材料和试剂

1.肝素钠一个nticoagu升通货膨胀管小号，加入5ml（江苏，宇立）

2.离心机吨ubes ，50毫升（康宁，目录号：430829 ）

3.离心吨ubes ，15毫升（康宁，目录号：430791 ）

4. 24孔廿四底部ED板中（Corning ，目录号：3524 ）

5. 96孔圆-底ED板（Corning公司，目录号： 3799 ）

6. MidiMACS小号eparator （Miltenyi公司，目录号：130-042-302 ）

7.大号小号Ç olumn （Miltenyi公司，目录号：130-042-401 ）

8.一次性针头注射器（中国双葛）

9. 70 -微米Ç ELL小号训练（Biologix ，目录号：15-1070 ）

10. NOG小鼠（北京生命河实验动物技术有限公司查尔斯河实验室）

11.聚蔗糖-泛影葡胺小号olution（浩阳Biologiacal ，TBD科学，目录号：LTS1077）

12. RPMI 1640，500毫升（Ť hermo ˚F isher ，GIBCO，目录号：C11875500BT）

13. FBS Q ualified甲ustralia ø rigin （赛默飞，GIBCO，目录号：10099141 C）

14.牛小号erum一个lbumin，BSA（思嘉，目录号：N0008-1）

15.磷酸盐- b uffered小号艾琳，P BS （Ť hermo ˚F isher ，GIBCO，目录号：C10010500BT）

16。 CD8 MicroBeads ，人类（Miltenyi ，目录号：130-045-201）

17.人CD28微珠（Miltenyi ，目录号：130-093-247）

18.人CD2微珠（Miltenyi ，目录号：130-091-114）

19.人CD4微珠（Miltenyi ，目录号：130-045-101）

20.我L-2 （P易宝Ť ECH ，目录号：AF-200-02-50 ）

21.我L-7 （P易宝Ť ECH ，目录号：AF-200-07-50 ）

22. IL-15（P易宝Ť ECH ，目录号：AF-200-15-50 ）

23. 10 × RBC升ysis b uffer （赛默飞，Invitrogen公司，目录号：00-4300-54）

24.台盼蓝溶液0.4％，液体（MERCK，Sigma- Aldrich，目录号：T8154-100ML）

25. 7-AAD生存力染色溶液（赛默飞，Invitrogen公司，目录号：00-6993-50）

26。 CFDA，SE （ThermoFisher ，Invitrogen，目录号：C1157）

27. ˚F低Ç ytometry一个ntibodies

的AlexaFluor TM 700的小鼠抗-人CD3米onoclonal一个ntibody ，OKT3（赛默飞，eBioscience公司，目录号：56-0037-42 ）
efluor 450的小鼠抗-人CD8A米onoclonal一个ntibody ，SK1 （赛默飞，eBioscience公司，目录号：48-0088-41）
APC-小鼠抗-人CD28米onoclonal一个ntibody ，CD28.2 （赛默飞，eBioscience公司，目录号：17-0289-42）
APC-小鼠抗-人CD4米onoclonal一个ntibody ，OKT4 （赛默飞，eBioscience公司，目录号：17-0048-42 ）
FITC鼠抗-人CD2米onoclonal一个ntibody ，RPA-2.10 （赛默飞，eBioscience公司，目录号：11-0029-42 ）
PE-小鼠抗-人CD45米onoclonal一个ntibody，HI30 （赛默飞，eBioscience公司，目录号：12-0459-42）
28.可定影v iability小号覃（FVS ）620 100 μ克（BD Pharmingen公司，目录号：564996）

29.氯化钠

30.氯化钾

31.钠2 HPO 4

32. KH 2 PO 4

33. EDTA

34. 1× PBS（pH 7.4 ）（请参阅食谱）

35. D-PBS （pH 7.4 ）（参见食谱）

36. 1％的BSA-PBS （请参阅食谱）

37. 0.5％BSA-PBS （请参阅食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810R ）
电子天平（Sartorius，型号：BP61）
中号icroelectronic天平（OHAUS ，型号：AX124ZH）
血细胞计数器
Ç onstant温度水箱
我ncubator （热，型号：热电3111）
F ACS LSRF ortessa （B D ）
Finnpipette （埃彭多夫）
电磁搅拌器（B G- stirrel DB ）
光学米icroscope （C ONIC，XDS-1B ）
清洁b恩奇

软件

˚F lowjo v X 。0.7
SPSS 20.0
摹raphP广告棱镜5.01

程序

外周血单核细胞（PBMC）分离
从健康志愿者的肝素化试管中采集的样品中分离PBMC。的PBMC通过使用密度梯度离心法分离的Ficoll-Hypaque上小号olution。

用相同体积的RPMI 1640稀释血样1：2 。
添加的体积的Ficoll-Hypaque上SOLU和灰等于那个的血液样品在一个50 -毫升Ç entrifuge吨UBE。
将稀释的血液样本小心缓慢地添加到分离液的表面。离心机在800 ×g下进行20 -在室温下30分钟。
注意：Ť他的血液样品体积决定了离心条件; 阅读分离解决方案说明s 。

Ç arefully吸收第二环形乳白色淋巴细胞层到另一个离心管中，加入10 - 20毫升RPMI 1640，拌匀，和离心的580细胞悬液×克10分钟在室温下。
甲spirate的完全上清液。洗涤吨他通过加入10ml RPMI 1640和离心机细胞沉淀荷兰国际集团，在290 ×g下10分钟在室温下。
ř EPEAT小号TEP A5。

MACS小号eparation
CD8 +细胞（A-CD8 + ）和CD4 +细胞（A-CD4 + ）从个人A的PBMC中分离出由正选择使用的MACS系统。APC小号是获得由耗尽的CD2 +细胞从PBMC小号的个体B（B-的APC）或个人I（I-APC小号）。根据各个实验的具体要求，根据供体的HLA-A，-B和-DR相容性或不相容性选择供体。小号个体everal组小号指定为A，B，和I，这是完全HLA-A，-B和-DR不匹配呈S从130名志愿者creened出来并用于独立的实验。

注：K EEP的细胞，并在缓冲区冷。Ç entrifug向在4 ℃。

加入10 ml的 0.5％BSA-PBS缓冲液以重悬浮的PBMC（从小号TEP A6），并判断该细胞数目。
将细胞悬液以300 ×g离心10分钟。完全吸出上清液。
ř esuspend的在80细胞沉淀微升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞。
加入20个微升每10个适当微珠7细胞。
中号IX井和在冰箱孵育20分钟（2 - 8 ℃下）。
W¯¯灰的细胞中加入1 - 2毫升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞和离心机在300 ×g下10分钟。完全吸出上清液。
重悬高达10个8细胞在500微升0.5％BSA-PBS缓冲液中。
注：对于较高的细胞数量，扩大了相应的缓冲空间。

P花边的LS Ç olumn在的磁场MidiMACS小号eparator。
注意：卓ö本身适当的MACS Ç olumn和MACS小号根据数eparator小号总和阳性细胞。有关详细信息，请参见Microbead说明。

P repare的通过用3ml 0.5％BSA-PBS缓冲液漂洗柱。
应用的细胞悬液到LS列。
Ç ollect的穿过和洗涤未标记的细胞的用3ml柱0.5％BSA-PBS缓冲液中。收集的总流出物; 这是未标记的CE LL馏分（如CD2 -细胞）。
W¯¯灰的柱通过添加3毫升0.5％BSA-PBS缓冲液洗涤两次。当色谱柱容器为空时，仅添加新鲜的0.5％BSA-PBS缓冲液。
ř EMOVE的从分离器和地点列在合适的收集管中。
P ipette 5毫升缓冲液上柱。通过将柱塞牢固地推入色谱柱，立即冲洗出磁性标记的细胞（例如CD8 +细胞，CD4 +细胞）。
执行˚F低cytometr ý分析来评估的纯度的分选的细胞悬浮液; 纯度应≥ 97％。

CD8 + CD28 - T细胞的体外扩增
A-CD8 +细胞一个通过使用MACS系统根据阳性选择分离重新程序B. B-的APCs（CD2 -细胞）从HLA-A，- B，- DR错配个体乙隔离通过CD2的耗尽+细胞中使用CD2微珠。

将以上获得的A- CD8 +细胞和B-APC于300 ×g离心10分钟。完全吸出上清液。
重悬在5ml RPMI1640和确定的细胞数。
以300 ×g离心A- CD8 +细胞和B-APC 10分钟。完全吸出上清液。
重悬的细胞培养物中的细胞MEDI微米（RPMI 1640补充有15％FBS）以实现A-CD 8 +在2× 10 6个细胞/ ml和B-的APCs以1 × 10 6细胞/毫升。
种子A-CD8 +细胞（2×10 6 /孔）和B-APC小号（1×10 6 /孔）ö n要24孔˚F LAT -底部ED板以2：1的比率在总体积的2毫升，在IL-2的存在下吨20U / ml时，IL-7在50纳克/毫升，和IL-15在50纳克/毫升，在37℃的培养箱中和加湿5.5％CO 2个气氛。
3天后更换半培养基（1毫升）。经过5天和7天共培养，拌匀，将一个好两成。
一天9，收获细胞成50 -毫升Ç entrifuge吨ubes。加入10 mL 0.5％BSA-PBS缓冲液洗涤所述细胞，并确定所述细胞数目。
离心机的在300细胞悬液×克10分钟在4℃下。完全吸出上清液。
重悬在40细胞沉淀微升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞。
添加10微升每10个CD28-PE 7细胞。
充分混合，然后在冰箱中（2 – 8 °C ）孵育10分钟。
洗的加入1细胞- 2毫升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞和离心机在300 ×g下10分钟在4℃下。完全吸出上清液。
重悬在80细胞沉淀微升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞。
添加20微升一个NTI-PE米每10个icrobeads 7细胞。
拌匀孵育一个附加1 5中的冷藏库分钟（2 - 8 ℃下）。
洗的加入1细胞- 2毫升0.5％BSA-PBS每10个缓冲7细胞和离心机荷兰国际集团，在300 ×g下10分钟在4℃下。完全吸出上清液。
重悬高达10个8细胞在500微升0.5％BSA-PBS缓冲液中。
注：对于较高的细胞数量，扩大了相应的缓冲空间。

将在LS ç olumn中的磁场MidiMACS小号eparator。
注意：卓ö本身适当的MACS Ç olumn和MACS小号根据数eparator小号总和阳性细胞。有关详细信息，请参阅米icrobead说明。

制备的通过用3ml 0.5％BSA-PBS缓冲液漂洗柱。
应用的细胞悬液列。
收集的穿过未标记的细胞和洗涤的用3ml 0.5％BSA-PBS缓冲液柱。收集的总流出物; 这是未标记的细胞级分（CD28 -细胞）。
执行˚F低cytometr ý分析来评估的纯度CD28 -细胞悬浮液; 纯度昭ü LD是≥ 9 5 ％。

体外抑制测定
通过使用CD4 m微珠进行阳性选择，从单个A的PBMC（A-CD4 + T细胞）中分离出响应者CD4 +细胞。作为刺激物，通过使用CD2微珠消耗CD2 +细胞，可以分离出来自个体B （B-APC）或来自HLA-A，-B，-DR完全错配的无关个体I（I-APC）的APC细胞。

离心机的A-CD4 +细胞悬浮液（从小号TEP 300 B14）×G进行10分钟，在4℃下。完全吸出上清液。
用10 ml PBS洗涤新鲜分离的C D4 +细胞，以去除所有蛋白质。在4°C下以400 ×g离心10分钟。
复查将细胞浸入1 ml PBS中。
甲DD CFSE工作稀释到一个0.5最终浓度μ中号在室温下。
我在恒温箱（37°C ）中保温7分钟；工作轻轻地和保护的光。
用dd 1 ml FBS和9 ml RPMI 1640终止反应，然后以300 ×g离心10分钟。完全吸出上清液。
w ^灰细胞再次与RPMI 1640吸出的上清液完全。
重悬于5 ml RPMI 1640中并计数细胞。
注：后升与CFSE abeling，进行流量cytometr Ÿ分析恩确保细胞被染色。

Ç entrifuge的A-CD8 + CD28 -细胞，B-APC小号，一个第二I-APC小号获得上述在300 ×g下进行10分钟。完全吸出上清液。
重悬在5ml RPMI 1640 和计数的对应的细胞。
离心机在A - CD 8个+ CD28 -细胞，B-的APC，I-的APC ，和甲-CD4 + CFSE在300 ×g下10分钟。完全吸出上清液。
重悬在培养基中MEDI细胞沉淀微米（RPMI 1640补充有15％FBS ）以实现A-CD4 + CFSE在1 ×10 6细胞/毫升，B-APC或I-的APCs在1×10 6个细胞/ ml，并甲- CD8 + CD28 -细胞在2.5×10 5细胞/ ml。
种子吨他A-CD4 + CFSE细胞（5×10 4 /孔），B- APC或I-的APCs（5×10 4 /孔），和CD8 + CD28 -细胞（2.5×10 4 /孔）ö n要96孔圆-底ED板在200的总体积微升细胞培养MEDI微米含15个％FBS。
注意：响应CD4 + T细胞，刺激的B-APC或I-的APC ，仅充当阳性对照（B-APC小号瓦特ERE用作引发细胞小号体外扩展的CD8 + CD28 -从单独的A T细胞，而I-APC小号从未有过免疫识别由CD8 + CD28 -从单个A的T细胞在体外EXPAN锡永时段）。

改变半培养基（1 00 μ升）后3天，5一天小号，并共培养9天。
经过7或11天共培养中，收获，染色，并检测CD4 +通过流式细胞术细胞CFSE稀释。

体内抑制测定
Isolat e是应答的CD4 + T细胞和的APCs（步骤A和B）。
将总量为4×10 6人CD4 + T细胞与相等数目的APCs ，要么B-APC或I-的APC，并用2×10结合6体外-扩增的人CD8 + CD28 - T细胞的共体积为1.5毫升的PBS。应答的CD4 +单独的T细胞和B-的APCs一个以相同的方式使用作为阳性对照重。
管理与c为每个组到NOG小鼠腹腔注射ELL混合物。
小号acrifice小鼠一天11注射后。
隔离的脾，并均化以产生一个单-细胞悬浮液。
离心机的500细胞悬液×克5分钟，在4 ℃下。完全吸出上清液。
添加3 ml的1 × RBC裂解缓冲液以裂解的红细胞，拌匀，以及我ncubate在室温下5分钟。
加入2 ml PBS，在室温下以350 ×g离心10分钟。完全吸出上清液。
染色细胞，并通过流式细胞仪检测表达CD4 +的细胞。
注：Y OU可也检测人类CD8 +和CD4 +细胞在米乌斯脾组织通过我mmunohistochemical技术小号。

染色细胞以通过流式细胞仪进行分析
流式细胞分析我S于收获的细胞进行从在不同条件下培养（步骤小号d和E）。

将要分析的细胞放入12 × 75 mm聚苯乙烯管中。
洗的细胞在3ml 1％BSA-PBS缓冲液中于350 ×g下10分钟，在4 ℃下。
丢弃上清液并迅速涡旋以使沉淀的细胞松动。
甲DD 2种微升抗体（诸如抗CD4），搅拌均匀，并温育30分钟，在4 ℃下在该暗。
洗的细胞3毫升1-％BSA-PBS缓冲液中，在350 ×g下10分钟，在4 ℃下。
丢弃上清液并迅速涡旋以使沉淀的细胞松动。
加入3μl7 -AAD活力染色溶液，并在黑暗中于室温下孵育10分钟。
重悬的细胞中的适当体积的1％BSA-PBS一个第二通过检测流cytometr ÿ 。

数据分析

d ATA分析被执行使用离线分析软件等为˚F lowjo 。如图2所示，CD4的识别+ T细胞与开始的创建栅极以淋巴细胞隔离弹出ù特征研（FSC-A; SSC-A），其次是严格双峰排斥（FSC-W与FSC-H以及SSC-W与SSC-A）。排除死亡染色呈阳性的细胞，然后进入目标细胞群。

图2 。门控策略，以确定CD4 +细胞中抑制试验。A. Ly的米认定phocyte人口在FSC-A与SSC-A地块。公元前。接下来是使用FSC和SSC面积和宽度图进行双重识别。D.用7-AAD染色后，然后分析活细胞。E.活CD4 + T细胞被门控。F.通过CFSE稀释测量CD4 + T细胞的增殖。

的抑制百分比我S理论值如下小号：％抑制= [1 - （％CD4 +在存在T细胞增殖的CD8 + CD28 - /（T细胞）％CD4 + T细胞增殖在缺乏CD8的+ CD28 - T细胞）] × 100。
统计分析我š进行使用SPSS软件版本22软件。对于不同组的比较，在适当情况下，一个独立样本吨-测试和非参数检验一个重新使用到determin Ë统计学意义。摹raphs一个重新科瑞版使用GraphPad Prism 5.01版软件。

菜谱

1 × PBS（pH 7.4 ）
氯化钠 8克

氯化钾0.2克

添加ü ltrapureħ 2 O操作一个总体积的1大号

D-PBS （pH 7.4 ）
氯化钠8克

氯化钾 0.2克

Na 2 HPO 4 1.15克

KH 2 PO 4 0.2克

添加ü ltrapureħ 2 O操作一个总体积的1升

1％BSA-PBS
牛血清白蛋白10克

氯化钠8克

氯化钾 0.2克

Na 2 HPO4 1.44克

KH 2 PO4 0.24克

添加ü ltrapureħ 2 O操作一个总体积的1升

0.5％牛血清白蛋白
EDTA 2毫米

牛血清白蛋白5克

氯化钠8克

氯化钾 0.2克

Na 2 HPO 4 1.44克

KH 2 PO 4 0.24克

添加ü ltrapureħ 2 O操作一个总体积的1升

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助。81270839，81428007]，并在自然科学广东省的基础[2017A030313524。此处概述的协议最初是在Yu实验室的几篇论文中进行描述的（Yu等人，2011; Feng等人，2018; Liu等人，2020）。

比较è Ť ING利益

该作者宣称没有竞争的利益，金融或者非金融。

伦理

所有使用人体细胞的实验均按照南方医科大学伦理审查委员会（中国广州）的建议进行；根据赫尔辛基宣言，所有受试者均签署了知情同意书。所有动物实验均已获得南方医科大学动物护理和使用委员会制定的动物护理和使用指南的批准。

参考

冯锋，刘玉。，刘庚。，朱平。，朱敏。，张虹。，陆新霞，刘洁。，罗新霞，于玉（。）。（F. ，Liu，Y. ，Liu，G. ，Zhu，P. ，Zhu，M. ，Zhang，H. ，Lu，X. ，Liu，J. ，Luo，X. and 2018）。在体外通过IL-15扩增的人CD8 + CD28 - T抑制细胞以同种特异性和程序性细胞死亡蛋白1依赖性方式抑制。免疫前线9：1442。
Liu，G.，Yu，Y.，Feng F.，Zhu，P. and Liu，Y.（2020年）。通过共同的γ链（gammac）细胞因子扩增的人CD8 + CD28 - T抑制细胞在体内保持稳定的同种异体抑制能力。BMC免疫21（1）：23。
Tang，XL，Smith，TR和Kumar，V。（2005）。通过调节性CD8 T细胞对免疫的特异性控制。细胞分子免疫学2（1）：11-19。
Long，AE，Tatum，M.，Mikacenic ，C.和Buckner，JH（2017）。一种新颖且快速的方法来量化Treg介导的CD4 T细胞抑制。免疫方法杂志449：15-22。
Yu，Y. ，Zitzner ，JR ，Houlihan，J. ，Herrera，N. ，Xu，L. ，Miller，J. ，Mathew，JM ，Tambur，AR和Luo，X.（2011）。常见的γ链细胞因子促进异源特异性人CD8 +抑制性T细胞在体外快速扩增。公共科学图书馆ONE 6（12）：e28948。