材料和试剂

1. 星实验室提示（星实验室，目录号：S1111-1706和S1111-6701）<

2. 90 mm培养皿（Fisher Scientific，目录号：11308283）<

3. 10 ml和25 ml移液管（Greiner Bio One，目录号：607180和760180）<

4. 50 ml离心管（科学实验室用品，目录号：SLS8110）<

5. 2 ml反应管（Greiner Bio One，目录号：623201）<

6. 12孔板和96孔板（Greiner Bio One，目录号：665102和655185）<

7. 氮气（BOC UN1066压缩氮气）<

8. 5毫升注射器（BD翡翠参考号307731）<

9. 笔膜（GTS RPEN-075-0320）<

10. 小瓶，22毫升一次性闪烁小瓶<

11. 韧性胶带，苏格兰威士忌®<

12. 注射器过滤器，Millex HA，MF微孔膜50pk 0.45µ米<

13. 0.2μm SartoriusTM MinistartTM注射器过滤器<

14. 注射器，布劳恩喷墨10毫升注射器<

15. BD Discardit II 20毫升注射器<

16. 2,2-二甲氧基-2-苯乙酮（99%，Sigma-Aldrich），储存于4°C级<

17. （右）-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁内酯（AODMBA）（95%，西格玛，目录号：376361），储存于4°C级<

18. RPMI 1640，含20 mM HEPES和L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠（Sigma，目录号：R7388）<

注：RPMI 1640可存储在4°好几个月了。<

19. PBS（磷酸盐缓冲盐水）（Fisher Scientific，目录号：10209252）NB:PBS在室温下高压灭菌并储存数月。<

20. 结晶紫（Sigma，目录号：C3886）<

注：结晶紫每天都是新鲜的，用BD Discardit II 20ml注射器和0.2ml注射器过滤消毒μm SartoriusTM MinistartTM注射器过滤器。<

21. 异丙醇（Fisher Scientific，实验室试剂级≥99.5%)<

22. YPD培养基（见配方）<

细菌蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0037）<

酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）<

D-无水葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：G/0500/61）

设备

1. 50 ml锥形烧瓶（Fisher Scientific，目录号：15499093）<

2. 聚四氟乙烯搅拌器5 mm<

3. 富士胶片DMP-2830材料打印机<

4. FujiFilm 10pL DMP墨盒DMC-1610/PN2100201146<

5. 惰性气体净化箱PG-7-0444<

6. 紫外线装置：EPL UV 119-070高强度装置<

7. 搅拌阶段IKA RCT基本<

8. 冰箱LEC Medical PE207C<

9. 真空烤箱：Fistreem 31L容量<

10. GilsonTM移液管Neo移液管<

11. 带紫外线装置的生物安全柜<

12. 30分钟加热培养箱<

13. 加热轨道振动筛：新不伦瑞克TM Innova® 44（用于烧瓶）ELMI SkyLine DTS-4数字热振动筛（用于微孔板）<

14. Eppendorf离心机5810<

15. 科学工业<

16. 韦伯科学国际有限公司。<

17. 先前的科学显微镜PX043<

18. 无菌镊子<

19. BioTek EL800微孔板分光光度计<

20. 天平（丹佛仪器SI-234）

软件

1. 富士胶片DMP 2.0.0.1版<

2. GIMP 2.8.14<

3. 自动热键1.1.32.00

程序

根据典型的2D打印墨水配方（Derby，2010），用于喷墨3D打印工艺的墨水的开发不仅应考虑粘度和表面张力，还应考虑反应性或固化速度，这一点很重要，并与光引发剂浓度和打印环境等因素相关。我们在之前的研究中详细描述了这些因素（He等人，2016；Zhang等人，2019年）。下面的方案揭示了从a（R）开发成功的候选油墨配方-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-我们最近的工作中印刷了丁内酯单体（Vallieres等人，2020）。

答。油墨制备<

1. 将5 mm聚四氟乙烯搅拌器放入22 ml小瓶中。<

2. 将小瓶放在天平上并用皮重称量。<

3. 向小瓶中添加0.1 g 2,2-二甲氧基-2-苯乙酮（固体）。<

4. 在添加液体单体之前，用铝膜包裹小瓶。<

5. 将小瓶放回天平上，并用皮重称量。<

6. 添加10 g（R）-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-将丁内酯（液体）倒入小瓶中并盖上瓶盖。<

7. 将小瓶置于搅拌阶段（IKA RCT Basic），并在室温下以800 rpm混合内容物15分钟。<

8. 在氮气吹扫过程中，将小瓶放在有阴影的盒子中，以帮助排除环境光。打开瓶盖，用针头将氮气（流速约10毫升/分钟）吹入混合物中15分钟，使油墨充满氮气。这一步有助于减少印刷过程中的氧气抑制效果。<

9. 在暗室中用10毫升注射器收集墨水，并通过注射器过滤器吹扫到一个新的小瓶中。过滤器将有助于清除任何固体污染物，并避免打印过程中打印头堵塞。<

10. 盖住小瓶并用铝箔包裹，以排除可能引发聚合并导致墨水凝固的环境光。<

11. 在4小时内储存油墨至少12小时°C使用前。

B。加注墨盒<

1. 在暗室中执行以下所有步骤。<

2. 使用5毫升注射器小心收集3毫升墨水，注意避免在此阶段产生气泡。<

3. 将墨盒附带的平头针固定在注射器末端，并小心地将取样的3毫升墨水转移到墨盒袋中。<

4. 用韧性胶带包裹墨盒，以避免打印过程中环境光引发固化，然后组装打印头。

C。印刷和后处理<

1. 将装满的打印头夹在DMP 2830打印机上（图1）。

图1。Dimatix DMP 2830打印机的内部设置

2. 贴上陶瓷清洁垫并吹扫墨盒2秒钟，以清除打印头中的残留空气。<

3. 将笔膜剪成A4大小，并用异丙醇清洁两侧。<

4. 将胶卷放在印刷台上，打开真空，确保胶卷牢固地固定在印刷台上。<

5. 安装杂物箱的前面板并吹扫氮气，直到氧气液位降至<

0.2-0.3%（v/v）。<

6. 禁用挠痒痒控制功能，监视水滴查看器以检查水滴的形成，并设置如下所示的打印波形（表1）。<

表1。（R）中使用的喷射和非喷射波形的关键参数-α丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁内酯油墨
喷射波形

水平（%）<

回转率<

持续时间(µ秒）<

最大喷射量<

频率（kHz）<

波形宽度<

(µ秒）<

第1节<

0<

0.65<

3.584<

5<

11.52<

第2节<

100<

0.93<

3.712<

第3节<

13<

0.6<

3.392<

第4节<

27<

0.8<

0.832<

非喷射波形

水平（%）<

回转率<

持续时间(µ秒）<

最大喷射量<

频率（kHz）<

波形宽度<

(µ秒）<

第1节<

33<

1<

3.712<

5<

11.52<

第2节<

33<

1<

6.976<

第3节<

27<

1<

0.832

7. 将打印温度设置为48°C和弯月面到4.0英寸H2O。调整每个喷嘴的打印电压，使液滴形成类似于图2所示。液滴速度需要在7 m/s和10 m/s之间。我们的工作中使用了12架喷气机（喷气机5-16）。

图2。（R）液滴形成示例-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁内酯墨水由Dimatix仪器滴落观察者捕获。补充文件中附有完整的视频。

8. 将液滴间距设置为35µm和打印头的角度为5.8度。<

9. 将清洁程序设置为在每层开始时进行0.3秒的清洗和吸干，将打印头升高12µ每层完成后m。<

10. 每一层的打印图案是一个单位图，从1.bmp开始命名为number+“.bmp”；在打印程序中选择1.bmp。<

11. 将补充（补充脚本）中的脚本复制到记事本中并另存为AHK文件。<

12. 运行保存的脚本，依次输入（R）的“原始高度”、“层数”和“每层高度增量”-α-丙烯酰氧基-β,β-二甲基-γ-丁内酯油墨，我们用200µm、 100层，11层µm每层高度增量。<

13. 使用点滴式喷墨打印头将液体单体墨水沉积到目标位置。印刷油墨随打印头移动时，通过连接的UV单元进行扫描和固化（He等人，2017）。<

14. 收集印刷样品并放置在真空烘箱（室温，-300 mmHg）中24小时（图3）。

图3。真空干燥后采集的人工语音瓣样本

15. 将样品依次浸入异丙醇和蒸馏水中清洗，并在空气中干燥。<

16. 将样品转移到12孔板上，用UV-C照射20分钟，使样品灭菌。

D。真菌培养物的生长、接种物的制备和生物膜的形成（使用无菌技术；根据真菌种类，可能需要一个生物安全柜）<

第1天-去除菌株
1用C。白念珠菌细胞从一个股票保持在-80°C（对于股票，冻结C。白念珠菌细胞-80°在YPD肉汤中加入20%甘油），在37℃的静态培养箱中培养2天°C。我们用了C。白色念珠菌CAF2-yCherry株；但该方法也适用于其它C。白色念珠菌菌株。

第3天-建立隔夜培养
2用C。在YPD琼脂上培养2天的白色念珠菌。我们建议至少检测三个独立的菌落。在37转/分的轨道摇床（150转/分）中培养过夜°C。

第4天-收获细胞并接种打印样本
3. 通过离心（3000）从过夜液体培养物中收获细胞× g，3分钟）。<

4. 去除上清液，用25毫升移液管在20毫升PBS和20毫升RPMI 1640中清洗一次。<

5. 使用10 mL移液管将最终细胞颗粒重新悬浮在10 mL RPMI 1640中。<

6. 从得到的细胞悬浮液中，在2mL反应管中制备1:100和/或1:1000的RPMI 1640稀释液，旋涡，并在brightfield显微镜下用40× 目标。<

7. 计算制备最终浓度为1的40 mL细胞悬浮液所需的接种量× RPMI 1640中的106 ml-1细胞。<

8. 将1 ml调整后的细胞悬液转移到12孔板的每个孔中（从步骤C16开始）。<

9. 盖上盖子，用胶带密封，在37℃静置2小时°使细胞粘附在表面。<

10. 用无菌镊子将打印好的样品转移到一个新的盘子里，用清水冲洗三次<

2毫升PBS去除不粘附的细胞。<

注：打印的样品必须小心地转移到新鲜的平板上，使用镊子，以避免机械破坏细胞附着。将样品转移到新鲜平板（此处和步骤E2中）很重要，因为游离细胞也可以粘附在微孔表面，这将增加结晶紫信号，以反映打印样品上生物膜的形成，从而影响分析。<

11. 加入1毫升新鲜RPMI 1640，在37℃下培养46小时°以100转/分的速度进行轨道震动。

E。真菌生物膜评估（使用无菌技术和生物安全柜）<

结晶紫染色提供了一种评估生物膜生物量的方法。或者，可以测定生物膜的代谢活性；我们通过测量XTT（四唑盐，2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-2H-四唑-5-羧基苯胺）的还原来检测24小时生物膜的这种活性。然而，结晶紫的价格比XTT便宜，可以方便地目视检测样品表面的生物膜（例如，Valliers等人，2020年的图4C）。<

1. 48小时后，C。白色念珠菌应显示成熟的生物膜。小心吸入培养基，以免接触或破坏生物膜。<

2. 轻轻地将带有生物膜的印刷样品转移到一个新的平板上。<

注：如上所述，必须使用镊子小心地将样品转移到新鲜平板上，以避免机械破坏生物膜（样品转移过程中的机械破坏可能导致生物膜从样品表面分离并干扰最终评估）。因此，每次试验需要多个样本（n>3），以确保生物膜阻力不是操作错误造成的。还需要一个对照组（Vallieres et al.，2020），以确保生物膜的形成符合预期）。<

3. 在室温下用2ml 0.5%（w/v）结晶紫染色1分钟。<

4. 用2ml PBS冲洗三次，去除不粘附的生物膜和多余的污渍。<

5. 定量时，加入1毫升乙醇溶解结晶紫。<

6. 转移100μ我对96孔板有反应。如果结晶紫的浓度过高，可能需要稀释反应。我们建议在分析前准备一个标准曲线来估计结晶紫吸收的饱和水平。为此，测量结晶紫（乙醇中）浓度范围内的吸光度。<

7. 使用BioTek EL800微量滴定板阅读器测量600 nm处的吸光度。

数据分析

从减去阴性对照（仅乙醇，即无结晶紫）的相应值后得到的比色读数，计算平均值（至少三个生物复制品）和SEM，并绘制数据。或者，3D打印样本的结果可以表示为对照的百分比[以Valli表示]ères等人，2020年，阳性对照是由Atos Medical提供的商用人工瓣膜（原料硅橡胶Q7-4735，道康宁公司）。

笔记

结晶紫可能与某些材料不相容，例如聚乙二醇二丙烯酸酯<

（PEG575DA）。即使在没有C的情况下，印刷的PEG575DA样品也完全被结晶紫染色。白色念珠菌。对于这些材料，我们建议使用上述XTT还原试验评估真菌生物膜的形成。

食谱

1YPD培养基<

2%细菌蛋白胨<

1%酵母抽提物<

2%无水葡萄糖<

注：必要时，用2%（w/v）琼脂（Sigma，目录号：A7002）固化培养基。YPD培养基经过高压灭菌，随后可在室温下储存数月。

致谢

这项工作得到了生物技术和生物科学研究理事会（批准号BB/P02369X/1）和工程和物理科学研究理事会（批准号EP/N006615/1和EP/N024818/1）的支持。

相互竞争的利益相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的利益。

参考文献

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