材料和试剂
1.5毫升皮尔斯米icrocentrifuge吨ubes物（Thermo Scientific，目录号：69715）
陪替氏d ishes（Fisher牌，Fisher Scientific公司，目录号：FB0875712）
显微镜载玻片（珍珠，目录号：7101）
显微镜幻灯片盖玻片（珍珠）
1毫升Sterilin p拉斯蒂克吨转让（BOT）p ipettes物（Thermo Scientific，目录号：201C）
11号手术刀，用于金属手术刀10621（羽毛，目录号：2976）
家用铝箔
根训练员（飞行塑胶有限公司。）
草种子（这里使用：黑麦草品种参孙种子，内生真菌-免费; Agricom，新西兰）
Epichloë菌株，E。festucae Fl1（ATCC，目录号：MYA-3407）
高压灭菌蒸馏水
技术克RADE一个GAR（Difco实验室，目录号：DF0812-17-9）
马铃薯d extrose b罗斯（Difco实验室，目录号：DF0549-17-9）
L-乳酸水合物（C 3 H 6 O 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：L1750）
甘油（HOCH 2 CH（OH）CH 2 OH）（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）
苯酚（C 6 H 5 OH）（Thermo Scientific，目录号：17914）
台盼蓝（C 34 H 24 N 6 O 14 S 4 Na 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
氯水合物（Cl 3 CCH（OH）2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C8383）
苯胺蓝WS（C 32 H 25 N 3 Na 2 O 9 S 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：28631-66-5）
三钾ø rthophosphate（K 3 PO 4 ）（VWR，目录号：700001）
番红O（CI 50240）（C 2 0H 19 ClN 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：1159480025）
3,3'- D氨基联苯胺（DAB）（Sigma-Aldrich，目录号：D12384）
盐酸（HCL）（Sigma-Aldrich，目录号：D12384）
95％乙醇（CH 3 CH 2 OH）（Sigma-Aldrich，目录号：11727）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S8501）
硼酸（BH 3 O 3 ）（Thermo Scientific，目录号：AC315185000）
2.4％P otato葡萄糖琼脂（见配方）
3％w ^亚特琼脂（见配方）
Lactophenol- Ť rypan乙略溶液（见配方）
氯水合物溶液（请参阅配方）
苯胺乙略溶液（见配方）
花粉萌发幻灯片（请参阅食谱）
番红花溶液（请参阅食谱）
DAB解决方案（请参阅食谱）

设备

100毫升玻璃烧杯
徕卡DMR显微镜（相机：徕卡DC500）
高压釜
冰箱
层流柜
保温箱（Thermo Scientific ，3110 CO 2水-夹套保温箱）
体视显微镜（Leica，型号：Leica M3Z）
Precellys 24组织破坏者（Bertin Technologies）
不锈钢-钢镊子（Sigma-Aldrich公司，目录号：Z168777）
金属手术刀（Sigma-Aldrich，目录号：S2646）

程序

苗的准备和接种（改编自Latch和Christensen，1985年）：
种子表面灭菌：
将不含内生菌的种子在50％硫酸（H 2 SO 4 ）中孵育30分钟。
倒掉的酸和将种子浸泡3次在无菌水中，每次3分钟。
将种子在50％商业漂白剂中孵育20分钟。
倒出种子，将种子浸入无菌水中3次，每次2分钟。
干燥的无菌滤纸上在种子层流罩。
种子培养：
使用无菌镊子，转移的无菌干燥的种子至4％水琼脂（每板10个种子）。
孵育的在黑暗中板在22℃下7天。
接种菌丝体的准备工作：
将Epichloë菌株传代到PDA平板上。
在20°C下孵育平板7-10天。
接种苗：
7-8天后，将种子将与黄化苗发芽。
使用在层流橱中的解剖显微镜，做一个小切口在分生组织（通常会出现之间的依稀可见线的中胚轴和所述胚芽鞘）用手术刀。
从PDA板上切下一小块真菌菌丝体（约2 mm × 2 mm），并将其插入到分生组织的切口中。
孵育的在它们的原始水琼脂平板的幼苗在黑暗中在22℃ ，用该板站在他们的端部和所述幼苗直立。
Becker等人详细描述了后续步骤（包括视频和图表）。，（2018）。
在所有植物响应测试，有4个接种处理包括具有切口的幼苗和野生型接种E. festucae （“野生型”），突变体Δ维拉E. festucae （“ Δ维拉”），琼脂机智块豪特真菌（“E-（切断）”），并且在没有切口苗但一块琼脂地方的d在分生组织（“E-（足本）”）。

染色德芬小号Ë响应
接种的幼苗培养的不同植物应答测试如下：

胼胝质沉积（公元一诺克斯，1979年PTED）：
非洲凤仙花花粉管可以用作阳性对照，以测试是否该苯胺乙略溶液是否正常工作。
将花粉撒在刚准备好的花粉发芽玻片上。
存储的在潮湿的幻灯片P ETRI培养皿（含有直到发芽发生至少5小时的湿纸巾）。
用几滴A niline B lue溶液覆盖玻片，并在室温下孵育30分钟。
冲洗幻灯片TW冰用蒸馏水。
使用荧光显微镜观察花粉管中的ose质沉积（激发450-490 nm，发射> 515 nm）。
胼胝质沉积显示为黄色-绿色颜色（图1A）。
在不同时间点研究的胼胝质沉积中确定4天后-接种（DPI）为最佳稻香-黑麦草关联。
在4 DPI，放置在苗甲niline乙在室温下30分钟略溶液。
用蒸馏水冰洗幼苗。
除去接种物（真菌块，从分生组织和切割或在阴性对照琼脂块）从秧苗的分生组织部分包括所述1.5厘米上方和下方。
在荧光显微镜下观察call质沉积（激发450-490 nm，发射> 515 nm）。
胼胝质沉积似乎为黄色-绿色颜色（图1B）。

图1.毛刺检测。答：使用凤仙花花粉管作为call检测的阳性对照。左面板；花粉管中甲niline乙略溶液，右图; 花粉管仅在无A苯胺B缓冲液的缓冲液中。在B.胼胝质沉积所述的7-d龄幼苗分生组织区域接种用野生型和Δ维拉的突变菌株E. festucae和内生真菌-自由切割，并用琼脂块作为接种未切割秧苗一个控制; 4 DPI用A niline B lue溶液染色。ose质沉积出现黄色-绿色。

木质素生产（改编自Tanaka等，2014）：
研究在不同时间点的木质素生产确定2.5 DPI是用于最佳稻香-黑麦草关联。

在2.5 DPI，放置在幼苗番红溶液在黑暗中10分钟，在室温下。
用蒸馏水冰洗幼苗
除去接种物（真菌块，从分生组织和切割或在阴性对照琼脂块）从秧苗的分生组织部分包括1.5厘米上方和下方。
在明场的荧光显微镜下观察木质素。
木质素沉积显示为一红色彩色（图2）。

图2 。木质素检测在所述的7-d龄幼苗分生组织区域接种用野生型和Δ维拉的突变菌株E. festucae和内生真菌-自由切割，并用琼脂块作为接种未切割秧苗一个控制; 4 DPI用1％番红O溶液染色。木质素沉积物显示为红色。

植物细胞死亡（公元一从Koch和Slusarenko，1990年PTED）：
为H ighest植物细胞死亡的水平，7天后观察-接种（DPI），但时间-可以学习课程进行1-12 DPI。
在7 DPI下，将整个幼苗放在20 ml沸腾的乳酚-T rypan B lue中煮1分钟。由于这种解决方案包含小号腐蚀性苯酚和需要沸腾，该步骤应当进行下的层流柜。首先，预热在该溶液100 -毫升玻璃烧杯中在本生灯至沸腾，然后添加苗。
脱色的通过在20毫升放置染色苗氯醛30分钟水合物溶液。由于水合氯醛是有毒的，该步骤应当进行下的层流柜。
用蒸馏水冰洗幼苗。
从分生组织中除去接种物（阴性对照中的真菌块或琼脂块），并切下幼苗的分生组织部分，包括上下1.5 cm。
将幼苗部分安装在装有盖玻片的载玻片上。
在明场的尼康Ti-E倒置显微镜（相机：Nikon DsRi1）下观察细胞死亡反应。
d EA d细胞出现深蓝色（图3）。

图3.细胞死亡检测在所述的7-d龄幼苗分生组织区域接种用野生型和Δ维拉的突变菌株E. festucae和内生真菌-自由切割，并用琼脂块作为接种未切割秧苗一个控制; 4 DPI用乳酚-T rypan B lue溶液染色。d EA d细胞出现深蓝色。

过氧化氢（H 2 ö 2 ）生产（AD一个从Thordal-克里斯坦森PTED等人，1997）：
ħ检测2 ö 2制造后的正常接种程序
接种后应立即检测出大多数H 2 O 2的产生。
接种后，立即将整株幼苗置于新鲜准备的DAB溶液中，在黑暗中于室温放置4小时。
用蒸馏水冰洗幼苗
除去接种物（真菌块，从分生组织和切割或在阴性对照琼脂块）从秧苗的分生组织部分包括1.5厘米上方和下方。
在明场的Leica DMR显微镜下观察H 2 O 2的产生。
H 2 O 2显示为棕色（图4A）。
无需切口即可检测H 2 O 2的产生
由于切割分生组织会产生高水平的H 2 O 2，从而使治疗之间的区分变得困难，因此我们优化了在没有切口的情况下测量H 2 O 2的方法。

地点1 - 2毫米2在琼脂块分生组织上方1cm处真菌培养。
接种后，立即将整株幼苗置于新鲜准备的DAB溶液中，在黑暗中于室温放置4小时。
除去接种物（真菌块，从分生组织和切割或在阴性对照琼脂块）从秧苗的分生组织部分包括1.5厘米上方和下方。
在明场的Leica DMR显微镜下观察H 2 O 2的产生。
ħ 2 ö 2显示为一棕色（图4B）。

图4.过氧化氢（H 2 O 2 ）检测。A.ħ 2 ö 2生产中的7- d龄幼苗分生组织区域接种用野生型和Δ维拉的突变菌株E. festucae和内生真菌-自由切割，并用琼脂块作为接种未切割秧苗一个控制; 立即用DAB溶液染色。B.在使用方法4b接种幼苗后立即检测到7d龄幼苗的分生组织上方1cm处的H 2 O 2响应（检测没有切口的H 2 O 2产生）。任意评分系统，用于测量所述的严重性的响应。H 2 O 2呈现棕色。

数据分析

对于所有的检测方法和对于每个处理，可以观察到的响应的范围，因为黑麦草是一个出-交叉物种; 因此，每种植物都有不同的基因型。因此，我们根据显示出响应的幼苗百分比使用d任意分类方法。对于所有的方法（除了图4b ; d etectingħ 2 ö 2生产无切口），数据分析基于苗表示测试响应（类似的百分比到图URE 1B，第一ø n中的左侧）。作为一个例子，胼胝质沉积与不同菌株接种的幼苗结果E. festucae是在呈现˚F igure 5。

图5的7-d龄幼苗表示第4天的胼胝质沉积百分比后-接种。幼苗用野生型和接种Δ维拉的突变株E. festucae ，和内生真菌-自由切割和未切割的幼苗被用琼脂块作为接种一个控制。每次接种中，接种了30株幼苗。条形表示从3个独立的接种实验计算得出的平均值的标准误差。

到检测ħ 2 ö 2生产无切口（米ethod 4B ），的范围内的5个不同的响应（0〜4），使用（图URE 4B）由于M的灵敏度ethod。该p苗表示H的ercentage 2 ö 2响应可以在被可视˚F igure 6。

图6.百分比的7-d龄幼苗示出了生产的过氧化氢（H 2 ö 2 ）。的ħ 2 ö 2响应1 -厘米以上的7- d龄幼苗分生组织被接种幼苗后立即检测到使用方法图4b （检测ħ 2 ö 2生产无切口）与野生型（WT）和Δ维拉的突变株E. festucae和琼脂块作为一个控制（E-）。每次接种中，接种了30株幼苗。数小号1-4在图例中表示的H的任意分类2个ö 2响应图表示URE 4B。

笔记

每种方法进行了三个独立的接种测试。
n个用于各试验苗棕土应大于30 ，和增加的幼苗的数目可以帮助减少可能是由遗传背景的差异的响应的可变性的种子。
在所有的检测方法，我们通常染色全苗和切出的分生组织区域（关注区域）的显微镜。由于伤口可能会干扰显微镜检查，因此减少了宿主反应。

菜谱

2.4％马铃薯葡萄糖琼脂
将24克马铃薯葡萄糖肉汤和15克琼脂溶解在1升蒸馏水中
高压釜在121 30分钟℃，倾25毫升溶液每P ETRI菜
盘子可以在冰箱中保存长达一个月
3％琼脂水
溶解30克琼脂在1升蒸馏水
高压釜在121 30分钟℃，倾25毫升溶液每P ETRI菜
盘子可以在冰箱中保存长达一个月
乳酚-锥虫蓝溶液
溶解10mg的台盼蓝在10毫升蒸馏水中并添加10米升乳酸（98％），将10毫升甘油，和10毫升酚
在S olution可以存储在黑暗中在冰箱里长达3个月
氯水合物溶液
将2.5克水合氯醛溶于1毫升蒸馏水
在S olution可以储存在冰箱里长达1个月
苯胺蓝溶液
将0.1 g苯胺蓝和2.3 g正磷酸三钾溶解在100 ml蒸馏水中
将溶液在黑暗中放置24小时，直到变成无色
在S olution可以存储在黑暗中在冰箱里长达3个月
花粉萌发幻灯片
溶解10克蔗糖，1克琼脂，并在100毫升8毫克硼酸蒸馏水
在121°C下高压灭菌30分钟，然后将其放在载玻片上以制成平膜
幻灯片可在冰箱中保存长达一周
番红花溶液
将1 g番红花O（CI 50240）溶于100 ml蒸馏水中
在S olution可以存储在黑暗中在冰箱里长达3个月
DAB解决方案
将10 mg 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶于10 ml蒸馏水中
使用HC将pH调节至3.8升
每次测试均应准备新鲜的溶液

致谢

这项研究是由出资资助小号来自新西兰马斯登基金合同AGR1002皇家学会，以及新西兰战略科学投资基金，合同A20067。我们感谢阿德里安·特纳（显微镜和图形单元，奥克兰大学），CR的Voisey，WR辛普森，W.锤，和A. deBonth技术援助（牧草改良，草原AgResearch）和Biotelliga有限公司。用于提供实验室空间。

利益争夺

作者宣称没有冲突小号的兴趣。

参考

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