材料和试剂

注：特定供应商目录编号，即我们使用，给出了许多下面列出的试剂; 可以替代其他供应商的同等质量的试剂，并获得可比较的结果。需要细胞培养的标准材料和试剂，下面没有明确列出。试剂按协议中的大致使用顺序列出。

培养管（VWR，目录号：60818-667）
50 ml离心管（VWR，目录号：89039-656）
1.5 ml离心管（VWR，目录号：20170-038）
Lysing Matrix B，2 ml管（MP Biomedical，目录号：116911050）
2 ml离心管（VWR，货号：20170-170）
C18小号EP -P AK （沃特斯，目录号：WAT051910）
Omix C18技巧（安捷伦，目录号：A57003100）
pH值指示或纸张
鲍曼不动杆菌（A. baumannii ）ATCC 17978菌株
Luria-Bertani（LB）汤（Fisher，目录号：BP1426）
Na 2 S（Sigma，目录号：407410）
Na 2 HPO 4 （Fisher，目录号：S374-500）
KH 2 PO 4 （Fisher，货号：P285-500）
KCl （Sigma，目录号：7300-500GM）
NaCl（Macron，目录号：7581-06）
2- M邻氨基苯磺酸，游离酸（MES）（GoldBio ，目录号：M-095-1）
液氮
Bradford试剂（Thermo，目录号：23238）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A4503）
3 kDa截止浓缩器（Millipore Sigma，目录号：UFC500396）
尿素（Fisher，货号：U15）
碳酸氢铵（ABC）（j 。Ť 。贝克，目录号：3003-01）
EZ- Link TM碘乙酰基PEG2-生物素（生物素化碘乙酰胺，BIAM）（Thermo，目录号：21334）
测序级T胰蛋白酶（Promega，货号：V5117）
亲和素丙烯酰胺树脂（Thermo，目录号：53151）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）（ChemImpex ，目录号：23004）
碘乙酰胺（IAM）（Sigma，目录号：I1149）
三氯乙酸（TCA）（西格玛（Sigma），目录号：91228）
稀d的解决方案的有机酸（0.1-10％）的质谱分析法，常用例如，三氟乙酸或甲酸
LC-MS级乙腈（OmniSolv ，目录号：AX0156）
LC-MS级水（OmniSolv ，目录号：WX0001-1）
Na 2 S库存（请参见食谱）
磷酸盐-缓冲液（PBS）（见食谱）
裂解缓冲液（请参见食谱）
Sep-Pak水性缓冲液（请参见配方）
Sep-Pak有机缓冲液（请参阅食谱）

设备

注意：需要典型的生物化学实验室设备；因此，下面没有明确列出。以大多数设备的目录号为例；如果功能相同，则可以替代其他制造商的产品。设备按协议中的大致使用顺序列出。

摇床
斯派克光电仪和比色皿
各种C语言entrifuge š与所述能够离心的适当的转子一（取决于各种体积从1.5毫升至50ml或更大的细胞培养物体积）
水浴
Bead Ruptor 12均质机（Omni，型号：19-050A）
厌氧Ç hamber（真空气氛公司，型号：HE-453-2-245）
转子-巴恩斯特德Thermolyne Labquake振动筛（巴恩斯特德国际公司，型号：400110）
真空歧管（Thermo Fisher Scientific，型号：60104-232）
ISS 110 SpeedVac系统（Thermo Fisher Scientific，型号：ISS 110）
捕获柱：Symmetry C18捕获柱（180微米×20毫米，5微米）
分析柱：的nanoACQUITY HPLC HHS T3分析柱（75微米×150毫米，1.8微米）
轨道阱融合TM荧光闪烁TM Tribrid TM质谱仪（赛默飞世尔科技）接口具有纳米流动液相色谱（LC）系统（例如，Thermo Scientific的简易NLC 1200）

软件

UniProt
蛋白质组发现者2.1（Thermo Scientific）

程序

细胞培养
条纹A.杆菌ATCC 17978到LB琼脂在37℃下过夜从冷冻甘油储备并孵育板。
使用单菌落接种3 ml LB肉汤，并在37°C摇动过夜。
注：实验应该在一式三份生物和A.执行杆菌我S中的液体生长-到-的1空气比：5，例如，在10毫升LB一个50 -毫升离心管中。

将其在10 ml LB中以1:50的比例稀释过夜培养物，并生长大约1小时，直到OD 600 = 0.1 ，此时应将培养物以1：100的比例稀释到装有250 ml LB的无菌烧瓶中，并在37°C振摇直至OD 600 = 0.2。
注意：总共将收集六个样本；野生型的生物，一式三份（WT）未治疗的和一个WT的一式三份生物用Na 2 S.培养物的体积所需取决于选择多少蛋白质需要针对工作流的生物体。通常，每次重复需要2 mg总蛋白，但根据所用MS仪器的灵敏度，可能还需要更多。
加入Na 2 S到六个培养物中的三个，终浓度为0.2 mM，并在37°C下再孵育30分钟。然后继续执行以下步骤。
将所有培养物在4°C下以4,226 × g离心15分钟，弃去上清液，然后将沉淀置于冰上。
注：未处理的培养物中，应当OD离心600 = 0.2和Na 2个小号-处理的培养物应当离心30分钟后添加的Na 2 S.

用5 ml冷PBS洗涤细胞沉淀，在4,226 × g下于4° C离心15分钟，并弃去上清液。
洗涤吨他细胞用1ml冷的PBS丸粒，转移到1.5 -在毫升Eppendorf管中，离心分离机19090 ×克3分钟，并弃去上清液。
注：细胞沉淀可以储存在- 80℃直至准备就裂解。

细胞裂解
注意：步骤B1应使用已脱气，用氩气吹扫并存储在厌氧室内的缓冲液。如果没有厌氧室，则每次都要准备新鲜的缓冲液，并对缓冲液进行脱气并用氩气吹扫。步骤B3和B 5在厌氧室内进行。可将步骤B4中使用的等分试样从培养箱中取出以完成测定。

将沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液（请参见食谱）中，并在液氮和37°C水浴中冷冻/融化5次。
注意：裂解缓冲液可以被修饰，例如，洗涤剂，盐，pH等对重要的是确保使该缓冲器被脱气并用Ar清洗坤（优选地被存储在厌氧室），以尽量减少暴露于氧气中的步骤B1 -B2 ，大约需要1小时。

Ť转让（BOT）吨他LYS吃到基质B裂解管和抖动上45秒（5个均化器S于在6.8米，90秒关的间隔）/ s和4℃。
Ť转让（BOT）吨他样品到厌氧培养室（<1ppm的Ò 2 ），并使用15分钟标准微量在4℃下离心分离。转移上清液至干净1.5 -毫升Eppendorf管中，再次离心，并转移到一个干净的管，以确保其没有细胞碎片的存在。
除去2-10微升上层清液，进行一个标准的Bradford测定法来确定使用牛血清蛋白浓度白蛋白作为蛋白标准。
根据Bradford分析，将每次重复量相当于6 mg蛋白的裂解物等分。剩余的溶胞产物可以是快速冷冻并储存于- 80℃直至整个蛋白质组分析（方法E）。

烷基化和胰蛋白酶消化
注意：步骤C1-C3应在厌氧室内进行。如果没有可用的缓冲液，请使用按照步骤B中的说明制备的缓冲液，并尽量减少样品在氧气中的暴露。Alternat IV Ë缓冲交换协议可被取代，以减少时间。

缓冲从步骤B5在厌氧培养室中使用3交换样品kDa的切割-通过的重复循环关闭浓缩器的另外在100mM ABC 8M尿素的在4℃下，然后离心10分钟。重复次是过程7-8次。当完成时，将样品转移到一个干净1.5 -毫升管，通过反转集中器，和离心机Ë 30秒。
可选：在100mM ABC 8M尿素可被添加以增加的样品体积（不超过500μl的总被推荐）。

注：缓冲EXCHANG的其他方法è可以使用。

在室温避光下加入2 mg BIAM，孵育90分钟。
缓冲液交换的样品一样描述以前使用100mM的ABC（步骤C1），直到尿素的浓度为约1M的（或更小），并转移到一个干净的试管中。
可选：甲dditional缓冲器可被添加以增加的样品体积（不超过500μl的建议）。

从一个取出样品一个erobic室，加60微克胰蛋白酶，并检查该样品的pH是通过添加1个基本微升样品至pH indicat或纸; 添加一个额外的100mM缓冲ABC如果需要，调节pH。公司乌瓦特在37℃的水浴将样品18小时。
淡化肽和删除通过运行18月未消化的蛋白质-乐p rotocol。
样品制备
酸化的使用三氟乙酸或甲酸的10倍％的溶液的样品到一个终浓度的0.2％，并检查所述pH为酸性使用pH试纸; 我若未连接酸性，添加更多的酸。
沉淀用microcentrifu不溶物质GE操作在16363 ×克15分钟，在4℃和转移的上清至干净1.5 -毫升管。
Sep-Pak P赔偿
使用干净的剃须刀，将Sep - Pak的长边修剪到墨盒上。
修剪短边一半；吨他的短边是其中注射器将被附接。
条件的Sep-Pak通过使20毫升有机缓冲液（见配方），接着加入20毫升缓冲水溶液中用20（参见食谱）-毫升注射器。
注：确保空气不拉或推穿过药盒这里或在任何后续步骤。

使用3应用样品-毫升注射器，冲洗用1ml含水缓冲液的样品管，并适用于墨盒。
洗的用30毫升含水缓冲液盒。
用1.6 ml有机缓冲液从柱上洗脱肽。
干燥的样品在一个SpeedVac中在500集中，重悬微升100mM的ABC。

链霉亲和富集和洗脱过硫化物-含有肽
在845 × g下将1 ml亲和素丙烯酰胺树脂离心1分钟。丢弃上清液。
注意：树脂在50％的缓冲液中，因此需要2 ml才能达到1 ml的总树脂量。确定p的量（以mg计）所要求的树脂的体积rotein用于每个样品，根据该制造商的规格。

通过重悬于1 ml 100 mM ABC中，以845 × g离心1分钟，并除去上清液，使树脂平衡3次。
将重悬的肽（上面的步骤C5）添加到树脂中，并在转子上于室温下孵育1小时。
用75毫升2M NaCl的在100mM ABC洗涤树脂，在37℃水浴中加热，使用真空歧管中。
用在37°C水浴中加热的15 ml 100 mM ABC洗涤树脂。
重悬在1ml的100mM ABC，转移到一个干净的1.5树脂-毫升管，并添加TCEP至20中的终浓度毫米。在转子上于37°C孵育1小时。以845 × g离心1分钟，然后将上清液转移到干净的试管中。
重复步骤D6和上清液组合成的ê luent。
将37 mg IAM添加到上述步骤D6-D7的2 ml混合洗脱液中，并在避光的室温下孵育45分钟。
使用C18 OMIX尖端浓缩物和脱盐的使用标准方案的肽和通过LC-MS / MS（方法F）分析。

整个蛋白质组分析以进行数据归一化
干25 -从在裂解物（方法B）蛋白的微克部分SpeedVac中浓缩。
ř esuspend p在100 roteins微升含有50mM IAM和5mM TCEP 8M尿素的100mM ABC和我ncubate在室温下在黑暗中45分钟。
P recipitate p由加载roteins荷兰国际集团25微升100％TCA（20％（：v v和））放置样品在-20℃下1个小时。随后，离心的S amples在19090 ×克20分钟，在4℃和废弃吨他上清液。
洗涤吨他与500小球微升冷丙酮离心再次在19090 ×克20分钟，在4℃。
干燥在S在amples SpeedVac中浓缩，再悬浮于10微升的100mM ABC 8M尿素，稀至1M尿素用100mM ABC，并在37消化过夜℃下通过阿迪纳克1：100（重量/重量）胰蛋白酶的比例。
使用标准协议用C18 Omix吸头对肽进行脱盐，并通过LC-MS / MS（程序F）进行分析。

质谱
注射1点微克在0.1％甲酸到HPLC系统和负载的肽到对称C18柱捕获（180微米×20毫米，5微米）。
洗脱在p使用eptides的nanoACQUITY HPLC HHS T3分析柱（75微米×150毫米，1.8微米）与基于乙腈梯度（溶剂A：0％乙腈，0.1％甲酸;溶剂B：80％乙腈，0.1％甲酸），流速为400 nl / min。使用90 -分钟梯度; 0-0.5分钟，0-14％B：如下 0.5-72分钟，14-50％B；72-74分钟，50-100％B；74-77分钟，100％B；77-78分钟，100-0％B；78-90分钟，等度流动，0％B。
进行吨他电喷雾离子化与nanoESI在毛细管温度源的260℃和一个喷射电压的1.8千伏。
操作吨他在从属数据采集模式下的Orbitrap融合仪器与一个质量范围的350 - 2,000 M / Z 。选择吨在轨道阱他前体串联质谱离子（MS / MS）分析，用一个3 -在35％的碰撞能量秒周期时间使用HCD。设置I在ntensity阈5E3和所述为1的重复次数和动态排除的第30号第排除持续时间。
搜索t ，他对造成数据的A.杆菌ATCC 17978数据库（UniProt的蛋白质组发现者2.1 UP000094982，3780项）。支持T rypsin消化有两个未接切割特异性小号。集合T他对前体离子和碎片离子至10ppm和0.6质量大公差，分别。设置Ç arbamidomethylation半胱氨酸残基（CAM），其为固定的修饰。将蛋白N末端乙酰化，蛋氨酸的氧化，蛋白质N末端甲硫氨酸的损失，蛋白质N末端甲硫氨酸的损失和乙酰化以及焦谷氨酰胺的形成设置为可变修饰。甲llow一个总共三个变量的修改。

数据分析

对于persulfidation富集（步骤d），所述总肽的峰面积为每个蛋白含有所有半胱氨酸的肽我š用于估计的倍数变化和我š过滤以排除在任一条件的少于两个重复中发现的蛋白质。对于整个蛋白质组分析（过程E），发现大于或等于两个重复的肽段可用于计算每种蛋白质的总面积。分数丰度每种蛋白质的我S理论值相对于总裂解物（蛋白面积/总裂解物区）和用于估计的倍数变化。在两个数据集中，由零消除划分，未在的两个条件之一鉴定的蛋白质一个重新分配的肽区域或分数丰度我S以上一个数量级比所标识的至少丰富的蛋白降低的峰区域。

而在过去，我们分析蛋白质persulfidation在Σ比计，σ - [R （彭等人，2017b ），这方法显然不能区分增加persulfidation从增加的蛋白丰度的状态。因此，我们将过硫化（（S / N）SSH ）的变化归一化为蛋白质丰度（（S / N）Abund ）的变化，如E q所示。1.标准化过硫化变化大于4倍的那些被认为是潜在的监管目标。该显着性阈值可以根据鉴定出的蛋白质数量来改变。或者，这些数据可以在过硫化与丰度变化的对数-对数图中显示（图1B）。以这种方式，我们建议根据P值过滤蛋白质以了解过硫化的变化。通常，应用P < 0.05的阈值，但可以使用更严格的标准。我们注意到，P -值不能被分配至仅在鉴定的蛋白质无论是WT或Na 2小号-处理的细胞和不应该以琳从分析inated。在双对数图（图1B），已显著增加蛋白质persulfidation地位的任何一点-对-不改变蛋白质丰度或降低丰度被认为是蛋白质的强有力的候选人监管对象persulfidation ，这就需要用生物化学方法验证使用纯化蛋白质。

等式 1个

ñ OTES

虽然这个协议比较的野生型未经处理的细胞与0.2mM的钠2小号-处理的细胞，不同量的Na 2 S，温育时间（多于或少于30分钟），或其它的硫供体，例如，小分子ħ 2 S或细胞内过硫化物供体（Walsh and Giedroc ，2020）可用于研究蛋白质组过硫化。但是，我们注意到，在此工作流程中，由于外源性硫化物处理而被检测为被过硫化的半胱氨酸中的绝大多数（≥85％）也在未处理的细胞中被过硫化，这与蛋白质组在成倍增长的细菌中的显着“背景”过硫化相符。细胞（彭等人。升，2017b;沃尔什。等人，2020）。
LC-MS分析由印第安纳大学生物质谱实验室完成。

菜谱

Na 2 S存量
权衡的Na少量2 S IN 1.5 -毫升螺旋盖小瓶中，并在足够的水溶解，以制备0.2M的溶液。
立即准备100 -在1.5μl的等分试样-以毫升管和存储- 80℃。
丢弃呈黄色的Na 2 S储备液，因为这表示多硫化物杂质（Greiner等人，2013 ；Luebke等人，2014）。
最好是溶解的Na 2 S使用已脱气并用氩气吹扫水厌氧室内部。如果没有厌氧室，则在使用前使用脱气水准备Na 2 S储备液。

PBS
8克氯化钠

0.2克KCl

1.44克Na 2 HPO 4

0.24克KH 2 PO 4

溶解我Ñ 800毫升蒸馏水2 ö

调节pH至7.4

高压灭菌

裂解缓冲液
25毫米MES

500毫米氯化钠

pH值6.0

至关重要的是，这些缓冲器被广泛地脱气，用氩气吹扫，并存储在一个一个erobic室细胞裂解过程中以最小化氧化。

Sep-Pak水缓冲液
5毫升10％三氟乙酸或甲酸

455毫升蒸馏水H 2 O

Sep-Pak有机缓冲液
5毫升10％三氟乙酸或甲酸

250毫升乙腈

245毫升蒸馏水H 2 O

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的R35 GM118157的支持。BJCW用克拉茨支持˚F （; T32 GM131994 T32 GM109825）ellowship和定量和化学生物学毕业生训练研究金由NIH提供。此内容不一定代表NIH的观点，仅由作者负责。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

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