材料和试剂

1. 鼠笼：19.56厘米（宽）× 30.91厘米（长）× 14.94厘米（高）（型号#9，Thoren Caging Systems，Inc.，Hazleton，PA）

2. 线材盖（WBL7115SMD-AMG，Allentown Inc.，Allentown，NJ）

3. 贝塔片式硬木床上用品（Northeast Products，WF Fisher and Sons，Somerville，NJ）

4. Prolab异丙醇啮齿动物饲料（WF Fisher&Son，Inc.，目录号：LD5P75）储存于4°C级

5. 老鼠冰屋（Bio Serv，目录号：K3327）

6. Clorox清香消毒湿巾

7. 纸巾

8. 8周龄雌性C57BL/6N小鼠（Taconic Biosciences，纽约州日耳曼敦）

设备

1. 轻巧的无线鼠标滚轮（Med Associates，目录号：ENV 047）

2. 用于无线车轮的USB接口集线器（Med Associates，目录号：DIG-807）

3. PC计算机

绿色功能已关闭，因此显示器不会关闭，电脑不会休眠或进入睡眠状态，硬盘也不会关闭

4. 分析天平（1毫克）

5. 小型天平（0.1 g）（Fisher Scientific，目录号：0191933）

6. 白噪声机（Marpac Dohm双速）

7. 数字温度计（VWR，目录号：35519-047）

8. 外部灯（GE荧光灯柜下灯具）

9. 灯光定时器（室内24小时机械插座定时器，带2个插座）10。红色前照灯（带一个红色LED的电源前照灯）

软件软件

1车轮经理（悉尼威立雅州圣奥尔本市医疗联合公司SOF-860）

程序

1. 从Taconic Biosciences订购8周龄雌性C57BL/6N小鼠。

2. 到达后，用贝塔芯片床上用品、异丙醇食品、水瓶和冰屋将家鼠（3-4只/笼）分组。将笼子放在专门用于ABA测试的温度控制室中，白噪声机高开，以尽量减少动物设施噪声的暴露。将光定时器设置为在整个实验期间使用的12小时光/暗循环。如果顶灯不能由计时器控制，请将其“关闭”，并使用插入机械计时器的外部荧光灯（18-22英寸）控制灯光循环。所需的灯光数量将由房间大小决定。两个荧光灯足够一个有两个架子的房间，总共有30个笼子。

3. 允许动物在一周内适应环境，不受限制地获取食物和水。

4. 开始实验（到达后一周）

答。称量小鼠体重并将其分配到四组中的一组，在各组间平衡重量。

通过测试每组获得的信息在数据分析部分的注释中概述。一。基于活动的厌食症（ABA，自由运动的转轮，食物限制）。限食对照组（FR，锁轮，限食）iii.轮控组（WH，自由行走轮，不限食）iv.家笼对照组（HC，锁轮，不限食）

b。单独/单独饲养小鼠，带有自由移动的轮子（ABA和WH组）或用销钉锁定的轮子（FR和HC组）。向所有团体随意提供食物和水。

c。笼子的设置：用Clorox擦拭运转轮上的每一块，去除所有气味® 用纸巾擦干。将车轮底座平放在保持架底部，并用垫层覆盖。调整电线盖的方向，使老鼠不用坐在轮子上就可以接触到食物或水（图1A）。确认车轮没有接触导线盖并且可以自由转动（图1B和视频1）。限制所用垫层的数量，使垫层在车轮下方的堆积不会阻止车轮转动。

图1。笼内运行轮的俯视图（A）和侧视图（B）。箭头表示导线盖和车轮尖端之间的空间。

视频1。鼠标在轮子上运行的代表性视频。请注意，为了便于说明，已将水瓶和食物取下。

d。轮子设置：一次识别一个电脑上的鼠标（轮子管理软件）。打开一个滚轮（顶部开关），将相应的鼠标ID输入计算机，将滚轮放入笼子中，然后将鼠标放入装有异丙醇食物和水的笼子中，然后再打开下一个滚轮。输入所有ID后，单击“开始”

“文件”菜单下的“采集”。

5. 基线数据收集（3天）：

答。基线第1天：单独饲养小鼠两天后（图2A），在黑暗周期开始前立即称量小鼠和食物的重量。应使用不同的容器（仅限老鼠和食物），以免粪便和尿液与食物接触。为了尽量减少每个笼子被移动的次数，先称量老鼠的重量，然后再称量同一笼子里的食物。将鼠标从笼中取出时，请将手指放在运行的滚轮上，以防其旋转。

b。基线检查第2天：遵循与前一天相同的程序。

c。基线检查第3天：按照与前一天相同的程序进行。随后，在黑暗周期开始后2小时，从ABA和FR组中移除食物。如果房间没有上方的红灯，请戴上红色前照灯进入房间，以免干扰明暗循环。

6ABA数据收集（10天）：

答。制备：每天记录大颗粒食物（9-11克）的重量，精确到每只ABA和FR小鼠的0.01克。使用新鲜的颗粒，以防前一天留下香味。在室温下将食物储存在标有鼠标ID的杯子/容器中，并用箔纸覆盖。

b。在黑暗周期开始前，对HC和WH组的所有小鼠和食物进行称重。

c。通过单击“文件”菜单下的“导出数据”，在不中断数据收集的情况下备份数据。

d。将贴有标签的食品容器放在相应的笼子前面。

e。一旦灯关闭，将预先称重的颗粒放在ABA和FR小鼠头顶的食物箱中，然后离开房间2小时。如有必要，在进食时戴上红色前照灯。

f。将当前体重除以基线检查第3天记录的体重，再乘以100，计算出基线检查时的体重百分比（%B）。任何体重为基线体重75%或更低的老鼠都有死亡的危险，必须从实验中移除。

g。食物供应2小时后（黑暗循环的前2小时），从ABA和FR组的小鼠中取出食物颗粒，放置在标记的容器中，并用铝箔覆盖。进入ABA房间时不要打开顶灯；必要时佩戴红色前照灯。在房间里，装满需要从实验中移除的老鼠的食物箱（约40克食物）(≥ 25%体重减轻）。

h。记录ABA组和FR组的食物丸摄入后重量为0.01 g，并计算每只小鼠在2小时食物供应期内的摄入量。扔掉部分吃过的食物，第二天称新鲜食物的重量。

一。每天重复上述步骤，连续10天。

j。在ABA第10天，在2小时无限量进食后，将所有剩余的小鼠从实验中移除。

数据分析

1. 体重数据

答。在所有10天的食物限制期间，对ABA和FR组进行生存分析（如Kaplan-Meier）（图2B）。这是一种比较各组的方法，基于他们何时减掉25%或更多的基线体重并从实验中移除。存活率表示各组中每天仍在实验中（即未移除）的动物百分比。早期从实验中移除表明对ABA有更高的脆弱性。

b。对于每天的食物限制，计算各组的平均基线百分比（%B）体重（图2C）。假设小鼠在不同的时间被移出实验，使用线性混合效应模型来分析数据。

图2。实验时间线（A）、存活曲线（B）和体重数据（C）。存活曲线内的数字表示每天禁食时存活的老鼠数量。误差线表示扫描电镜；n=19（ABA），n=19（FR），n=12（homecage），n=14（车轮控制）。

c。识别脆弱和弹性表型：在ABA和FR组内，将从实验中移除的小鼠描述为“易受伤害的”，而在整个实验过程中保持的小鼠描述为“有弹性的”。通过对禁食天数内的体重进行比较，可以发现易受伤害小鼠的体重迅速下降，而有弹性小鼠的体重保持不变（图3）。

图3。（A）活动性厌食症（ABA）和（B）限食对照组（FR）禁食天数内小鼠个体体重（轻痕）。弹性（虚线）和脆弱（实线）小鼠的组平均值以粗体显示。n=10脆弱ABA，n=9弹性ABA，n=6脆弱FR，n=13弹性FR。

2. 食物摄入数据

答。在整个10天的实验中平均食物摄入量，并使用单因素方差分析进行组间比较（图4A）。

b。使用双向方差分析（图4B）比较整个10天实验中脆弱和有弹性的ABA和FR小鼠的平均摄入量。

c。计算实验中每只动物最后一天之前的平均摄入量和移除当天的摄入量。使用双向方差分析比较脆弱和有弹性的ABA和FR小鼠（图4C）。

图4。食物摄入数据。答。各组小鼠在禁食10天内的平均摄食量。B。ABA和FR组中脆弱（固体）和弹性（孵化）小鼠的平均食物摄入量。C。ABA组和FR组中脆弱（三角形）和弹性（方形）小鼠在移除前与移除当天的平均食物摄入量*P<0.05***P<0.001；†P<

0.01与移除前的弱势群体相比。误差线表示扫描电镜。

3. 行走轮数据

答。使用车轮管理器软件（SOF-860，Med Associates，Inc.，St.Albans，VT）提取行驶车轮数据。计算轮控、脆弱ABA和有弹性ABA小鼠在整个10天实验中的平均总跑步量。使用单因素方差分析进行分组比较（图5A）。

b。分别计算各组的平均光周期（12小时）和暗周期（12小时），并使用单因素方差分析进行组间比较（图5B、5C）。

c。可选项：计算连续两天实验中光周期和暗周期的最大增量。我们的研究表明，ABA的脆弱性与光周期运行的突然增加有关，如2天内运行的显著增加所示（图5D）。这种光周期运行的突然增加可以发生在任何一天的食物限制，但在实验前1-3天从大多数小鼠。

图5。车轮运行数据。（A）总的，（B）光周期，和（C）黑暗周期运行的平均数横跨食物限制的日子(D）在明暗循环中，连续两天（按组平均）车轮运行的最大增加量*P<0.05**P<0.01***P<0.001。误差线表示扫描电镜。

d。可选项：在实验的每一天（基线第1天到ABA第10天），为每只老鼠将转轮数据整理成5分钟的箱子。在点图中绘制数据，x轴上显示白天时间，y轴上显示车轮转数；按组显示颜色代码并指示明暗周期（图6A）。此外，将转轮数据整理成1小时的数据块，然后对所有基线日（图6B）和实验/禁食日（图6B）进行平均

6C）每组。得到的图表显示了在跑步中的群体差异

24小时的昼夜节律周期可以用来表征光周期运行的程度。

在呈现食物之前的跑步被称为食物预期活动。

图6。分析24小时昼夜节律周期的转轮数据。答。所有小鼠在5分钟箱中的轮在实验日内运行的点图。黑色和灰色条分别表示暗周期和光周期。红色箭头表示开始限食（FR）。B-C。（B）基线日和（C）实验日的24小时组平均值。虚线表示6小时（开灯）到18小时（熄灯）之间的光周期。误差线表示扫描电镜。

笔记

程序说明：

1. 有人看到老鼠饿了就吃Bed-o'Cob床上用品，这就是为什么这个方案使用beta芯片床上用品。

2. 噪音会刺激老鼠的活动，包括跑步行为。为了产生可复制的数据，使用专门用于ABA测试的菌落室，以便实验者是每天唯一进入房间的人，并且噪音最小化。

3. 当灯亮起时，实验者只应在黑暗周期开始前不久进入房间，称量老鼠和食物的重量。提前进入房间可能会吵醒老鼠，导致它们奔跑，混淆结果。在这个有限的时间段内给一大群老鼠称重是一个挑战。我们建议在灯熄灭前45分钟内进入房间，我们发现这足够让老鼠体重达到20-30只，这取决于它们是否能无限获取食物。

4. 室温已被证明会影响对基于活动的厌食症的脆弱性（Gutierrez等人，2002年）。ABA应在温度严格控制的室内进行检测。在我们的实验中，室内温度每天监测，范围为70-75℃°F。

5. 对ABA的脆弱性因小鼠的年龄和品系而异（Gelegen等人，2007；Klenotich和Dulawa，2012年；Klenotich等人，2012年）。使用与本方案中规定的不同的品系和/或年龄组可能会影响脆弱和有弹性小鼠的分布，因此所有小鼠可能只表现出一种表型。

6. 由于神经性厌食症在女性中比男性更为普遍，因此该方案使用雌性小鼠。使用雄性小鼠可能会导致不同的结果。

7. 绝大多数已经减掉了25%的基线体重的老鼠会在一夜之间康复；然而，并非所有的老鼠都是这样。如果老鼠显得特别虚弱，我们建议在恢复期将湿润的食物颗粒放在笼子的地板上（除了装满食物箱）。

8. 给禁食的老鼠吃最大粒的食物。这将减少一小块食物在喂食过程中落入笼子的可能性。

数据分析说明：

1. 比较ABA组和FR组的食物摄入量可以发现，当食物只能供应2小时时，车轮转动对消耗的影响有多大。比较ABA组和WH组的车轮运动，可以发现食物限制对活动水平的影响有多大。HC对照组在没有食物限制和/或车轮转动的情况下提供体重和食物摄入量的测量。

2. 图1-6所示的所有数据之前都已公布（Beeler等人，2020年）。

致谢

这项工作得到了国家药物滥用研究所DA046058（JAB）、国家精神卫生研究所R21MH114182（NSB）、国家卫生院少数民族健康和健康差异研究所G12MD007599（NSB）的资助，PSC-CUNY奖励计划由专业人员大会和纽约城市大学（JAB&NSB）以及Klarman家庭基金会饮食失调研究资助计划（JAB&NSB）共同资助。所述方案改编自先前的研究，其中在其他小鼠品系中测试了基于活动的厌食症（Klenotich和Dulawa，2012；Klenotich等人，2012年）。

相互竞争的利益相互竞争的利益

提交人没有财务或非财务利益可供报告。

伦理学

该方案由美国亨特学院（NB厌食症，9/1/20-8/31/23）和皇后学院（ACUP#164，2/26/20-2/25/23）的机构动物护理和使用委员会批准。

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