材料和试剂

1.聚乙烯管（Thermo Scientific TM免疫管和塞，目录号：12-565-150），在室温下保存（RT）

2.塑料漏斗

3.吸管提示（的Eppendorf ® ，产品目录号：1300 RN [1-100微升，黄色]; 1400 [101-1,000微升，蓝色]），在室温下保存

4.用于免疫荧光的载玻片（尺寸：25.4 x 76. 2 mm；厚度：1.0 x 1.2 mm），十二个透明圆圈（Perfecta，目录号：214-6），保存在室温下

5.柔性的半透明有机硅弹性体管（Silastic，Dow Corning TM ，7.8 mm × 12.7 mm × 2.38，目录号：11-189-13B），在室温下存放

6.注射器（1 ml结核菌素注射器常规针尖）（Monoject TM ，目录号：8881501400），在室温下保存

7.无菌手套（综合手术手套无粉，Confiderm ® SPT），储存于RT

8.纱布海绵（无纺布纱布片，2英寸× 2 [5.08厘米。× 5.08厘米]）（AVANT纱布® ，目录号：25223），储存于RT

9.针头（标准皮下注射针头，Monoject TM ，目录号：8881250255 [23G]，8881250149 [21G]），在室温下存放

10.雌性Wistar鼠（28天龄），来自巴西圣保罗大学RibeirãoPreto校区的动物设施

11. 4-乙烯基环己烯二环氧化合物（VCD [ C 8 H 12 O 2 ] Sigma-Aldrich，目录号：94956-250ML），在室温下保存

12. 17-β雌二醇（Sigma-Aldrich公司，目录号：E8875-1G），储存于RT

13.玉米油（Liza-900ML），在室温下保存

14.氯胺酮HC升注射液，USP（Ketaset ® ，100毫克/公斤; NDC：0856-2013-1），RT

15.赛拉嗪（Schering-Plough，巴西库珀，科蒂亚，圣保罗，14 mg / kg），室温

16.小兽医Pentabiotic ® （硕腾，1.7克/3毫升，目录号：232092），RT

17.室温下储存的可注射Banamine溶液（Schering-Plough Animal Health，2.5 mg / kg；目录号：12080097），氯化钠（NaCl）0.9％（Samtec Biotecnology，10 ml），RT

18. 5％聚维酮碘动物用杀微生物防腐剂（聚维酮碘®溶液，目录号：12265），储存于RT

19. 70％异丙醇（473毫升）（Medline Industries，目录号：53329-800-06），在室温下储存

20. ELISA试剂盒雌二醇（DRG ®仪器公司DRG，EIA 2693），存储：2°C-8°C

21.孕酮双抗体RIA试剂盒（P4）（MP Biomedicals，目录号：SKU 07-170105 CF），储存：2°C-8°C

22.标准大鼠食物（23.2％蛋白质啮齿动物饮食，LabDiet ® ，目录号：5012），储存于RT

23.肝素50单位/毫升（肝素钠注射液USP，每毫升50单位USP）（B。Braun Medical Inc.，目录号：0264-9577-10），在室温下保存

24. 4-乙烯基环己烯二环氧稀释液（VCD）（请参阅食谱）

设备

标准笼子（Bonther，40 × 33 × 17 cm ）
断头台（Bonthe r，型号：Inox 420）
手术剪刀
钳子
持针器
显微镜（Zeiss Axioskop 2 Plus符合人体工程学的三目镜，目录号：452342）
离心机（Eppendorf ，型号：542 5 ，目录号：5405000042 ; 24 × 1.5 / 2.0 ml容量，最大21，330 × g （15,060 rpm ），包括带有气密性QuickLock盖的FA-24x2转子，键盘控制，120 V）
磁力搅拌器磁力搅拌器暖气（Thermo Scientific的，CA talog号：N2400-3010）
带有机架的振动器/涡旋仪（BenchMixer XLQ，目录号：BV 1010-TST）
探测器伽马计数器（Wizard2 TM ，珀金埃尔默® ，目录号：2470-0020）
吸光度仪800 TS（BioTek）
吸管单信道（的Eppendorf TM研究[0.5-10微升，EP：3123000020黄色; 20-200微升，EP：312300055黄色; 100-1 ，000微升，EP：312300063蓝色]
电子移液器多通道（Eppendorf TM Research，100μl ，SKU＃184287407894 ）

软件

GraphPad Prism 7软件（GraphPad Software，La Jolla，CA）
Adobe Photoshop（Adobe Photoshop Lightroom，版本5.3； Adobe Systems，Inc.）
注意图（www.mindthegraph.com）
Microsofit Excel

程序

尽管围绝经期的许多妇女的雌二醇血浆浓度正常或异常升高（Santoro等，1996），但雌激素治疗在临床实践中非常普遍。有趣的是，观察到的改进关于这个过渡时期的典型症状（施密特等人。，2000）。激发该方案的研究（Pestana-Oliveira et al。，2018）的目的之一是了解雌二醇在卵巢加速衰竭模型中的可能作用（图1）。

图1.显示实验方案时间表的示意图。雌性Wistar大鼠（出生后28天）必须每天注射VCD（160 mg / Kg）或玉米油（O； 1.25 ml / kg体重），持续15天。第一次VCD或O注射后约55天，在背外侧区域（O + O组； VCD + O； VCD + E）中插入17β-雌二醇或O sc的植入药丸。油或雌二醇颗粒植入后21天，必须在二头肌早上将大鼠断头。

VCD或玉米油注射液（图2）
分别称重并识别雌性大鼠（产后第28天），并计算每只雌性大鼠接受的VCD或玉米油的量。这一点很重要的是这个过程，每两天进行。然后准备并安排环境以进行注射。用纸覆盖桌子或长凳，并用预先计算的VCD或机油填充注射器。
取一只动物，并在颈部附近的背部进行皮下注射。对所有动物重复相同的步骤。由于油是粘稠的，因此应缓慢进行涂抹，并且注射器可能会在压力下从针头上爆裂。对于将要注射含有VCD的动物，请避免在注射后浪费液体。
完成所有注射后，将动物放回特定的动物设施。连续15天重复整个过程。为避免皮肤和皮下伤害，我们强烈建议对动物身体的不同部位进行注射。
注意：应尽可能避免皮肤和粘膜与VCD接触，尤其是由女性操作时。因此，使用的个人安全设备，如手套，口罩和眼镜是海峡ongly建议。

图2.示意图，显示卵巢加速衰竭模型和对照组的准备

雌激素疗法
硅橡胶胶囊的制备（图3）

1.用尺子将硅橡胶管延伸到桌子或长凳上，将其分成15毫米长的碎片。然后切碎。将硅橡胶一端的尖端插入一滴硅胶中，按另一端，使胶进入管中。借助止血剪刀，将充满胶水的一端夹紧。对其余的硅橡胶件重复此过程。将试管放在平坦的表面上24小时，以使胶水变干，从而密封试管末端（图3-1 ）。

2.我们Ë移液管和塑料尖端（0.5-10微升）以与填充硅橡胶胶囊8微升17- β-雌二醇（50毫克/毫升，先前在玉米油中稀释）。雌二醇悬浮液必须放在电磁搅拌器上，以确保在填充小丸的整个过程中均匀。此外，就在前一天，重要的是苏bject解决超声3小时，搅拌一晚。准备好后，它应该是均匀的乳状溶液。静止时，悬浮液沉降，可以观察到两个阶段：以油为代表的上一个（车辆）是透明的，而下一个是白色。油丸必须装满8 µl玉米油。胶囊的开口端的密封过程与上述相同，不同之处在于考虑到胶囊填充有液体，因此需要格外小心。完全密封后，使用小剪刀修剪端部非常重要（图3- 2）。

图3.硅橡胶胶囊的制备和手术植入的示意图

药丸植入手术

用于手术的所有器械和材料必须事先消毒。我们建议进行蒸汽灭菌（高压灭菌）。此外，应称量雌性大鼠的麻醉剂量，并根据个体体重给予药物治疗。

3.动物必须用氯胺酮麻醉（55毫克/千克，IP）和甲苯噻嗪（10毫克/千克，IP），并执行ASEP抽动程序如下：剃须大鼠，擦洗手术部位用抗菌剂溶液（聚维酮碘）。

注意：在此方案中，我们使用注射麻醉。但是，可以使用其他方法，例如吸入麻醉药。

4.在小剪刀的帮助下，进行谨慎的切口（0.5厘米），并插入剪刀的尖端以分离组织，形成一个皮下袋以储存沉淀物。该手术微创且快速。手术后，将动物必须接受预防性抗生素小号（Pentabiotico为0.2ml /鼠，1M）和抗炎治疗（Banamine，2.5毫克/ kg，皮下）。

阴道涂片收集和发情周期评估（图4）
雌性大鼠的发情周期平均持续4到5天，并有4个不同的阶段：发情期，发情期，发情期（或发情期I）和发情期（或发情期II），可以很容易地通过观察到的细胞类型来确定它们。阴道涂片（Marcondes等，200 2 ）。

图4.显示阴道涂片收集和发情周期评估的示意图。显微摄影（10 × ）由Thalita de OliveiraGonçalves和Guilherme de Souza Gagliano提供。

用一只手紧紧抓住动物，以使阴道可见。用另一只手轻轻插入预先装有0.9％NaCl（约10μ升）到大鼠的阴道内，没有必要加深移液器。按下移液器表面上的橡胶以推动NaCl，重复此过程两次，就像清洗一样（图4 A -1 ）。
取出阴道液和沉积在一滴一载玻片（图4B）。丢弃过量的在所述特定容器中的收集的涂片（图4- 3 ）。移液管必须一只动物和另一种之间进行消毒，用水（填充它图4- 1 ），并在容器丢弃它3 。重复洗涤3次，然后用70％的酒精填充移液器（图4-4 ）并丢弃，移液器将立即干燥并准备在另一只动物中重复使用。必须将每只大鼠的一滴药顺次放置在载玻片上（图4B）。
在收集所有大鼠的阴道涂片后，无需使用聚光镜就可以在光学或光学显微镜下观察载玻片。10倍和40倍物镜适合观察新鲜的材料（图4 C）。
当观察在显微镜下滑动，这将是可能识别3种不同细胞类型：1）轮和有核那些类似葡萄束或煎鸡蛋是非角化鳞状在动情前期期间通常观察到上皮细胞; 2）呈干叶状或玉米片状的不规则细胞，是发情期特有的角化上皮细胞；3）小圆形细胞是存在于二头肌中的白细胞（图4 D）。睾丸中的动物会出现多种这些细胞。重要的是要强调指出，应该使用它们之间的比例来确定发情周期阶段（Marcondes等，200 2 ）。
注：阴道涂片和发情周期评估的收集必须在清晨进行，7:30和9:30之间，以避免存在于阴道液细胞运动从一个阶段到n EXT 。小号因斯直到接近至90天VCD治疗开始大鼠的比例，定期（约20％）是循环在对照大鼠的相同和那些与VCD处理后（萨尔斯堡等人。，2019）。Ò NLY控制和VCD处理的大鼠在循环实验中经常被使用的起始VCD注射后前90天进行。

安乐死和血液样本采集
在开始VCD /注油后75到85天之间，应在早上通过断头或麻醉剂过量（氯胺酮[110 mg / kg，IP]和甲苯噻嗪[20 mg / kg，IP]）对动物实施安乐死。

在开始斩首之前，请确保断头台足够尖锐。快速，牢固地握住动物，将头放置在断头台刀片之间的躯干高度处（一旦定位），放下操纵杆。
借助于事先被肝素化并确定已附着在聚乙烯管上的塑料漏斗，将动物的身体向下放置，以利于血液排出。轻轻摇动试管，促进血液和肝素的混合，以防止凝结。将装有血液的试管存放在冷藏环境中（2°C-8°C ）。
快速，温和地从颅骨中取出大脑，然后立即在干冰或液氮中将其冷冻。在储存大脑- 70 ℃。
离心血液样品在冷冻离心机在1 ，200 ×克在4℃下20分钟。分离血浆并保存在-70°C直至测定。
注意：斩首必须尽可能以最人道的方式进行，以确保动物的健康以及实验者的安全。避免噪音，气味和实验拥挤人的房间。环境应该在循环空气中充分照明。我们建议使用排气扇来消除特定的气味，例如血液。我们建议断头台，水槽和柜台与水和70％的酒精进行清洗，以避免血液的气味BE capitations 。

数据分析

所有比较使用单因素方差分析后进行纽曼执行-科伊尔斯事后检验。数据表示为平均值± SEM。显着性接受为P > 0.05。所有统计分析和图表均使用GraphPad Prism 7软件进行。

笔记

关于卵巢加速衰竭模型的一个重要问题是：如何评估VCD注射是否对促进原始卵泡和初级卵泡的耗竭有效？

我们建议至少进行三种阳性对照测试中的一种：

卵巢组织学。该程序非常有效，因为预计卵巢卵泡会发生明显的定性和定量变化（Reis等人，2014）。这种方法的缺点是需要时间来获得结果。根据每个实验室的需求，在收集样品和准备好用于显微镜的载玻片之间，至少需要1周的时间。
安乐死（断头或灌注）后，取出卵巢，将其与结缔组织和脂肪分开，并在10％甲醛中固定24小时。执行，其包括在脱水过程中的组织学处理（视在酒精浓度的增加至70％，90％，100％的连续材料）中，用二甲苯清除，在组装石蜡块和获取部分与8米的切片机微米厚。要组装载玻片，我们建议使用半连续切片，并用苏木精和曙红（HE）染色。借助光学显微镜，对卵巢卵泡进行计数和分类。徕卡Biosystems公司网站提供的程序的详细指导（在组织处理中的步骤对石蜡切片的概览; https://www.leicabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing /）。

雌二醇和孕酮血浆浓度的测量。大多数围绝经期妇女具有典型的激素特征，孕酮血浆浓度降低，而雌二醇浓度正常或异常升高（Santoro等人，1996； Prior and Hitchcock，2011）。在接受慢性VCD注射的大鼠中观察到了相同的模式（Reis等，2014; Pestana-Oliveira等，2018; Carolino等，2019）。因此，我们认为这是评估是否在雌性大鼠中诱发了围绝经的有效方法。
断头后，立即收集血液样品和离心机中以1 ，200 ×克20分钟在4℃下。Ť He等离子体必须然后被分离并储存在-70℃直到测定。所有样品必须在同一测定中进行测量，以避免测定内差异。

孕酮测定：为了测量孕酮血浆浓度，我们建议MP Biomedicals提供用于人体的特定放射免疫测定（RIA）试剂盒。聚乙烯管必须用永久性钢笔按升序编号。为了进行更准确的测定，我们建议样品一式两份或一式三份进行测量。但是，在测试之前，必须执行稀释测试以识别所需的血浆量，以使从样品血浆浓度获得的值符合试剂盒标准曲线。MP Biomedicals网站提供了有关如何执行测定的分步说明。

雌二醇测定：为测量雌二醇血浆浓度，我们推荐DRG提供的用于酶联免疫吸附测定的专用试剂盒。

抗穆勒血浆浓度的测量。我t被很好地建立在文献中，抗苗勒激素浓度（AMH）具有与卵泡的数量有直接的关系，被因此被认为卵巢滤泡储备其水平随着年龄的增加减少的标志物，并且因此实际上是不可测后更年期（Cui et al。，2015）。此外，在这两种猴子和小鼠模型AOF已经证明减少AMH的水平之间的线性相关和减少d发育卵泡的数量（Sahambi等人，2008）。在最近发表的使用AOF模型对雌性大鼠进行的研究中，Anselmo-Franci博士的实验室（Carolino等人，2019年）证明，事实上血浆AMH浓度可以被视为卵巢卵泡储备的良好指标以及VCD注射滤泡衰竭。要测量AMH血浆浓度，请使用Ansh Labs（美国德克萨斯州韦伯斯特）提供的针对小鼠和大鼠的特定酶联免疫吸附测定试剂盒。

菜谱

4-乙烯基环己烯二环氧稀释液（VCD，图5）
化学化合物VCD通过环氧化由4-乙烯基环己烯（HCV）由细胞色素P450催化获得，职业卵巢TOXI Ñ合成橡胶，阻燃剂，杀昆虫剂和制造过程中由1,3-丁二烯的二聚产生的增塑剂（迈耶等人，2002）。业已表明，职业性化学物质4-乙烯基环己烯二环氧化物（VCD）可通过加速自然的细胞凋亡闭锁过程，选择性破坏大鼠和小鼠的卵巢小前窦腔（原始和初级）卵泡（Kappeler和Hoyer，201 2 ）。。

为了获得160剂量毫克/公斤（1.25 μ升/克体重）稀释在玉米油中的VCD试剂以12％的浓度，换句话说，如果要制备100毫升的储备溶液，测量12米升在一个VCD的量筒和补至100 ml的玉米油。借助磁力搅拌器将溶液均匀。超声不是改善稀释度所必需的。

注意小号：

溶液的量可以根据每个实验室的需求来准备。平均每6个月可以制备1升储液，应将其储藏在室温下并保存在琥珀色瓶中或用铝箔纸包裹以避免暴露在阳光下。我们建议将原液分装在较小的瓶子中，以便常规使用。
在涉及处理VCD的所有过程中，必须使用个人防护设备。此外，VCD的稀释必须在通风条件下进行，并用70％的酒精正确清洁。避免皮肤接触和吸入。

图5.显示4-乙烯基环己烯二环氧（VCD）稀释液的化学示意图

致谢

支持该论文的原始研究“由4-乙烯基环己烯二环氧化物（VCD）诱发的围绝经期动物模型中雌激素治疗对血清素能系统的影响”由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，葡萄牙语：Conselho）资助国家科学技术中心和圣保罗研究基金会（FAPESP，葡萄牙语：圣保罗埃斯帕多萨基金会）。该研究是在巴西圣保罗里贝朗·普雷图大学齿科学院基础和口腔科学系珍妮特·A·安塞尔莫·弗朗西博士的指导下，在女性生殖的神经内分泌实验室进行的。。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

伦理

所有程序均已由圣保罗大学动物护理和使用委员会（2013.1.1412.58.7）批准。

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