材料和试剂
1. 96孔板（96孔透明；Costar，目录号：3599）
2.一次性陪替氏d ISH（90毫米;江苏康健医疗产品，目录号：161-0901）
3. 96孔板用0.22 -微米滤膜小号（MultiScreenHTS GV滤板，0.22微米，透明的，无菌; Millipore公司® ，目录号：MSGVS2210）
4.铜绿假单胞菌PAO1 （Ghysels等，2005）。
5.洋葱伯克霍尔德菌H111 （Sathe et al。，2019）
6.绿脓杆菌PAO1 Δ PVDD Δ pchEF （Ghysels等人，2005）
7.绿脓杆菌H111 Δ orbJ Δ pchAB （萨特等人。，2019）
8.胰蛋白（（OXOID，目录号：LP0042）
9.大豆p eptone（化学试剂有限公司的国药集团，上海测试，CATA登录号：69047737）
10. NaCl（南京化学试剂有限公司CAS：7647-14-5）
11.琼脂（福建金燕海洋生物技术有限公司，成峰。CAS：9002-18-0）
12. K 2 PHO 4 （南京化学试剂有限公司CAS：7778-77-0）
13. MgSO 4 · 7H 2 O（南京化学试剂有限公司CAS：10034-99-8）
14.甘油（国药集团化学试剂有限公司，上海测试，目录号：10010618）
15 酪蛋白一个的CID（DSLAB，CATA登录号：18A0050）
16. FeCl 3 （国药集团化学试剂有限公司，上海测试，目录号：10011918）
17. Tris-HCl（1 M Tris-HCl，pH = 6.8，BL514A，100 ml）
18岁明胶（国药集团化学试剂有限公司，上海测试，目录号：10010328）
19.铬天青S（铬天青小号; Fluka公司，CATA登录号：72687-25G）
20. HTDMA（VETEC，目录编号：V900413-100G）
21.无水哌嗪（哌嗪，Reagentplus 99％，Sigma-Aldrich，CAS：110-85-0）
22.葡萄糖（南京化学试剂有限公司CAS：50-99-7）
23。酵母提取物（酵母提取物; OXOID，CATA登录号：LP0021）
24.牛肉提取物（国药集团化学试剂有限公司，我开，目录号：69004461）
25岁甘油（南京化学试剂有限公司CAS：56-81-5）
26. 1/10胰蛋白try大豆琼脂（1/10 TSA）（请参阅食谱）
27. 1/10胰蛋白try大豆汤（1/10 TSB）（请参阅食谱）
28. MKB介质（请参阅食谱）
29.富含铁的培养基（请参见食谱）
30. MS缓冲溶液（请参阅食谱）
31. CAS分析溶液（请参阅食谱）
设备

96通道手动移液工作站（苏州SinoAnalysis仪器有限公司，SinoAnalysis ，SC9000）
微孔板离心机（湖南赫希仪器公司，台式低速离心机，TD5A）
常数-温度摇床（MIN泉，MQD-BIR）
酶标仪（SpectraMax M5，美国加利福尼亚州桑尼维尔）
-80°C冰柜（Haier，立式超低温储物盒，DW-86L62，2013年型号）
离心机（Eppendorf AG，22331汉堡，5424EH062551）
移液枪（Eppendorf Research plus）
高压釜（日本鸟取市MLS-3780 Tega SANYO Industry Co.，Ltd）
常数-温度和-湿度培养箱（新的幼苗，防水电热恒定-温度erature培养箱，GNP-9080BS-III）
天平（Sartorius，型号：BSA2202S）
Vortex（美国科学产业）

软件

R 3.1.2程序（https://github.com/shaohuagu/sidanalysis.git）
Excel 2016
SPSS 20.0
Adobe Illustrator CS5

程序

图URE 1.测定铁载体生产的

根际土壤采样
根际土壤样品从收集的番茄植株位于我Ñ在我们不同的领域。多余的土壤应轻轻地甩掉并丢弃；残留在根部的土壤被认为是根际土壤（Hu等，2016），应收集起来使用。

隔离根瘤菌
将1 g根际土壤与9 ml MS缓冲溶液混合在旋转振动台上（170 rpm ）在30°C下放置30分钟。
用无菌水将土壤悬浮液稀释至10 -5 -10 -6 g / ml的浓度。扩展 100个微升稀释土壤悬浮液在1/10胰蛋白so大豆琼脂（TSA）上。
48后-在30℃小时的温育在黑暗中，从每个根际土壤样品中随机选择32个分离株， restreak上TSA平板菌落纯化。
培养物的LL纯化分离物在100微升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）我ñ 96孔微量滴定板在30℃下用18小时振荡（以170rpm旋转摇动器）。
加100微升 30％（v / v）将甘油加入发酵液中并充分混合。小号撕开的根际细菌在- 80 ℃下。

测量根瘤菌的铁载体产量（图1）
ř通过转移5只evive菌株微升各自冷冻股成一个干净的96孔板含有195微升TSB每孔。在摇动（旋转摇床设置为170 rpm）下于30°C过夜培养细菌。
转移10微升过夜培养物到清洁含有190 96孔板微升MKB铁有限介质和MKB富含铁的平台。摇动（旋转摇床设定为170 rpm）在30°C下孵育48小时。
收获来自无细胞上清液的细菌培养物通过离心（4000转，在4℃下5分钟）和过滤（使用0.22 -微米的过滤器）。
使用铬的液体版本天青S（CAS）测定，在WH ICH 100微升无细胞上清液（三次生物学每个2150个土壤分离株的复制）加入到100微升 CAS测定溶液在96孔板用一个96通道手动移液工作站。100添加微升MKB铁有限meduim或MKB富含铁的培养基至100微升CAS测定溶液，作为对照组。
将反应混合物在不搅拌的情况下在室温下孵育2小时。
在OD 630的的反应混合物（A）和所述对照组（氩）中的溶液在室温下使用读板器（M5的SpectraMax）测量。铁载体在CAS介质中引起颜色变化，从而降低OD 630的测量值。
铁载体生产原为孔定量达ED使用下列公式：1 -甲÷氩气。
介质成分中的有机酸和其他分泌的化合物也可以结合铁; 因此，必须估算出不是由铁载体引起的CAS信号背景。我们评估使用定义的铁载体缺陷型突变体的该信号从背景两个物种（铜绿假单胞菌PAO1 ΔpvdDΔpchEF和B.新洋葱伯克霍尔德杆菌H111 ΔorbJΔpchAB ）（Ghysels等人，2005 ;萨特。等人，2019）和其相应的使用相同的野生型如上所述的协议。然后，我们平均两个铁载体缺陷型突变体的CAS背景信号，将其用作截止到我们的2150中区分非生产者铁载体生产者根际细菌（图2甲）。

数据分析

根瘤菌的分离
在TSA平板上，随机采摘的单菌落中几乎有16％不能单独生长。最后，2 ，150个纯化菌株从80根际土样中分离。

测量铁载体生产的根瘤菌
用于计算的相对生产铁载体的小号-甲÷铁载体单元= 1：使用此公式获得的Ar ，其被用来估计在所有2150个细菌分离株的上清液中分泌的铁载体的水平。该测定用作铁载体生产的代理，并表明，高达产生铁载体的菌株95％，因为它们的CAS值超过第OSE铁载体缺陷型控制菌株（图2 B ）。估算背景CAS值很重要，因为此测定法还可以测量其他有机铁结合化合物的结合活性。当被富含铁的条件下重复中科院实验中，我们发现了铁限制的条件下，上调铁载体生产的铁载体生产的99％的较下的富含铁的条件。在铁的限制下，铁载体的产生遵循双峰分布，分离株产生大量或少量的铁载体（图2 B ）。这些结果表明，铁载体的生产是在铁限制条件下在整个检查的分类单元和采样位点上的普遍性状。

图URE 2.铁限制和富含铁的铁载体下生产的根际细菌的条件

笔记

在MKB培养基的制备过程中，所有用品，包括玻璃瓶，量筒，玻璃棒，和称重匙，必须是无铁。玻璃器皿必须浸泡在6 M盐酸中过夜，并用蒸馏水冲洗几次以除去铁。
两个都 MKB介质解决方案需要单独准备和在115°C高压灭菌30分钟。

菜谱

1/10胰蛋白try大豆琼脂（1/10 TSA）
1.5 g L -1胰蛋白tone
0.5克L -1大豆蛋白
0.5克L -1氯化钠
15克L -1琼脂
pH值7.0
1/10胰蛋白so大豆汤（1/10 TSB）
1.5 g L -1胰蛋白tone
0.5克L -1大豆蛋白
0.5克L -1氯化钠
pH值7.0
MKB培养基
2.5克L -1 K 2 HPO 4
2.5 g L -1 MgSO 4 ·7H 2 O
15 ml L -1甘油
5.0 g L -1酪蛋白氨基酸
pH值7.2
富铁培养基
将FeCl 3添加到MKB培养基至终浓度为50μM
MS缓冲液
50 mM Tris - HCl，pH 7.5
100毫米氯化钠
10毫米硫酸镁4
0.01％明胶
CAS测定溶液
将1.5 ml 1 mM FeCl 3添加到7.5 ml 1 mM Chrome azurol S中，并充分混合。甲DD 50毫升4-毫摩尔/ L HTDMA而搅拌，然后加入30毫升1 M哌嗪溶液。˚F inally ，加去离子水至100毫升

致谢

这项研究得到了中国国家自然科学基金（ZW的授权号41922053，TY的41807045和YX的授权号31972504）和江苏省自然科学基金（TY的BK20180527和ZW的授权号BK20170085）的资助。实验室[R hizosphere中号ICRO生态学（LorMe南京农业大学），资源与环境科学学院，保证了该实验的顺利完成。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本文涉及的实验程序符合道德和道德要求，并且没有对社会或环境造成不利影响。

参考

Ghysels，B.，Ochsner，U.，Mollman ，U.，Heinisch，L.，Vasil，M.，Cornelis，P.和Matthijs，S.（2005年）。在铜绿假单胞菌PIRA基因编码ferrienterobactin和合成儿茶酚类似物的第二受体。 FEMS Microbiol Lett 246（2）：167-174。
胡建伟，魏正中，弗里曼，副院长，顾SHSH，王XF，艾森豪尔，N.，杨，TJ，马，J.，沉QR，徐，YC和Jousset，A.（2016 ）。益生菌多样性增强了根际微生物组功能和植物病害抑制能力。mBio 7（6）。
Kaeberlein ，T.，Lewis，K.，Epstein，SS（2002）。在模拟自然环境中的纯培养物中分离“无法培养的”微生物。科学296（5570）：1127-1129。
Kloepper，JW，Leong，J.，Teintze，M。和Schroth，MNJCM（1980）。假单胞菌铁载体：解释抑制疾病的土壤的机制。4（5）：317-320。
Miethke ，M.和Marahiel ，MA（2007）。基于铁载体的铁捕获和病原体控制。微生物分子生物学评论71（3）：413-451。
Sathe，S.，Mathew，A.，Agnoli ，K.，Eberl ，L.和Kummerli ，R.（2019）。遗传结构限制了新细菌伯克霍尔德菌中铁载体合作的开发。Evol Lett 3（6）：610-622。
Schwyn ，B。和Neilands ，JB（1987）。用于检测和测定铁载体的通用化学测定法。肛门生物化学160（1）：47-56。