用LP Sampler和COPAS FP BioSorter （程序G ）测量荧光。

秀丽隐杆线虫暴露于线粒体抑制剂
1.洗净同步从NGM板L4 /年轻的成虫到15微米升与15米锥形管升小号基础的。

2.将试管以1,000 × g离心30 s。

3.除去液体，并添加5米升小号基础。

4.吸取100 µl蠕虫（约100个蠕虫）到96孔板的每个孔中（半面积，黑色，底部透明）。

5.吸液体，具有Ñ EL406洗衣机分配器（体积剩余的液体：〜40 μ升）。

6.添加60 μ升小号基底的补充OP50（最终OD：0.03）和目的化合物。

注意：在本研究中，我们使用的梳的萌发的0 ，25，37.5或50μM鱼藤酮（Sigma）和0，1，2，3，4，或5mM的N-乙酰半胱氨酸（NAC，Acros Organics公司）。

7.使用Cytation5（步骤F ）每两小时扫描一次图像蠕虫，持续20小时，和/或使用LP Sampler和COPAS FP BioSorter （步骤G ）测量荧光。

用自动显微镜成像（Cytation5）
1.按上述方法准备含有蠕虫的平板（步骤D和E ）。

2.运行Gen5软件。

3.设置动力学实验或在特定时间点拍照。对于同一实验的生物复制品，应使用相同的设置进行成像。

4.使用Gen5细胞分析管线分析图像：

选择一个图像。
单击“处理”，选择“图像预处理”。
对荧光图像应用图像预处理，单击“确定”。
在变换后的图像上，单击“处理”，选择“数字相位对比”，然后单击“确定”。
在数字相位对比和变换后的图像上，单击“分析”。
在“分析”面板上选择“细胞分析”。
单击“编辑选项”，然后调整值（阈值，背景，最小和最大对象大小等），以进行优化。
单击“应用”，然后单击“应用更改”。
5.将值导出到Microsoft Excel以进行下游处理。

使用流量测温仪进行荧光测量（COPAS FP BioSorter和LP采样器）
1.用于COPAS FP BioSorter的操作

如上所述准备含蠕虫的平板（步骤D和E ）
将蠕虫洗入50 ml锥形管中（从RNAi板或用化合物处理）。
让蠕虫沉降到通过重力，吸液管的底部，并加入50米升小号基础。
一旦蠕虫是再沉降，吸液并加入5米升小号基底为每5000个蠕虫（目标1个蠕虫的每一个最终浓度μ升）。
继续使用COPAS FP BioSorter机进行荧光测量。对于同一实验的生物复制品，应在相同的设置下进行测量。
分析从COPAS FP BioSorter获得的数据。
2.用于LP采样器和COPAS FP BioSorter

制备含蠕虫的平板如所描述的AB OVE（步骤d和E ）。
在适当的时间点，使用EL406机器清洗96孔板3次，以除去所有残留的药物或染料。允许蠕虫在两次洗涤之间通过重力沉降。
继续使用LP采样器和C OPAS FP BioSorter机器进行荧光测量。在同一实验中，应使用相同的设置进行测量。
分析从COPAS FP BioSorter获得的数据。
3.分析来自COPAS FP BioSorter的输出数据

在Microsoft Excel，R或其他统计软件包中打开输出文件（定界的.txt）。
基于“在区域内”列的过滤数据，“ 0”指示在感兴趣区域之外检测到的样本，“ 1”指示在感兴趣区域内的样本。
用TOF归一化荧光值（“绿色”，“黄色”或“红色”）。
使用归一化值执行相关的统计测试。

数据一nalysis

代表性的结果
基于上述协议，我们通常对中等通量，高含量的检测方法进行自动荧光定量，以确定几种报告基因菌株的表达水平。我们比较了上述用于荧光测量的两个管道（流动测温和自动图像分析）。流量测温法是一种非常灵敏的荧光检测方法，可以快速测量种群中的各个表型。值得注意的是，表现出理想表型的蠕虫也可以从普通人群中选择出来，并进行回收以进一步使用，就像荧光激活细胞分选一样。

Ť感兴趣他区域首先是由单独含有蠕虫比较样品，单独的化合物，和这两者的组合来确定。飞行时间（ToF ）和消光（光密度）值用于将蠕虫与其他颗粒分开，例如随着时间的推移趋于聚集的不溶性化合物（图1A）。两种固态激光同时激发荧光团，并使用带通滤光片测定荧光值（图1B）。该系统使用户能够准确有效地确定种群中大量样品的荧光。这具有许多应用，包括突变体筛选，药物发现和基础科学研究。此外，可以通过将FP平台与自动采样器和简单的软件脚本耦合来执行不同蠕虫种群的表型测量，该脚本可以从96孔（或其他格式）平板而不是50 mL锥形管中采样蠕虫。系统将测量的参数存储在制表符分隔的文件中[例如，“源孔”，“区域内”，“ TOF”，“消光”和荧光值：“绿色”，“黄色”和“红色”（图1C ）] ，可以通过许多下游软件包进行访问和分析，包括标准的办公效率套件或更多自定义生成的脚本语言。

图1.流量vermimetr ý （与COPAS FP BioSorter ）荧光测定方法。所述FlowPilot软件显示由（A），用于样品检测和选择，包括感兴趣（R1）和（B）可定制的输出曲线可定制的区域可定制的情节。（C）在Microsoft Excel中打开的FlowPilot输出示例。

流动测温仪可为大种群中的每个蠕虫提供测量，而Cytation5允许在整个种群的明场和荧光通道中成像（图2A）。显示了来自用不同线粒体应激源处理过的荧光报告基因菌株的蠕虫的代表性图像（图2A）。通过执行几个关键步骤（基于Kirienko等人的管道，2013年），我们优化了荧光定量管道以区分蠕虫与背景图像中的蠕虫（图2B）。首先，将荧光图像背景弄平以提高信噪比。其次，将明场图像转换为数字相位对比版本，以最大程度地减少不均匀照明并改善对比度，从而优化蠕虫检测。最后，通过指定几个适合蠕虫的参数进行细胞分析：目标检测的阈值，最小和最大目标尺寸以及用于增强目标识别的平滑算法。该管道可以有效地识别蠕虫并丢弃背景颗粒，包括不溶性化合物（图2C）。然后单击计算荧光值并将其导出到文件中（图2D）。

图2.使用Cytation5和Gen5软件（BioTek ）进行图像采集和荧光定量的管线。（A）在对96孔板成像后获得的原始图像，包括对线粒体靶向药物有反应的秀丽隐杆线虫报道菌株的代表性荧光图像。（B）用于从原始图像进行荧光定量的管道。（C）量化流水线之前（左侧）和之后（右侧）的蠕虫识别示例。（D）导出到Microsoft Excel后，通过管道分析获得的荧光值的示例。

为评估这两种产生可靠荧光值的方法的一致性，我们诱导了秀丽隐杆线虫报道株中的转基因表达，该株带有三个串联重复的乙醇和应激反应元件（ESRE），作为驱动GFP表达的最小启动子构建体（3XESRE :: GFP ）（Kirienko和Fay，2010年）。该菌株暴露于鱼藤酮（线粒体电子传输链的复合物I的抑制剂）和N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC，一种典型的抗氧化剂和活性氧清除剂）。个是组合有效地激活ESRE网络，其参与在检测还原应力的表达（Tjahjono等人，2020）。鱼藤酮和NAC的浓度s变化以产生报告基因表达的梯度。然后将蠕虫分为两个种群，一个种群用流量测温仪测量，另一个种群用Cytation5成像。将来自Cytation5机器的标准化表达值（x轴）与通过流量测度法（y轴）获得的值进行比较。获得的荧光值高度相关（图3）。

图3.从流动测温仪和Cytation5获得的荧光值高度相关。˚F的luorescence的报告菌株携带3XESRE :: GFP用流vermimetry测量（Ý -轴），并用Cytation5（成像X与鱼藤酮的梯度（0，25，37.5，和50μM）处理后轴）和NAC（0、1、2、3、4和5 mM）。

此外，我们评估了这些方法量化强荧光信号和弱荧光信号的能力。此前，我们和其他人发现，第转录因子ATFS-1在一个电子损失Ñ SPG-7（RNAi）的突变体的分子伴侣的激活表达HSP-16.1 （Pellegrino的等人，2014;蒙卡奇等人，2016; Tjahjono等人，2020年）。hsp-16.1的表达需要在基因的启动子区域中存在一对ESRE基序。在此基础上，我们在暴露于空载体（EV ），atfs-1（RNAi）时，测量了Phsp-16.1 :: GFP和Phsp-16.1（dd）:: GFP（后者缺少两个ESRE基序）的GFP信号。，spg-7（RNAi）或spg-7（RNAi）；atfs-1（RNAi）。˚F低vermimetry是能够识别一个更宽范围的荧光强度的但具有稍高的变异性（图4A）。因此，需要注意确保执行重复并保持条件尽可能一致。

最后，从任何基于荧光的工具的检测器和光学设置（Haid er et al。，2016）以及实验和样本的个体间变异性引入变异（导致噪声）。因此，我们测试了不同的样本大小是否会显着改变荧光输出。我们测量了在大肠杆菌上饲养的Ptbb-6 :: GFP报告蠕虫的荧光表达，该蠕虫表达空载体（EV ），atfs-1（RNAi），spg-7（RNAi）或spg-7（RNAi）；atfs-1（RNAi）通过流动测温法。有趣的是，无论表达水平是低还是高，测量低至200个蠕虫的样本量所产生的荧光值都非常类似于使用2000个蠕虫的测量值（图4B）。

图4.流动测色法检测到更宽范围的荧光信号。的荧光（A）PHSP-16.1 :: GFP和PHSP-16.1（DD）:: GFP，或（B）Ptbb-6 :: GFP蠕虫记者菌株饲养在大肠杆菌表达空载体（EV ），atfs- 1（RNAi），spg-7（RNAi）或spg-7（RNAi）；atfs-1（RNAi）用（A）流动测色仪测量，并用Cytation5成像，或（B）单独用流动测温仪成像。ToF （飞行时间）对应于蠕虫的长度。（A）中至少使用了400个蠕虫/复制品。样品大小在（B）中变化。

使用这些工具进行自动化和高含量的荧光定量分析对于提高实验室生产率非常有用。两种方法都可以有效地测量转基因报告基因或荧光染料对多种生物标志物的激活。流式测温提供单个表型的记录，可以获取有关人群反应的数据，可以筛选出罕见的结果，并且是获得精确目标亚群以进行进一步分析的有效而强大的方法。它也可以抵抗在拥挤过程中出现的定量问题，这对于基于显微镜的技术可能是有问题的。另一方面，Cytation5使用可靠的管线进行荧光定量分析，从而提供出版质量的图像。后一种技术也适用于重复成像和分析，从而可以在暴露于化学物质，病原体甚至发育事件的过程中进行长期实验。尽管这些仪器有一定程度的重叠，但是它们的组合允许对感兴趣的生物事件进行复杂而细微的研究。

数据可视化和统计分析
使用R包ggpubr （版本0.4.0）计算并生成了图3中的相关系数，p值和图。图4A和4B是使用R包ggplot2（版本3.3.0）生成的。至少分析了三个生物学重复，每个重复由约400个蠕虫组成（图3和图4A）。样品大小在图4B的图中表示。

笔记

1.在分析流量测温数据时，请不要忘记从“ In Regions”字段中过滤出区域“ 0”。这是确保被分析的信号来自蠕虫而不是碎片的必要条件。

2.在用Cytation5进行成像之前，请确保每个通道都对准焦点。这可以通过执行自动聚焦检查并注意聚焦位置来完成。如有必要，可以在通道之间使用较小的偏移量。

菜谱

1.线虫生长培养基（NGM）（1升）

18克琼脂

3克氯化钠

2.5克蛋白ept

d溶解情况975米升的中号ILLI-Q水

通过高压灭菌和等待消毒直到介质加入之前冷却至〜60℃：1米升的CaCl 2 （1 M），1米升硫酸镁的4 （1 M），1米升胆固醇的（5毫克/米升），25米升的磷酸盐缓冲液

倒入培养皿

储存在4°C直至可以使用

2.蠕虫漂白液（100毫升）

10 ml的5 M NaOH溶液

20 ml的5％次氯酸钠溶液

70米升无菌的中号ILLI-Q水

存放在室温下。保持不超过一周

3. S基础（1 L）

5.85克氯化钠

1克K 2 HPO 4

6克KH 2 PO 4

D溶于1升M illi-Q水中

高压灭菌

室温保存

4.磷酸盐缓冲液（1升）

132米升的K 2 HPO 4 （1中号）

868米升KH的2 PO 4 （1 M）

室温保存

致谢

CPK癌症研究学者NVK感谢得克萨斯州癌症预防和研究所（CPRIT）的慷慨支持，CPRIT赠款RR150044。该研究也由R35GM129294（NIH NIGMS）和约翰·邓恩基金会（John S. Dunn Foundation Award）资助。资助者在研究设计，数据收集或分析，决定出版或准备手稿方面没有任何作用。使用的秀丽隐杆线虫菌株由David Fay提供或从秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）获得。CGC获得了NIH P40 OD010440奖的支持。所描述的技术先前已在Kirienko实验室中使用，但是此手稿中提供的数据之前尚未发表过。

利益争夺

作者宣称不存在任何竞争利益。

参考

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