部分一，本机-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）

材料和试剂

THP-1细胞（ATCC ，目录号：TIB-202）
RPMI-1640米edium（GIBCO，目录号：11875093）
胎b绵羊小号erum（GIBCO，目录号：16000044）
青霉素小号treptomycin（由Life Technologies公司GIBCO，目录号：15140122）
IRF5细胞穿透肽（IRF5-CPP）和FITC-IRF5-CPP抑制剂（Hoffman-LaRoche，专利号WO2014001229A2）
Resiquimod （R848）（Millipore Sigma，目录号：SML0196）
脱氧胆酸钠（DOC）（Thermo Fisher，目录号：89904）
DC p rotein一个SSAY（Bio-Rad公司，目录号：5000111）
BCA p rotein一个SSAY（赛默飞世，目录号：23227）
抗IRF3，兔单克隆抗体（Abcam，目录号：ab76409）
抗IRF5（Cell Signaling Tech，目录号：3257，兔多克隆抗体或目录号：13496，兔单克隆抗体）
抗IRF7，兔多克隆抗体（Cell Signaling Tech，目录号：4920）
辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗- β肌动蛋白，兔单克隆抗体（Cell Signaling技术，目录号：5125）
抗兔IgG HRP共轭二抗（Cell Signaling Tech，目录号：7074）
NP40 Ç ELL升ysis b uffer（Invitrogen公司，目录号：FNN0021）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Millipore Sigma，目录号：10837091001）
蛋白酶我nhibitor器（Millipore西格玛，目录号：P-2714）
天然克EL ř unning b uffer，三-克甜菜碱b uffer 10 × Ç oncentrate，pH值8.3（Millipore公司Sigma公司，目录号：T4904-1L）
甘油（Millipore Sigma，目录号：G9012）
的Immobilon -P 0.45微米PVDF膜（Millipore，目录号：IPVH00010）
牛小号erum一个lbumin（BSA）（Sigma公司的Millipore目录号：05470-5G）
Nonfat- d RIED米之流b绵羊（Millipore公司Sigma公司，目录号：M7409-1BTL）
溴酚蓝（Millipore Sigma，目录号：B5525）
30％一crylamide /双小号olution，37.5：1，将500ml（Bio-Rad公司，目录号：161-0158）
解决克EL b uffer，1.5M的Tris-HCl，pH值8.8，1 L（Bio-Rad公司，目录号：161-0798）
堆叠克EL b uffer，0.5的1M Tris-HCL，pH为6.8，1 L（Bio-Rad公司，目录号：161-0799）
SDS小号olution，10％（W / V）加入250ml（Bio-Rad公司，目录号：161-0416）
皮尔斯20 × TBS吐温20 b uffer（TBST）（赛默飞世，目录号：28360）
西方b右ECL HRP小号ubstrate（Advansta ，目录号：K-12045-C20）
精度p的LU p rotein小号TANDARD（Bio-Rad公司，目录号：161-0374），其中高分子量条带可以在天然凝胶来检测

设备

ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad，目录号：17001402 ）
Mini- Transblot电池和PowerPac基本电源（Bio-Rad，目录号：1703989）
用于迷你预制凝胶的Mini-Protean Tetra垂直电泳池（Bio-Rad，目录号：1658005）

程序

图1概述设计天然-PAGE法对d etecting Ë ndogenous IRF5同型二聚体

R848诱导的IRF5同源二聚化和THP-1中IRF5-CPP抑制IRF5同源二聚化
将THP-1细胞（6 × 10 6 / ml）置于6孔板的完全RPMI-1640培养基中，并在培养箱（37°C，5％CO 2 ）中放置24小时。
在完全RPMI-1640培养基中制备1和10 µM的IRF5-CPP以及1 µM的R848。将THP-1细胞与最终浓度的IRF5-CPP一起或不与之孵育30分钟。因此，添加1 µM R848，并在37°C，5％CO 2下孵育1小时。
转移的细胞和含有6媒体× 10 6 THP-1细胞到一个5毫升或15米升管。
在400 × g ，4°C下将样品离心5分钟。吸出上清液而不干扰细胞沉淀。
用5 ml PBS洗涤细胞，并在400 × g ，4°C下离心5分钟。吸出PBS而不干扰细胞沉淀。

细胞裂解和蛋白质浓度测量
通过加入制备细胞裂解缓冲液1mM的PMSF和500 μ升10 ×蛋白酶抑制剂混合物至5μm升NP40裂解缓冲液在使用前立即。（NP40裂解缓冲液，从所述指令制造商：http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/FNN0021_Rev%200908.pdf）
在冰上在NP40细胞裂解缓冲液中裂解细胞沉淀30分钟，然后每10分钟涡旋一次。加入500 μ升NP40的细胞裂解缓冲液的细胞沉淀。（细胞裂解缓冲液的量取决于细胞数量和靶蛋白的表达。）
转移提取物离心管并离心在8 ，000 ×克在4 10分钟℃。
分装澄清的裂解液以清洁微量离心管。这些样品已准备好进行BCA或DC蛋白测定。裂解液可在-80°C下保存。避免多次冻结/解冻。
按照试剂盒说明使用BCA或DC蛋白质测定法测量蛋白质浓度。将样品放在冰上以防止蛋白质变性。

8％非变性聚丙烯酰胺凝胶手CASTIN克
制作8％天然凝胶（按照Bio-Rad铸造说明，http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110106B.pdf）。

注：替换SDS与去离子蒸水。SD S是已知的使蛋白质变性的两亲性表面活性剂。除天然PAGE后的凝胶孵育外，请勿使用SDS。

天然PAGE和免疫印迹
将预先运行的本机运行缓冲液（25 mM Tris和192 mM甘氨酸，pH 8.3）放入冰箱，直至达到0°C温度。倒入电泳室之前，请确保没有冰晶。
预运行天然凝胶，在40 mA，0°C下，在阴极室中使用1％DOC的自然运行缓冲液，在阳极室中使用自然运行缓冲液30分钟。保持在冰上电泳单元和保持0℃的温度（图URE 2 ）。
通过将样品与天然样品缓冲液混合，准备用于天然凝胶电泳的样品。每个样品的最终蛋白质浓度为10 µg /孔。不要加热样品。
注：^ h进食会变性，这将导致IRF5二聚体分解蛋白质。

图URE 2 。本机页面设置的示意图

在阳极室和阴极室中添加新鲜的自然冷运行缓冲液（阴极中含1％DOC）。保持在冰上电泳单元和保持在温度0℃（图URE 2 ）。
装载梯子和样品（总蛋白浓度：每个样品每孔10 µg）。
在25 mA，0°C下电泳60分钟或直到您看到染料靠近底部为止。
在含有0.1％SDS的天然运行缓冲液中孵育凝胶30分钟。
注：d ilute 10％SDS在去离子蒸馏水水。添加0.1％SDS可以提高传输效率。

进行蛋白质在PVDF或硝酸纤维素膜上的转移。
预湿膜，然后将凝胶/膜三明治放入转移设备中。
将新鲜的转移缓冲液添加到水箱中。
在将水箱置于冰上的同时，在100 V下运行60-70分钟。
转移后，风干PVDF膜。
短暂地浸泡在100％甲醇中以润湿膜。
用蒸馏水洗涤膜3倍，以除去甲醇。
用5％脱脂牛奶-TBST或5％BSA-TBST溶液封闭膜1小时。
注意：在蒸馏水中稀释20 × TBST，制成1 × TBST。

洗膜3 ×用TBST。
在摇杆上于4 °C过夜用一抗（IRF5，IRF3或IRF7）探测膜。
洗膜3 ×用TBST。
在室温下在摇床上用HRP偶联的二抗探测膜1小时。
洗膜3 ×用TBST。
继续使用ChemiDoc Imaging System对蛋白质进行化学发光检测。

将得到的免疫印迹（图URE 3 ）表明，R848处理增加内源性IRF5二聚体（IRF5）2的形成和IRF5-CPP5和不IRF5-CPP2能够由R848抑制二聚化。显示了IRF5单体（IRF5）和β-肌动蛋白（上样对照）。

图URE 3 。本机页面。泳道1控制-未处理的THP-1，用1处理泳道2 μ中号R848，泳道3用1处理μ中号IRF5-CPP2和1 μ中号R848，泳道4用10处理μ中号IRF5-CPP2和1 μ中号R848 ，泳道5 1处理μ中号IRF5-CPP5和1 μ中号R848，和泳道6，用10处理μ中号IRF5-CPP5和1 μ中号R848。

菜谱

本机样本缓冲区
要制备10 ml的天然样品缓冲液，请混合15％甘油（v / v），1％DOC（w / v）和1.25 ml 0.5 M Tris-Cl，pH 6.8和0.1％溴酚蓝（w / v）和去离子蒸馏水。

本机运行缓冲区
要制成1 L的本机运行缓冲液，请混合100 ml的10 × Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3）和900 ml去离子蒸馏水。

传输缓冲区
要制成1 L的转移缓冲液，请添加100 ml的10 ×转移缓冲液，100 ml的甲醇和800 ml的去离子蒸馏水。

完整的RPMI-1640中
混合以下内容：一瓶500毫升RPMI-1640、10％FBS，1％青霉素-链霉素

部分II。细胞内荧光共振能量转移（FRET）

材料和试剂

康宁96孔黑色板（Fisher Scientific，目录号：07200627）
5毫升宏管小号（费舍尔科学，目录号：501537789）
THP-1细胞（ATCC ，目录号：TIB-202）
RPMI-1640中等（Gibco，目录号：11875093）
胎牛血清（Gibco，目录号：16000044）
青霉素-链霉素（Gibco by Life Technologies，目录号：15140122）
FITC-IRF5-CPP抑制剂（Hoffman-LaRoche，专利WO2014001229A2）
Resiquimod （R848）（Millipore Sigma，目录号：SML0196）
Foxp3固定/通透缓冲液（Invitrogen，目录号：00-5523-00）
牛小号ERU米一个lbumin（BSA）（Sigma公司的Millipore目录号：05470-5G）
透b uffer （Invitrogen公司，目录号：00-5523-00）
抗IRF5，兔单克隆抗体（Abcam，目录号：ab124792）
山羊抗兔四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）抗体（Abcam，目录号：ab6718）

设备

Biotek Synergy Neo2（Biotek ，型号：BTNEO2）或任何类似的读板器

程序

缓冲液和溶液制备
通过将1份Foxp3固定/透化浓缩液与3份含2％BSA的PBS混合来制备新鲜的Foxp3固定/透化工作液。对于3-5百万个细胞，每个样品需要1 ml的工作溶液。
通过将1份10 ×透化缓冲液与9份去离子蒸馏水混合，制备1 ×透化缓冲液工作溶液。每个样品需要1 ml工作溶液。

检测THP-1中内源性IRF5与FITC-IRF5-CPP抑制剂的相互作用
在完整的RPMI-1640培养基中，将2 × 10 5 -4 × 10 5 / ml THP-1细胞接种在96孔板中（每个条件/处理一式三份）并保存在培养箱中（37°C，5％CO 2 ）24小时。
在完整的RPMI-1640培养基中制备1和10 µM FITC-IRF5-CPP结合的抑制剂。吸出培养基，将含有或不含有FITC-IRF5-CPP的THP-1细胞在37°C，5％CO 2中孵育1小时。
注：ķ EEP样品保护避光。

将FITC-IRF5-CPP处理过的细胞转移到5 ml试管中。
在400 ×g ，4°C下离心5分钟。吸出上清液而不干扰细胞沉淀。
用3 ml PBS洗涤细胞，并在400 ×g ，4°C下离心5分钟。吸出PBS而不干扰细胞沉淀。
向每个试管和脉冲涡流中加入1 ml Foxp3固定/通透性工作溶液。
在室温下孵育30-60分钟，或在2-8°C下孵育18小时。
细胞应在18小时后沉淀在底部。小心吸出上清液。对于短暂的孵育（室温下30-60分钟），在400 ×g ，4°C下旋转5分钟。
向每个试管中加入1 ml的1 ×透化缓冲液，并在室温下孵育30分钟。
以400 ×g旋转5分钟。
将沉淀重悬于50 µl剩余体积的1 ×透化缓冲液中。
[可选]通过将5 µl直接加到每个试管中，用10％BSA封闭。在室温下孵育15分钟。
无需洗涤，添加推荐量的一抗（IRF5）抗体以检测细胞内抗原，并在室温下孵育至少30分钟。避光。
用3 ml PBS洗涤。
重复S teps B 9- B 12并添加推荐量的第二抗体（TRITC）（以结合抗IRF5抗体）。
以400 ×g旋转5分钟。吸出上清液，剩余30 µl残留量。
加入30 µl 4％PFA，重悬染色的细胞。避光。
将样品转移到96孔板中。读取之前，添加PBS的终体积为150-200 µl。
注意：确保每个孔中的细胞数相同。强烈建议对细胞进行计数。

在488 nm（E1）激发下在525 nm，540 nm（E2）激发后在600 nm和488激发后600 nm在Biotek Synergy Neo2（Bioteck ，VT，USA）或任何类似的读板器上测量细胞内荧光nm（E3）。
用3个光谱设置机器：

FITC 488激发525发射

TRITC 540激发600发射

FRET 488激发600发射

荧光的转移以FRET单位计算如下：FRET单位=（E 3 c - E 3无）-（[ E 3 TRITC - E 3无）×（E 2无/ E 2 TRITC ]）-（[ E 3 FITC - E 3无]×[ E 1均为/ E 1 TRITC ] ）。在未标记的细胞（E none ）或用FITC（E FITC ）和TRITC（E TRITC ）标记的细胞上测量了不同的荧光值（E ）。

将得到的柱状图（图URE 4 ）示出了内源性IRF5和FITC- IRF5-CPP2或FITC-IRF5-CPP5但不是FITC-IRF5-CPP8或-CPP9之间的FRET信号（单元）的增加。

图4 。IRF5-CPP与IRF5的结合。将THP-1细胞与FITC-IRF5-CPP2，FITC-IRF5-CPP5，FITC-IRF5-CPP8或FITC-IRF5-CPP9孵育1小时，然后透化并用抗IRF5和四甲基罗丹明染色细胞内IRF5异硫氰酸盐（TRITC）抗体。从荧光发射计算出FRET单位。

致谢

资金：这项工作得到了F. Hoffmann–La Roche的支持和资助，狼疮研究联盟（对BJB），国防部CDMRP狼疮研究计划W81XWH-18-1-0674（对BJB），NIH AR065959（对BJB），以及EMD Serono研究与发展研究所有限公司。

利益争夺

披露：JAD，S.-LT和DS是转让给F. Hoffmann-La Roche AG的专利申请US20160009772A1的发明人。公开记录已于2019年5月12日终止了申请状态。与公司有关的财务披露：GC，C.-CS，JQ，MD和JAD是EMD Serono Research and Development Institute Inc.的雇员。SH是BMS的雇员。FM是F. Hoffmann–La Roche申请的专利“细胞穿透肽和鉴定细胞穿透肽的方法”（WO2014001229A2）的作者。JAD，NF，AFH，K.-SH，FM，DS和S.-LT是Hoffmann–La Roche Inc.申请的专利“结合IRF5的细胞穿透肽”（US20160009772A1）的作者。

参考

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