设备

我们明确地假设用户有一定的经验与Linux的shell命令的工作-为基础的操作系统，具有超级用户权限。

计算要求
我们建议使用工作站或与64位Linux服务器-为基础的操作系统，具有荷兰国际集团8 GB RAM和足够的硬盘空间（至少250 GB）来存储使用和生产这种分析的文件。此分析协议中给出的命令已在Ubuntu（18.04 LTS）Linux发行版上进行了验证。

软件

必备软件
该协议使用以下工具和Nextstrain软件执行系统发育分析：

Docker引擎（https://www.docker.com/）
水蟒（https://www.anaconda.com/）
Nextstrain（Hadfield等人，2018）
Augur（Hadfield等人，2018）
MAFFT（Katoh和Standley，2013年）
智商（Nguyen et al。，2015）
所有必要的工具和他们的dependen TS必须在分析之前进行安装。

数据集
该协议使用了全球共享所有流感数据倡议（GISAID）提供的SARS-CoV-2基因组序列数据集（Shu和McCauley，2017）。

下一节给出了此协议中使用的所有工具的安装步骤以及下载必需数据集的说明。

程序

图1总结了此协议中涉及的各个步骤以及每个步骤中使用的A ugur模块。

下载和我nstall荷兰国际集团所需的软件工具和数据集

安装Docker引擎
Docker是一种基于虚拟化的开源技术，用于以容器的形式开发和运行软件应用程序。该泊坞引擎可以使用以下的命令安装：

sudo apt-get更新

sudo apt-get install apt-transport-https ca-certificates curl gnupg-agent software-properties-common

curl -fsSL https://download.docker.com/linux/ubuntu/gpg | sudo apt键添加-

须藤apt键指纹0EBFCD88

sudo add-apt-repository“ deb [arch = amd64] https://download.docker.com/linux/ubuntu $（lsb_release -cs）稳定”

sudo apt-get更新

sudo apt-get install docker-ce docker-ce-cli containerd.io

要激活和测试Docker安装，请执行以下命令：

sudo groupadd泊坞窗

sudo usermod -aG泊坞窗$ USER

newgrp码头工人

docker运行hello-world

图1.该协议中描述的不同步骤以及每个分析步骤中使用的A ugur模块

安装Anaconda
Anaconda是P ython的开源发行版，可简化P ython程序包和环境的管理。要安装Anaconda，请使用以下命令：

wget https://repo.anaconda.com/archive/Anaconda3-2020.02-Linux-x86_64.sh

bash Anaconda3-2020.02-Linux-x86_64.sh

按照屏幕上的说明继续安装。您可以在安装脚本中显示的目录中找到anaconda3文件夹。您可以通过运行以下命令来激活和测试安装：

来源〜/ .bashrc

康达清单

安装Nextstrain-CLI
Nextstrain是P ython软件包，可以使用pip进行安装。

python3 -m pip安装nextstrain-cli

要检查是否Nextstrain已成功安装，请使用以下命令：

nextstrain版本

输出中显示的版本号应为1.16.1或更高。

安装Augur
Augur是Nextstrain提供的用于系统发育分析的工具包。Augur也可以作为P ython软件包提供，并且可以使用以下命令进行安装：

python3 -m pip安装nextstrain-augur

安装MAFFT
MAFFT（多序列比对利用快速傅里叶变换）是通过奥格需要执行多个-序列比对小号。要下载并安装个是工具，使用以下命令：

须藤apt-get install mafft

安装IQ-TREE
IQ-TREE是使用系统发育数据构建最大似然树的开源工具。Augur需要IQ-TREE才能从序列数据构建系统发育树。要安装IQ-TREE，请使用以下命令：

须藤apt-get install iqtree

建议使用IQ-TREE版本1.6.1（为Ubuntu 18.04 LTS安装的默认版本）或更高版本。

下载的SARS冠状病毒-2序列数据集
全球共享所有流感数据倡议（GISAID）是SARS-CoV-2基因组序列的最新公共存储库。对于此系统发生聚类协议，我们从GISAID下载了约15,000个完整的（截至2020年5月1日）SARS-CoV-2基因组序列的数据集。可以通过注册GISAID帐户来访问该数据库。牛浦n成功激活，序列数据集可以通过登录到全球共享禽流感数据倡议组织EpiCoV下载TM数据库并导航到浏览选项（https://www.epicov.org/epi3/frontend）。

要建立由预言者所需的元数据文件，你还需要下载确认表由全球共享禽流感数据倡议组织所提供的所有意见，这也可以在浏览网页上找到。

下载SARS-CoV-2参考基因组
在进行分析之前，您还需要从GenBank（.gb）中的NCBI下载SARS-CoV-2的参考基因组。为了进行此分析，我们下载了登录号为MN908947.3。的基因组。

准备我NPUT ˚F尔斯
要将Nextstrain用于系统发育分析和可视化，您需要准备以下输入文件（表1）：

表1.运行分析管道中不同步骤所需的输入文件列表

文件

描述

所需的输入文件

序列法

以FASTA格式分析SARS-CoV-2序列的集合

metas.tsv

制表符分隔的文本文件，描述序列s.fasta文件中的所有序列

clades.tsv

制表符分隔含分支定义文本文件下载编从该Nextstrain GitHub的库

MN908947.gb

Genbank格式的SARS-CoV-2参考基因组

其他配置文件

auspice_config.json

JSON格式的文本文件，指定可视化设置

lat_longs.tsv

制表符分隔的文本文件，用于显示地理特征

colors.tsv

制表符分隔的文件，其中包含元数据元素的十六进制颜色代码

可选配置文件

include_file

文本文件，包含要包括在分析中的序列名称，而不考虑其他子采样标准

序列法
单个FASTA文件包含要分析的病原体序列的集合。为了便于分析，我们我们编从全球共享禽流感数据倡议组织下载的序列数据集。FASTA文件中的每个序列都应将病毒的毒株ID作为序列头。为FASTA文件的样本序列记录被示于图2。

图2.样本记录的冠状-19 /印度/ 1-27 / 2020 SARS-COV2在sequences.fasta˚F应变ORMAT 。

metas.tsv
制表符分隔的元数据文件，它描述FASTA文件中给定的序列。元数据文件中包含的各个字段如下：

必填字段：应变，病毒，日期
对于在sequences.fasta文件中的每个应变ID ，应该有应变列下的条目中的元数据文件。

其他字段（如果使用发布的数据）：收录，作者，URL，标题，期刊，Paper_URL 。
推断祖先性状，附加信息等领域的区域，国家，州，被列入元数据和城市需要的文件。
该通知在元数据文件的各个领域的通货膨胀可以采取从确认表由全球共享禽流感数据倡议组织下载。甲小号充足米etadata小号preadsheet这里链接为补充数据1。

clades.tsv
此文件是必需的附加的银行足球比赛分支标签的系统发育树。该文件指定了特定于该病毒进化枝的突变（氨基酸或核苷酸）（图3）。clades.tsv文件应包含以下字段：

进化枝：描述进化枝的名称。
基因：突变所在的基因的名称（f或核苷酸变化，基因名称应为“ nuc”）。
现场：突变的位置与在基因组中。
alt：在该位置发现的突变的氨基酸或核苷酸。
对于此分析，我们使用Nextstrain（https://github.com/nextstrain/ncov）定义的SARS-CoV-2基因组的进化枝定义。

图3. Nextstrain为SARS-CoV-2基因组提供的clades.tsv文件的摘要屏幕快照。

auspice_config以.json
需要此文件来设置各种显示选项以进行可视化。甲小号充足Ç onfig ˚F ILE这里链接为补充数据2。

lat_longs.tsv
包含所有地区，国家，州纬度和经度甲制表符分隔的文件，并在该数据集的城市（图4）。该文件将用于在可视化过程中显示地理特征。

图4. Nextstrain所需的lat_longs.tsv文件的摘要屏幕快照，用于可视化地理特征。

质量一ssessment
在此可视化中，我们还希望将数据集中的高质量FASTA序列与低质量的FASTA序列分开。因此，我们加编一个额外的领域，“质量，”以元数据文件。以下质量指标定义了高质量的序列：

成对比对后与参考基因组的同一性百分比：> 99％
间隙的百分比的对准：<1％
序列中N（未知核酸残基）碱基的百分比：<1％
序列中没有简并碱基
基于上述标准，“质量”的元数据字段能够保存的值，“高，”“低，”和“未评估。'

以可视化的质量评估，我们创建ð一个额外的配置文件“colors.tsv ，”含有六角制表符分隔的文件编码的序列质量字段的每个值，你要代表。在该分析中，高品质的显示在绿，低质量的红色，和未经评估序列中通过“colors.tsv”文件（图5）指定为所需的颜色对应的十六进制代码黄色。

图5.为查看序列质量而创建的colors.tsv文件的摘要屏幕快照。

数据分析

由于易读性和性能限制，Nextstrain在一个视图中只能处理约3,000个序列。因为我们有一组〜15000基因组序列的工作，我们subsampl ED我们的数据和analyz编他们专注于一个单独的地理区域（即，印度）。

筛选顺序
可以根据某些条件过滤输入序列集，并使用此命令进行二次采样。以下命令将过滤基于他们的提交日期和组的SARS-COV2序列米的国家，每年，和一个月。日所有序列之前，2013年或拥有丢失日期记录将被丢弃。全球数据还将每月每个国家被子采样为100个序列。

预告片过滤器--sequences --metadata --output -按国家/地区年份月份分组-每个组的序列100-最小日期2013

专注于特定的地理区域，所述过滤器命令还包含参数，以帮助包括或排除某些序列的分析：

--include 此约束可用于包括序列，而与其他子采样标准无关。对于此分析，include_file将包含hCoV-19 / Wuhan / WH01 / 2019行，因为我们将使用此基因组作为系统发育树的根。您想要包括在分析中的任何其他序列的名称都可以添加到该文件中。

--exclude-where <条件>此约束将用于将分析重点放在特定区域上。

要对单个地理区域的数据集进行二次采样，请使用以下命令：

预言过滤器--sequences --metadata --output --exclude-where country！=印度--include

与参考基因组比对
奥格使用MAFFT执行米ultiple -s层序一lignment小号。要使用Augur创建路线文件，请使用以下命令：

augur align --sequences --reference-sequence --output --nthreads <2> --remove-reference --fill-gap

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

augur align-序列-参考序列-输出 --nthreads <2> --remove-reference --fill-gaps

构建我纳克的系统发育树
奥格使用IQTREE作为默认软件从多个构建系统发育树-序列比对文件。树中的分支长度是核苷酸差异的量度。以下命令将以Newick格式（.nwk）生成系统发育树：

预言树--alignment -输出 --nthreads <4>

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

预言树--alignment -输出 --nthreads <4>

完善系统发育树
在先前步骤中构成的原料树可以通过奥格使用TreeTime调整进一步处理的根据序列的采样日期分支的长度。为了便于分析，我们特异性灭蝇灯给予序列名树的根冠状-19 /武汉/ WH01 / 2019与细化命令的参数--root明确。该--clock率参数WA ş用于用固定的进化速率产生一个强大的时间分辨系统发生运行分析，和--clock -过滤-伊拉克第纳尔参数过滤š指出，不遵循进化速率或基因组分子钟。对于SARS-CoV-2基因组，该速率固定为每年每个站点0.0008或8 × 10 -4替换。要生成时间分辨树，请使用以下命令：

奥古尔精炼--tree --alignment --metadata --output-tree --output-node-data -根hCoV-19 / Wuhan / WH01 / 2019 --timetree --clock-rate 0.0008 --clock-std-dev 0.0004 --coalescent skyline --date-推断marginal-散度单位突变--date-confidence-无协方差--clock-filter-iqd 4

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

奥古尔精炼--tree --alignment --metadata --output-tree --output-node-data -根hCoV-19 / Wuhan / WH01 / 2019 --timetree --clock-rate 0.0008 --clock-std-dev 0.0004 --coalescent skyline --date-推断marginal-散度单位突变--date-confidence-无协方差--clock-filter-iqd 4

Annotat荷兰国际集团一ncestral牛逼raits
Augur可以使用时间树来推断所有内部节点的地区和国家。可以使用以下命令注释所有节点的祖先特征：

奥古斯特征--tree -元数据-输出-列区域国家-信心-抽样偏差校正2.5

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

奥古尔特征--tree -元数据-输出-列城市-信心-抽样偏差校正2.5

推断ř荷兰国际集团一个ncestral小号equences和Ñ ucleotide米utations
以下命令将识别树的分支的核苷酸突变，并推断每个节点的祖先菌株：

奥古尔祖先--tree --alignment --output-node-data --inference joint --infer-ambiguous

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

augur祖先--tree --alignment --output-node-data --inference joint --infer-ambiguous

推断响一个蓑一个CID米utations
以下命令将使用参考基因组和祖先序列识别氨基酸突变：

augur翻译--tree -祖先序列-参考序列-输出

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

augur翻译--tree -祖先序列-参考序列-输出

确定荷兰国际集团ç lades
以下命令将使用clades.tsv文件中指定的核苷酸和氨基酸突变在数据集中标记进化枝：

奥古尔进化枝--tree --mutations --clades --output-node-data

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

奥古尔进化枝--tree --mutations --clades -输出节点数据

出口ING Ø本安输出˚F尔斯的v isualization
下面的命令将在分析中的先前步骤中生成的所有输出文件导出作为单个JSON文件到visualiz Ë使用Nextstrain数据：

augur导出v2 --tree --metadata --node-data - -auspice-config auspice_config.json --lat-longs lat_longs.tsv --colors colors.tsv-输出auspice / COVID_global.json

对于以地理区域为重点的分析，请使用以下命令：

augur导出v2 --tree --metadata --node-data -auspice-config auspice_config.json --lat-longs lat_longs.tsv --colors colors.tsv-输出auspice / COVID_india.json

查看荷兰国际集团的d ATA
要可视化输出，请使用以下命令：

nextstrain view auspice / --allow-remote-access

此命令将启动安贝服务器在端口4000的输出然后可以被通过浏览器导航到可视化http://127.0.0.1:4000/或使用机器的IP地址在其上的安贝服务正在运行和导航到http：// IP_ADDRESS_OF_MACHINE：4000 /。Ť他不同子采样的数据集可以在“数据集”下拉菜单（图6）下找到。

注意：对于链接，用户将需要遵循协议中给出的步骤。超链接对应于通过“本地操作服务器甲uspice”（安装和指令都在该协议中详述），它帮助用户以通过浏览器查看他们自己的系统上的系统发育。

图6. Nextstrain为COVID_global和COVID_india数据集生成的可视化效果的屏幕截图。

致谢

该协议改编自Nextstrain项目（Hadfield等人，2018）。在一个uthors感谢来自穆克塔Poojary和Aastha V帮助到evaluat è该协议。钍E存在工作是通过赠款理事会科学和工业研究委员会（CSIR印度）给到维诺德·斯卡里亚，CSIR-IGIB。BJ承认科学和工业研究理事会的GATE奖学金。出资者在手稿的准备或出版决定中没有任何作用。在一个uthors声明没有竞争利益。

参考

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