材料和试剂

Tygon管（Garinger ，项目编号：9MH86）
1毫升塑料注射器（固安捷，商品编号：19G334，热连接SH呃科学，目录号：NC0786233）
注射器针头（Air- Tite ，目录号：161028）
50 ml离心管（VWR，目录号：89039-658）
5 ml血清移液器（VWR，目录号：89130-896）
15 ml离心管（VWR，目录号：89039-666）
1.5 ml微量离心管Eppendorf（VWR，目录号：20901-421）
超清晰超速离心管（Beckman Coulter，目录号：344061）
杜恩斯组织研磨7毫升（全向我国际电信联盟，目录号：07-357542）
玻璃底盘（MatTek ，目录号：P35G-1.5-14-C ）
致命Plus解决方案（Drugs.com，p RODUCT号：VPL 9373，NDC号码：0298-9373-68）
蛋白酶抑制剂迷你片剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32955）
蔗糖（VWR，目录号：97063-788）
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP310-500）
冰
Milli-Q Water （Fisher Scientific，目录号：QGARD00D2）
1 × PBS缓冲液（VWR，目录号：97062-948）
HCl（VWR，目录号：470301-260）
NaOH（（VWR，目录号：BDH7225-4）
生物素-PEG-硅烷（Laysan Bio，项目号：生物素-PEG-SIL-3400-500mg）
中性蛋白（热网络SH呃科学，Ç atalog数：31000）
生物素化的抗GFP抗体（Rockland的抗体和测定法，我TEM号：600-406-215）
蔗糖缓冲液/均质缓冲液，pH 7.4 （请参见配方）
致命加工作解决方案（请参阅食谱）

设备

光滑的精细镊子（Electron Microscopy Sciences，1209 K43，货号：72911-6 ）
手术剪（Medline，目录号：MDS0838410）
手术剪（Stoelting ，目录号：52138-51）
平头镊子（Fisher Scientific，目录号：12-000-123）
冰桶（VWR，货号：10146-202）
成年小鼠脑切片矩阵（Zivic我nstruments，目录号：BSMAS002-1）
1 ml移液器（Gilson，目录号：F123602）
移液器控制器（VWR，目录号：613-4442）
高压釜（Steris的AMSCO鹰，š erial号096899 SAW）
灌注泵（固安捷，ç atalog Ñ棕土：2688）
离心机（Beckman Coulter公司，型号：Allergra ® X-22R;转子：Beckman Coulter公司，型号：SX4250）
超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：L-60）
摆斗式转子（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），型号：SW 28）
固定角转子（贝克曼库尔特（Beckman Coulter），型号70 Ti ）
肚皮舞者或轨道振动器（Fisher Scientific，目录号：15-453-211）
超声波仪（Amsco Reliance Sonic 550）
通风橱（Supreme Air LV，Kewaunee Scientific，VWR ，目录号：97006-002）或空气压缩系统
氧气等离子清洁器（Harrick等离子，目录号：PDC-32G）
涡流（VWR，货号：10153-836）
4 °C冰箱
-20 °C冷冻室
具有TIRF功能的显微镜（奥林巴斯，型号：IX2-ZDC2 ，序列号：0F83094）

软件

变形（在奥林巴斯显微镜上可用）
ImageJ / FIJI（可从NIH免费获得）

程序

以下过程涉及动物实验。所有动物实验均在美国国立卫生研究院（NIH）制定的指导原则下进行，并得到肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。在我们的案例中，始终使用α4-GFP敲入小鼠（2-4个月大），该小鼠的绿色荧光蛋白（GFP）在α4β2烟碱乙酰胆碱受体（nAChR ）的α4亚基中表达。α4-GFP敲入小鼠品系是从Jerry Stitzel博士实验室（科罗拉多州行为遗传学研究所）获得的。这些小鼠表达绿色荧光蛋白CHRNA4融合蛋白替代内源烟碱受体亚基。

灌注和脑提取
准备所需的缓冲器（参照ř ecipe小号部分），用清水冲洗手术工具，干燥，并在高压灭菌循环2（循环重力）之前的动物灌注。
通过注入200执行人道的安乐死于鼠标微升致命加工作溶液（见ř ecipe 2 ）。等待直到动物不再无反应为止，方法是检查脚捏反射。通常，在注射致命性加号后2-3分钟，鼠标将变得无反应。
注意：静脉注射是最优选的方法，但是在不可行的情况下，可以使用其他注射方法，例如皮下注射。

一旦无反应，将鼠标保持腹侧朝上放在一块泡沫片上，并用胶带或金属销钉将其固定。用小剪刀和镊子捏一块皮肤，然后在下胸部做一个小切口。进行抛物线状，矢状切开，延伸至腹部各侧的长度。向后拉松动的纸巾。穿过胸膜横切，同时撕开横the膜。锚定新松动的组织，以确保其不会妨碍操作（Gage等，2012）。
注意：您将需要3-4只小鼠来准备区域特定的纳米囊泡。

将灌注泵设置为Level3。将tygon管从PBS缓冲液运至泵，然后运至1ml塑料注射器。将针头插入左心室（LV）。打开泵，用PBS灌注。立即在主动脉上切开切口。放血直到肝脏变成棕褐色并且血液几乎是半透明的。
注意：约0.72 ml / min的流速是好的。重要的是清除所有血液，并在灌注后使肝脏染成棕褐色，否则脑血管中仍可能存在一些血液，可能会干扰单分子成像。通常，100 ml PBS足以清除小鼠的血液。

对于脑部提取，请使用6英寸大剪刀通过头皮下垂来取下头部。找到脊柱并去除多余的颈椎。从大瓶孔（MF）的底部朝鼻子，从MF的侧面朝耳朵切大约4毫米。用常规镊子将松动的骨组织剥下。从头骨的底部一直到鼻子进行矢状切开，确保先将剪刀的钝边插入，然后在脑底拖动，然后再进行切开。从一只眼睛到另一只眼睛进行横向切割。用镊子将刚松开的颅骨组织剥开。轻轻拉出大脑，并把我含N冰冷均质化缓冲液的圆锥形管（盖奇等人，2012）。

脑区域特异的纳米囊泡分离
把大脑在2毫米Zivic小鼠脑基质和切片脑（˚F igure 1）。除去嗅球和剩余的脊髓区域。嗅球后的第一个切片将包含前额叶皮层和纹状体。分离它们并收集在15 ml离心管中。第二个切片将包含皮质，海马，丘脑和下丘脑。隔离区域并将其收集在15 ml离心管中。第二个切片后的切片将包含皮质，海马和中脑。分离区域并收集在15 ml离心管中。其余区域将主要包含小脑。取出切片，并在镊子的帮助下，将这些区域隔离，并将来自多个小鼠的相同大脑区域组合在一起。注意不要污染一个区域。

图1.进行脑切片和区域识别的设置。A.将老鼠的大脑保存在2毫米的Zivic脑矩阵中。B.刀片保留在脑基质上，可制成2毫米薄的小鼠脑切片。C.从切片中识别各种大脑区域的小鼠大脑的图解。前部包含嗅球，后部是附着在脊髓上的小脑。底部显示的切片包含嗅球和小脑之间的部分。

使用Dounce均质器，通过使用2 ml冷均质缓冲液来均质化特定于区域的新鲜组织（下面的R ecipe 1 ）。向混合物中再添加3 ml缓冲液，并在4 °C下以200 ×g离心15分钟。小心取出沉淀物，然后将上清液用于下一步。
在4°C下以1,000 ×g离心上清液的脑裂解液15分钟，以除去含有核仁级分的沉淀。
收集上清液，并在4°C下以10,000 ×g超速离心20分钟以去除线粒体。除去上清液，在4 °C下以100,000 ×g离心2小时。该步骤将产生包含囊泡的丸粒。重悬在囊泡300-400微升的1 × PBS缓冲液中。囊泡可以在-80 °C下保存数周。
注：存储50-100微升每瓶使在执行全内反射荧光成像更加方便。

TIR F成像的单分子标记
要进行玻璃清洁，请使用4-5个经γ射线辐照的玻璃底盘，并在45°C下于5 M NaOH溶液中超声处理1小时。将它们用去离子水冲洗3次，然后在45°C下在0.1 M HCl溶液中再次超声处理1小时。最后用水冲洗餐具3次，然后用乙醇冲洗3次。
用压缩空气擦干干净的碟子，然后进行氧等离子体清洗。氧气血浆清洁应在高血浆水平下进行5分钟。这有助于去除一些先前的清洁步骤未除去的有机杂质（Raiber等，2005）。
注意：强烈建议在此步骤中检查餐具的背景荧光。如果洗碗具有大背景，以视野中存在> 10-20个分离的背景分子为特征，则将其丢弃或再次清洗。

执行一个有趣的使用在95％乙醇1毫克/毫升溶液生物素PEG-硅烷的30分钟每道菜的ctionalization。30分钟后，用去离子水洗碗3次。
注意：玻璃底盘的功能化和纳米囊泡的固定在室温下进行。

向培养皿中加入0.1 mg / ml的NeutrAvidin PBS溶液5分钟。5分钟后，用1 × PBS冲洗餐具3次。
加入1 μ克/ ml生物素化抗GFP抗体的1 × PBS中并孵育菜30分钟。用1 × PBS冲洗餐具3次。
在添加囊泡之前，应先对培养皿进行成像，有些培养皿中也可以装满1.5 ml的1 × PBS（不含囊泡），以与添加囊泡的培养皿进行比较。
IMMO通过在室温下孵育30分钟bilize上官能菜空间分离纳米囊泡（如图中的纳米囊泡将被固定化˚F igure 2）。
注意：通常为50微升的纳米囊泡在200微升1 × PBS为TIRF成像良好。如果囊泡浓度太高（导致非常明亮的荧光但没有孤立的分子）或太低（导致非常低的荧光或没有单分子的荧光），请相应地更改浓度。

再次用1 ml的1 × PBS冲洗培养皿3次。向培养皿中加入1 ml 1 × PBS进行TIRF成像。

图2.固定在培养皿中的含有GFP的囊泡的示意图。干净的玻璃底盘涂有生物素-聚硅烷，硅烷将与玻璃结合，生物素可与中性亲和素结合。中性亲和素具有结合位点以与生物素结合。在洗涤步骤s中，未结合的中性亲和素将被洗掉，而结合的中性亲和素的剩余位点将用于结合生物素化的抗GFP抗体。该抗体将与纳米囊泡的烟碱乙酰胆碱受体中存在的GFP分子结合。

单分子的TIRF成像和数据分析
打开显微镜系统，包括激光，平台控制器和随附的软件（例如，奥林巴斯显微镜的Metamorph ）。等待30分钟，以使显微镜系统中的软件，相机和其他部件达到平衡。
注意：在进行成像之前，应将显微镜照相机充分冷却（〜- 80 °C）。请不要把在相机在更高的温度。

使用显微镜系统中的适当软件（Olympus Microscope中的Metamorph软件）进入落荧光模式。将激光功率设置为大约3 mW / cm 2 ，并确保激光聚焦并对准。理想情况下，在落射荧光模式下，激光应聚焦在距物镜一定距离的一点或小圆圈上。将曝光时间设置为100毫秒。发射光由电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，Andor ）检测。
在60 ×油镜上放一滴油。将一个装有PBS的干净玻璃底部皿放在物镜上方，并使用目镜和聚焦旋钮将物镜靠近皿底部。小心不要被客观击中。所述OI升降应留盘和物镜的基极之间。
注意：您可以通过可视化的荧光在目镜或随附的显微镜软件。分子聚焦后，您可以进入TIRF模式。

调整角度以获得全内反射。可以想像的激光束，以确保它处于TIRF模式（如图˚F igure 3）。此外，纳米囊泡还将在TIRF模式下进行空间隔离（如图4A所示）。对于每个视野，以100毫秒的曝光时间获取800帧。通过使用存储所收集的框架中的软件流采集模式。

TIRF显微镜图3.示意图上一个玻璃底菜。在调整激光束使其通过全内反射返回的情况下，可以使用油镜。底部200〜纳米厚的菜被照亮的渐逝场的是源自小号从玻璃侧的全内反射。该领域允许在玻璃底盘的底表面上成像荧光单分子纳米囊泡。

使用ImageJ的/斐济软件打开帧（˚F igure 4），并选择感兴趣的区域进行在荧光强度变化的分析（Rueden酒店等人，2017）。

图4。来自α-4GFP纳米囊泡的单分子成像的示例数据。A.含有GFP系膜受体的空间隔离纳米囊泡的TIRF图像（比例尺= 5 µm）。从示出了两个光漂白步骤的纳米囊泡单个单分子B.荧光强度图案（关注区域（ROI的单个分子的区域）示出在（甲））。这些光漂白步骤提供了有关alpha-4 beta-2 nAChRs如何在大脑中分布的信息。

菜谱

蔗糖缓冲液/均质缓冲液，pH 7.4
0.32 M蔗糖

10毫米HEPES

2毫米EDTA

蛋白酶抑制剂（每10毫升缓冲液含一片蛋白酶抑制剂）

致命加工作解决方案
1毫升致命加

10毫升PBS（1 × ）

致谢

这项工作改编自Fu等。肛门化学 2019 ，91 （15 ）：10125 - 10131. Biorender用于构建最数字。

利益争夺

我们声明与本出版物无关的利益冲突或竞争利益。

伦理

所有实验均在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）规定的指导下进行，并得到肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。

参考

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康涅狄格州鲁登（Rueden），辛德林（Schindelin），辛格（Hiner），MC，德佐尼亚（DeZonia），比利时沃尔特（AE），阿里纳特（Arena），ET和埃里切里（KW）（2017）。ImageJ2：用于下一代科学图像数据的ImageJ。BMC生物信息学18（1）：529。
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夏婷，袁洁和方兴（2013）。ATP结合DNA适体的构象动力学：单分子研究。J Phys Chem B 117（48）：14994-15003。