材料和试剂

接种环（BD，Ç atalog号：220216）
刮板机（Fisherbrand ，目录号08-100-241）
T - 75烧瓶（Thermo Scientific，目录号：12-566-440）
50 ml离心管（Corning，目录号：352098）
6孔板（Corning，目录号：3516）
10 ml注射器（Fisherbrand ，目录号14-955-459）
22号针（BD，目录号305900）
27号针（BD，目录号305109）
5 µm过滤器（Millex ，目录号：SLSV025LS）
巴斯德移液器（Fisherbrand ，目录号13-678-6b）
铝箔（Fisherbrand ，目录号01-213-102）
薄壁试管（Fireflysci ，目录号：30FL）
435 nm长通滤光片（Andover Corporation，目录号：435FG03-50S）
7H9培养基（Difco公司，Ç atalog号：271310）
OADC富集（BD，ç atalog号：211886）
Tween-80 （Sigma-Aldrich，目录号：P1754）
卡那霉素单硫酸盐（金生物，Ç atalog号：K-120-5）
的DMEM培养基（g ^ IBCO ，Ç atalog号：10566-016）
胎牛血清（ģ IBCO ，Ç atalog号：A4766801）
青霉素和链霉素（ģ IBCO ，Ç atalog号：15070063）
磷酸盐缓冲盐水（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：P3813）
CCF4 -AM FRET加载解决方案（生命牛逼echnologies，Ç atalog号：K1085）
注意：此套件包含该过程中所述的解决方案A，解决方案B和解决方案C。

DMSO （Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
4％多聚甲醛
的NaCl （FISHERBRAND ，Ç atalog号：18-606-420）
氯化镁（FISHERBRAND ，Ç atalog号：18-604-047）
的CaCl 2 （FISHERBRAND ，Ç atalog号码：AA4428030）
氯化钾（频谱化学，Ç atalog号：18-605-507）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸（HEPES））（费希尔乙ioreagents ，Ç atalog号：BP310）
三（费舍尔生物试剂，Ç atalog号：BP152-500）
EM媒体（请参阅食谱）

设备

生物安全柜（Labconco ）
涡流（VWR，Ç atalog号：58816-121）
血球（豪塞尔科学，Ç atalog编号：S17040）
倒置显微镜（VWR，Ç atalog号：Vistavision ）
细胞成像系统（生命Ť echnologies，Ç atalog号：4471136）
分光光度计（Amersham Biosciences，型号：U ltrospec 10）
台式离心机仪（Eppendorf，ç atalog号：5810R ）
CO 2孵化器（VWR，ç atalog号3078）
荧光计（ISS，Ç atalog号：K2）
培养摇床（VWR，Ç atalog号：1585）
热板/搅拌器（赛默飞世科学，Ç atalog号：SP131325）
pH计（梅特勒托莱多，Ç atalog号：30266626）

程序

生长M. Marinu中号的细菌培养
大致感染前5 d测定，制备了M.海鱼培养感染。
接种M.海鱼入50ml 7H9培养基补充有10％OADC富集和适当抗生素根据需要，我们经常使用30毫克/毫升卡那霉素。
这种细菌培养将被用来启动一个新的细菌培养和传代，以减少细胞团ING 。
如果该细菌培养包含太多丛ED细胞，然后添加在吐温-80的浓度0.05％（V / V）ç一个被加入到所述7H9介质。
让细菌培养物在30°C下生长，同时以150 rpm的速度摇动，直到达到大约OD 600 1.2。
一旦细菌培养物生长超过对数中期，将4 ml培养物转移到46 ml补充有10％OADC的新鲜7H9培养基中。
在30°C下孵育，同时以150 rpm摇动；让细菌培养物再次生长到对数中期，大约2 d。

的培养RAW264.7小鼠巨噬细胞
感染前大约2-3天，在T-75烧瓶中用10 ml的DMEM培养基（含10％胎牛血清（FBS）和青霉素和链霉素）以100单位/ ml的浓度培养RAW264.7细胞。
让细胞在5％CO 2下于37°C增长至80-90％融合。
当天感染前，用细胞刮刀解除所有单元（在80-90％conflucence从）所述的TC烧瓶的底部。
将细胞和培养基转移到50 ml离心管中。
在室温下以160 × g离心10分钟。
除去上清液并丢弃。
ř esuspend粒料我Ñ 10毫升含有10个％FBS的DMEM培养基中的青霉素和链霉素。
使用您喜欢的任何一种方法对细胞进行计数。记录样本中细胞的近似数量。
填充6 -孔板用2ml的培养基，每孔，然后添加RAW264.7细胞接种总共2.5 × 10 6个细胞/孔。
将细胞在5％CO 2和37°C下孵育过夜。

细菌单细胞制剂
粒料向下细菌培养从部分A通过在3离心，220 ×克15分钟。
除去上清液，并将细菌重悬于50 ml PBS中。
再用PBS洗涤细胞2次，共3次。
在后第三洗涤，除去该上清，重悬沉淀10毫升的PBS。
使用注射器吸走PBS中的细菌，并通过22号针头。
注：牛逼他的步骤是可选的，但将有利于合格的文化通过一个过滤器。

用注射器吸除细菌，然后通过27号针头。
吸出细菌并通过5 µm过滤器。
用OD 600测量细菌培养物的密度。
计算要添加到的巨噬细胞取决于所需的细菌细胞的体积的感染复数（MOI）。
如果需要，通过沉淀沉淀细菌细胞并将其重悬成较小的体积。

巨噬细胞感染
在显微镜下检查RAW264.7细胞；它们应达到60％的汇合度。
吸出DMEM介质并替换为EM介质。
传染的巨噬细胞与结核分枝海鱼在10 MOI ，或在所述期望的MOI。
在5％CO 2下于30°C孵育2 h 。
之后incubati上，吸媒体。
用3 ml PBS轻轻洗涤并搅拌板。
去除PBS，再洗涤2次以去除细胞外细菌。
加入2.5 ml含10％FBS的预热EM培养基，孵育48小时。

CCF4-AM FRET检测
加载RAW264.7细胞CCF4 -AM负载解决方案由以下的制造商的建议：
载有CCF4-AM的未感染RAW264.7细胞用作阴性对照。
在RAW264.7细胞而不CCF4 -AM作为诺特尔阴性对照。
甲Chiense仓鼠卵巢（CHO）细胞系表达β内酰胺酶（CHO-β-LAC）是用来作为用于CCF4的裂解阳性对照-AM （张等人。，2016）。
由制造商制备溶液B （100 mg / ml DMSO和0.1％乙酸中的Pluronic-F127表面活性剂）和溶液C （24％w / w PEG 400、18％TR-40 v / v在水中）。
加入182 µl DMSO溶解200 µg CCF4-AM，轻轻上下吸移。
注意：这将是制造商指定的解决方案A。

将溶液倒入20 µl等分试样中。
注意小号：

如果要储存，请在真空下干燥，并在-20 °C避光的条件下储存。
如果真空不可用，该溶液毫安ÿ被储存在-20 ℃下在该暗。该解决方案最多可稳定三个月。
加入3微升的小号olution A至30微升的小号olution B和涡流。
添加467微升的小号olution C和涡流，以产生6 × CCF4-AM衬底装载溶液。
注意：该溶液在室温下稳定12小时。

将500 µl 6 × CCF4-AM上样溶液加到100 µl细胞培养物中，制成1 × CCF4-AM上样溶液。
在避光的情况下在室温下孵育2小时。
注意：如果细胞受到干扰，则2小时的孵育将使它们有足够的时间沉降到板的底部。

吸出介质和CCF4-AM底物。
用3 ml PBS重悬细胞，并轻轻搅动板。
除去PBS，再用PBS洗涤2次，共3次。
在避光的情况下，在室温（RT）下用新鲜的4％多聚甲醛（PFA）固定细胞30分钟。
再用PBS洗涤一次，在这一阶段，细胞已准备好进行测量。

使用荧光计进行测量
轻轻重悬吨他Ç在PBS厄尔并传送它们到一个薄壁编UV比色皿。
该荧光计程序应该被设置成在405nm处激发和记录Ë之间430nm至600nm的任务，以获得所述曲线包含两个蓝色和绿色的峰（图1）。
注意：在荧光计，吨WO偏振器被放置彼此垂直的上激发光束路径和一个435纳米长通滤波器被放置在上emssition光束路径重新达斯背景和散射光。

图1 。通过FRET测量记录样品的发射光谱。一。在405nm激发后纳米，羟基香豆素将能量转移到荧光素导致在绿色发射在527纳米。含有β-内酰胺酶的细菌将逃脱吞噬体，并与细胞溶胶中的FRET染料接触，从而导致FRET的损失和在450 nm处的蓝色发射。乙。第一个峰是羟基香豆素的发射（蓝色），第二个峰是荧光素的发射（绿色）。

所述intensitiy在450纳米（蓝），我1 ，和在强度527纳米，我2 ，被测量为20迭代秒。的蓝/绿比计算为我1 /我2 （图2 ）。

图2.通过将I 1除以I 2计算出足够数据的蓝/绿比。在20次迭代中测量了450 nm（蓝色）和527 nm（绿色）的强度。计算蓝/绿比率。如对海分枝杆菌观察到的较高比率，约为0.8表示信号发生了良好的变化，表明胞质易位。大号奥尔比（< 0.2）是由细菌无法逃脱吞噬体或阴性对照获得。

数据一nalysis

的蓝/绿比分别进行平均为20个ITER从3次重复，共60次重复ations。
然后，将平均蓝色/绿色比率绘制为条形图，其中的误差线表示标准偏差，并测试其统计显着性（图3）。

图3.样品数据为不同菌株的蓝/绿比条形图。通过在条形图中绘制数据，可以看到样品之间FRET的损失。在这种情况下，野生型M.海鱼逃逸吞噬体和相互作用以导致更高的FRET染料蓝/绿比值。所述M.海鱼ΔEsxA / B是无法逃避吞噬体与导致颜色从绿色到蓝色无变化的FRET染料不相互作用。

使用Shapiro-Wilk检验测试这些值的正态性。
如果数据未能与正常值不同，则使用单向方差分析对其进行显着性检验，否则执行Tukey-Kramer检验来检验其统计显着性。

菜谱

EM媒体（1升）
在烧杯中加入7.02克邻˚F氯化钠，0.52克的KCl ，0.26克CaCl的2 ，0.076mmol克氯化镁，0.9克葡萄糖和HEPES的6.5至水
将pH调至7.3
加水至1升

致谢

这项研究得到了NIGMS（SC1GM095475授予J. Sun），国家研究资源中心（5G12RR008124）和国家少数民族健康与健康差异研究所（G12MD007592）的资助。哈维尔·阿奎莱拉（Javier Aguilera）通过美国国立卫生研究院（RISE）为研究生提供了RISE计划，得到了美国国立卫生研究院（R25GM069621至R. Aguilera）的支持。内容仅由作者承担，并不一定代表美国国立卫生研究院的正式观点。

竞争利益

作者没有竞争利益要报告。

参考

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