材料和试剂

种子灭菌试剂

1. 野生型（哥伦比亚）拟南芥种子

注：为了标准化，我们使用了野生型植物。为了研究维管再生效率，可以在没有任何修改的情况下对拟南芥突变体植物进行分析（Radhakrishnan等人，2020）。

2. 20%次氯酸钠

3. 70%乙醇

4. 无菌高压灭菌水

样品脱色试剂

1. 35mm（直径）圆形培养皿（Himedia，目录号：PW050）

2. 15%乙醇

3. 50%乙醇

4. 70%乙醇

5. 96%乙醇

6. 100%乙醇

7. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）

8. 水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：23100）

9. 无菌高压灭菌水

10. Murashige和Skoog（MS）盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5524）

11. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）

12. 植物琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7921）

13. 清除溶液（见配方）

14. 半强度Murashige和Skoog（MS）培养基（见配方）

设备

体外培养设备

1. 层流空气室

2. 无菌移液管头（200µ1毫升和1毫升）

3. 微量移液管

4. 1.5毫升微量离心管

5. 无菌一次性方形培养皿，尺寸：120mm× 120毫米（Himedia，型号：PW050-1）

6. 保鲜膜

7. 植物生长室（Percival，型号：AR-100L3）

切口和样本采集设备

1. 细尖镊子（Dumont镊子，型号：Style 5）

2. 无菌刀片

3. 镊子

4. 微型Vannas直剪（Ted Pella，型号：1340）

5. 手套

6. 面罩

显微镜设备

1. 用于切割和样品采集的立体变焦显微镜（Zeisstemi，型号：2000）

2. 用于亮场成像的共焦激光扫描显微镜（徕卡，型号：TCS SP5 II）

3. 显微镜载玻片（Labtech）

4. 显微镜盖玻璃，22× 22mm（康宁，型号：2850-22）5。水彩刷（带小刷毛）

软件软件

1R软件

程序

答。种子灭菌

种子灭菌应在无菌条件下在LAF内进行。操作所需的工作区和工具（微量移液管、尖端盒、试剂瓶）必须用70%乙醇和紫外线彻底擦拭。在开始体外培养之前，应使用肥皂洗手并用70%乙醇擦拭。本文介绍了一种用于种子的液体表面灭菌方法。

1. 在1.5毫升微型离心管中等分所需数量的野生型种子。

注意：为了有效的灭菌，每管不要取超过300粒种子，并清除种子收集过程中留下的任何碎片，如部分西力克。

2. 加入1毫升70%乙醇。倒置试管搅拌内容物2-3分钟。

注意：离心前，确保离心机和转子表面清洁。打开和关闭时，避免接触微型离心管盖的内部，以尽量减少污染。

3. 在4226转一圈× g（Rcf），小心地丢弃乙醇，不要丢失任何种子。

4. 加入1毫升20%次氯酸钠，摇匀2-3分钟，重复步骤A3。

5. 用1毫升无菌高压灭菌水清洗种子5-7次。

6. 将种子在1毫升无菌高压灭菌水中分层2天，温度为4℃°C。

7. 用1毫升移液管吸取大约25粒种子，放在半强度MS培养基表面。用移液管尖将种子排成一行，每个种子之间至少留有0.5厘米的间隙。

注意：为了便于切割，避免将种子放得很近。

8. 将培养皿垂直放置在45℃以下的生长室中培养μmol/m2/s连续白光（24小时）22°C和70%相对湿度。

注：也可以在长日和短日条件下使用5个dpg植物进行分析。

B。切叶

1. 在采取必要措施尽量减少污染后，可在工作台上进行切叶。操作过程中戴手套和面罩。切割前，用70%乙醇擦拭解剖显微镜（蔡司stemi 2000）表面和戴手套的手。用于切口的镊子应在70%乙醇中浸泡，并在切口前干燥几分钟。多天切开钢板会增加污染的发生率。

注意：由于镊子尖易碎，不建议使用可能损坏或钝的灭菌技术。

2. 在解剖显微镜下打开装有幼苗的平板，以确认幼苗的年龄，并对5 dpg（发芽后天数）的幼苗进行切割。注意：由于种子萌发的非同步性，幼苗的年龄可能不完全相同。幼苗的年龄是通过计算发芽后的天数（dpg）来确定的。胚根出苗第一天按0dpg计。为了保持一致性，只伤害处于理想发育阶段的植物。把没有受伤的植物移到一边，以区别它们和受伤的植物。幼苗的年龄很重要，因为年龄较大的幼苗表现出较低的再生效率，而非常年轻的幼苗在这个过程中受到广泛的损害。切口的适宜年龄为4～6dpg（图1）。

3. 在属于第一对（真叶）的两片叶子中，选择面向培养皿盖的叶子进行切割，以便于接近。使用镊子的尖头，在第一对叶片的下背面做切口。在叶柄和叶片基端之间的连接处小心地进行切口（图1a，补充图1，视频1）。这确保了损伤发生在第一侧脉的正上方（从叶的基部开始计算），与中脉近中轴的其他位置相比，此处的再生效率最高（图2）。切口应以足够的力进行，以使其刺穿靠近叶片背面的维管组织，而不刺穿近轴面。这一点很重要，因为大范围的损伤会造成超过400的间隙µ亲本血管链之间的m没有修复（Radhakrishnan等人，2020年）（图1p）。

注意：注意不要对叶子造成多重伤害；因此，不建议在第一对的两片叶子上进行切口。在切开过程中，无菌的200μ在切割过程中，可以用微尖或镊子支撑子叶或下胚轴来限制植物的运动。这将防止植物因切口力而浸入培养基中；但是，避免触摸受损的叶子，因为这会造成进一步的伤害。

视频1。5株dpg植物切叶试验示范

4. 切开后，关闭平板，在22℃连续光照下垂直孵育°在生长室里。

5. 切口（dpi）后4天，用Vannas剪刀小心地在叶柄处切割受伤的叶片（视频2），并将其放置在小圆形培养皿（35 mm）中的15%乙醇中。

注意：大约20-30片叶子可以用2-3毫升处理脱色过程中，在35 mm培养皿中加入15%乙醇。或者，当处理多种类型的样品时，可以使用6孔板。

视频2。切叶后4天样本采集演示

图1。中脉损伤后叶片维管束的再生取决于损伤叶片的年龄。（a-b）描述有效血管再生切口位置的图示。红星代表受伤部位(c、 e）示意图和brightfield图像，显示再生血管系统重新连接断开的亲本支架，形成绕过损伤部位的Dloop(d、 f）图示和brightfield图像显示连接顶端切端和最近侧静脉的再生血管系统。（c）和（d）中的黄色方块代表端到端连接的木质部元素(在3dpg（g）（*P=0.016，n=24）、4dpg（h）（P=0.426，不显著（ns），n=45）、5dpg（i）（n=20）、6dpg（j）（P=0.605，不显著（ns），n=40）、7dpg（k）（*P=0.03，n=34）、8dpg（l）条件下叶片的再生反应

（***P=1.6）× 10-12，n=43），9 dpg（m）（***P=2.405）× 10-9，n=52）和10 dpg（n）（***P=4.8）× 10-08，n=21）。统计分析采用皮尔逊检验。注意，3-7 dpg叶片能够重新连接其断开的脉管系统，但随着叶片的逐渐老化，再生效率下降。再生的脉管系统由红点表示。黑色箭头表示受伤部位(o）描述不同年龄受害叶片的维管再生频率的图表(p）大范围的伤害会造成超过400的缺口µ在亲本血管束之间；因此，没有观察到血管再生。χ2

（q）再生维管链的端到端附着的木质部成分。比例尺：50µm。

C。样品脱色和清除

1. 在15%乙醇中培养15分钟后，使用微量移液管排空乙醇，注意不要损坏样品。

注意：最初，叶子漂浮在溶剂表面。用带有小鬃毛的油漆刷轻轻地浸没叶子。

2. 随后用50%、70%和96%乙醇连续处理15分钟，使组织逐渐脱水。丢弃96%乙醇后，叶片在100%乙醇中培养12h，以进行组织脱水和去除叶绿素色素沉着。

3. 丢弃乙醇后，样品分别在96%、70%、50%和15%乙醇中连续培养15分钟，以进行再水化。

4. 丢弃乙醇后，将新制备的含有水合氯醛的清洁溶液（见配方）添加到样品中。在安装载玻片进行brightfield成像之前，样品在清洁溶液中培养至少3小时。

注：增加清除时间可以在一定程度上提高亮场成像的对比度。

D。载玻片制备

用一把小刷子，从清洗液中取出每片清洗过的叶子，放在干净的载玻片上，叶子的正面朝上。刷子可以用来轻轻地挑开任何卷曲的叶子，而不会造成任何进一步的伤害。盖玻片安装在样品上，注意不要产生任何气泡。多片叶子（6-8）可以放在一张盖玻片下面。使用200µl移液管尖端，约80µl从安装好的盖玻片的拐角处添加清洁液，从而填充安装好的叶片之间的间隙。

E。亮场成像

通过荧光显微镜或共焦显微镜的亮场模式对切口部位成像，可以评估清除标本中血管链的再生情况。建议用共焦显微镜拍摄再生维管链的快照，以获得再生木质部成分的高分辨率图像。这里描述的设置适用于徕卡TCS SP5 II倒置显微镜。氩激光器或DPSS 561可用于以30%的激光功率、200 Hz的扫描速度、2的行平均值和1024像素格式捕获快照× 1024

新形成的维管链显示出端到端连接木质部元素的独特形态（图1e、f、j、k、q）。当再生静脉重新连接中脉切端形成D形环（图1c，e）或将任一切端连接到侧静脉（图1d，f）时，结果被认为是成功再生。为了保持方法的一致性，在研究再生的年龄依赖性时，在第一侧静脉连接处以外的位置进行的切口没有评分。此外，只有切口的间隙小于400µ分离的亲本链之间的m被评分。

数据分析

用R软件进行统计分析。收集的数据用Pearson检验进行统计分析。χ2

结果与讨论

尽管植物的再生能力已被广泛研究，但叶片的再生或局部伤口修复能力却很少被研究（Kuchen et al.，2012；Radhakrishnan等人，2020年）。我们描述了一种新的叶片维管再生测定的详细的逐步方法，可用于研究中脉对局部损伤的反应。我们以前的研究表明，中脉的机械性断开，造成400以下的间隙µm（样品清除后测量），可通过再生血管链桥接（Radhakrishnan等人，2020）。当受伤的血管组织退化时，新合成的血管系统可以重新连接断开的血管束或将切端连接到最近的侧静脉（图1b）-

f）是的。无论哪种方式，重新连接确保恢复叶片维管网络和运输之间的叶片和植物体的其余部分。但是，广泛的损害产生的差距大于400µm无法修复，从而否定了叶维管组织的功能恢复（Radhakrishnan等人，2020年）（图1p）。在这里，血管再生的伤口大小依赖性通过实施基于叶片中静脉形成的管道化假设的计算模型在硅片中重新得到（Rolland Lagan和Prusinkiewicz，2005）。根据导管化假说（Sachs，1991），生长素流量和生长素电导率之间的正反馈导致导管化生长素流量，进而促进维管组织的分化。与我们的实验观察结果（图1p）一致，计算模型表明，新血管链的形成确实取决于细胞基质（类似于叶片）中形成的开口（模拟伤口诱导的间隙）的大小。该模型还预测，大面积损伤后血管再生的失败可归因于较大创伤导致的生长素通量和浓度的中断（视频5）。这种破坏会阻碍生长素的适当通道化，并阻止再生维管链的有效分化。有关数学模型的方程式和其他相关细节见补充资料（补充资料1，视频3-5）。我们的结果表明，除了动物细胞和单细胞网柄菌外，修复过程对伤口大小的敏感性在植物中也是保守的（Pervin et al.，2018）。

在证实了血管再生对伤口大小的依赖性之后，我们接下来研究了再生反应是否依赖于受伤植株的年龄。在许多高等动物中，逐渐老化与再生能力降低有关（Yun，2015）。为了探讨年龄如何调节叶片的再生反应，我们对年龄为310dpg的植株进行了切割。在3株dpg植物的微小叶片上进行切割是一项繁琐的工作，经常会对叶片造成过度损伤。经比较，3株dpg植株的叶片再生效率低于5株dpg植株（图1g，1o）。4-6 dpg龄植株的叶片表现出最高的再生效率，这是研究叶片维管再生的最佳年龄（图1h-j，1o）。虽然在较老和较大的叶片上进行切割比较容易，但再生效率急剧下降，10株dpg植株的叶片完全无法再生（图1k-o）。值得注意的是，即使损伤引起的间隙小于400µm、这些老叶的维管再生受阻（图1l-n）；因此，我们的数据表明，受伤植物的维管再生效率随着年龄的增长而降低。

植物和动物的再生研究表明，即使在特定器官内，对损伤的再生能力也可能不同（Durgaprasad et al.，2019；摩根，1902年）；因此，我们接下来研究了切口在生长叶片上的位置对叶脉再生效率的影响。为了分析这一点，我们沿着叶片的不同位置进行了切割，即叶柄、中脉的基端（靠近植物体轴）、中脉的顶端（远离植物体轴）和侧脉（图2a，2c-f）。最高的再生频率记录在中脉底端，尤其是第一和第二侧静脉之间（图2b，2d）。叶柄在切割时也表现出相似的再生效率，并且经常导致在损伤时形成多股（图2b，2c）。然而，由于样品采集过程中叶柄处的叶片被切除，切口部位和再生的维管束偶尔会受到损伤，导致有价值的样品丢失。此外，由于在叶柄上进行的切割导致多个林分的形成而不是单个林分的再生，因此更适合在叶片上进行损伤，因为研究涉及实时跟踪单个再生链以研究维管链的识别、通信和重聚。在损伤其他部位后，我们观察到再生效率向中静脉和侧静脉的顶端区域急剧下降（图2b，2e-g）。

总的来说，我们的数据表明，叶片血管再生对伤口的大小、受伤叶片的年龄和切口在叶片上的位置是敏感的。

图2。维管再生取决于叶片损伤的位置。（a）叶片和叶柄切口位置示意图(b）叶片中不同位置（用（a）中的彩色框表示）的维管再生频率用图中相同的色条表示（b）叶柄（n=21，P=0.95，不显著[ns]）、基部正确位置（n=45）、中脉上端（n=42，***P=0.0009）、侧脉（n=21，***P=0.0002）(c-f）图像显示叶柄（c）、中脉基部（d）、中脉顶端（e）和侧脉（f）血管的切口。注意叶柄损伤后的多股形成（c）。红点表示再生血管束，黑色箭头表示切口位置。比例尺：50µm(g）梯度代表叶片的维管再生效率，中脉基部再生最大（以红色表示）。侧静脉和中静脉远端的再生频率降低。

视频3。在50×50个细胞的网格中形成静脉，没有缺失的细胞（模拟没有切口）

视频4。在基质中形成类似小切口的静脉

视频5。在基质中形成类似大切口的静脉

结论

我们的研究表明，4-6 dpg叶片对较小的伤口反应最有效（400）µ在叶片近端第一侧脉的连接处造成的。在采用这种方法研究其他植物物种的再生时，我们建议按照上述标准对方法进行标准化。

本实验将有助于探索叶片维管组织再生的机制。首先，分析可能会被证明是乏味的；然而，通过反复实践，这种方法可以在大量样本中灵活快速地进行。实验持续时间短（实验数据可在受伤后5天内收集）以及专用设备的可有可无性使其适合更大的科学界。如前所述（Radhakrishnan et al.，2020），该方法可与其他细胞和分子生物学技术结合使用，几乎没有标准化，从而增加了其实用性。

食谱

1. 清除溶液

答。在3毫升水中溶解8克水合氯醛

b。旋转溶液直到水合氯醛完全溶解

c。向溶液中加入1毫升甘油

注：溶液必须是新鲜制备的，以清除叶样品。它也用于安装样品的亮场共焦显微镜。

2. 半强度MS中等

答。向约850 ml Milli-Q水中添加2.165 g MS盐和10 g蔗糖

b。用1 N KOH将pH值调节至5.7，并补充至1 L

c。加入8g植物琼脂

d。高压灭菌介质（121°C冷却20分钟）并冷却至45-50℃左右°C。

e。加入1ml 100mg/ml过滤灭菌氨苄西林（培养基终浓度：100）µg/ml）至

1 L培养基，将50 ml倒入LAF内的每个无菌方形培养皿中

f。使冷却和凝固

致谢

K.P.承认印度政府生物技术部（DBT）的拨款[拨款]

BT/PR12394/AGIII/103/891/2014]和印度政府科学和技术部、科学和工程研究委员会（DST-SERB）[grant EMR/2017/002503/PS]，并感谢印度科学教育和研究所Thiruvananthapuram

（IISER-TVM）用于基础设施和财政支持。D.R.和M.M.M.承认大学资助委员会（UGC）的研究金。A.K.得到了印度科学教育和研究所Thiruvananthapuram奖学金的支持。A.P.S.和V.V.是科学和工业研究委员会（CSIR）研究金的获得者。M.A.感谢印度政府科技部生物技术部（DBT）授予

DBT博士后奖学金（DBT-RA计划）。K.R.M.和R.K.R.承认生物技术部（DBT）的资助。A.S.通过EMR批准号EMR/2016/007221，感谢印度政府科学与工程研究委员会的支持。我们感谢Aswathy Syam、Aleesha Jaleel和Kaustuv Ghosh对初步实验的帮助。

我们也非常感谢Bejoy Manoj在视频制作方面提供的技术帮助。

相互竞争的利益相互竞争的利益

提交人声明没有竞争或经济利益。

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