材料和试剂

1. 96孔V形底ED非结合板（Greiner生物一个，目录号：651970）

2. 24孔Ç利尔˚F LAT -b ottom编ù ltra-升流一个ttachment p酸酯（康宁，目录号：3473）

3. 4-瓦特ELL Ç ELL Ç ulture p酸酯（ASI，目录号：TP9004）

4. 50毫升和15ml Ç onical离心管（Corning公司，隼，产品目录号：352096，352070）

5.低-r etention米icrocentrifuge吨ubes（1.5毫升和0.6毫升热Fisher Scientific公司，目录号：3451和3446）

6. 50毫升小号terile d isposable ř eagent ř eservoirs（康宁，目录号：4870）

7. DMEM / F-12，HEPES （热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：11330032 ，S撕4 °C）

8. KnockOut TM血清置换 -多物种（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：A3181502 ，S撕在-20 ℃下）

9. MEM非必需氨基酸溶液（100 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：11140050 ，S在4撕℃下）

10. 2-巯基乙醇（1 ，000 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：21985023 ，S撕4 ℃下）

11.动物免费重组人碱性FGF（派普泰克公司制，Ç atalog编号：AF-100-18B ，小号在撕- 80 ℃下）

12.的TrypLE TM快速酶（1 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，目录号：12604013，在室温下储存[ 22 ℃下]在叔他暗）

13.神经基础培养基（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：21103049 ，储存在4 ℃下）

14. Y27632 ROCK抑制剂（CEDARLANE ，Ç atalog号：S1049-10MG ，存储在-80 ℃下）

15.的GlutaMAX TM补充（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：35050-061，储存在4 ℃下）

16.肝素钠盐（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：H4784，储存在-20 ℃下）

17.胰岛素溶液人类（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：I9278，储存在4 ℃下）

18. N-2补充（100 × ）（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：17502001，500的等分试样μ升，储存在-20 ℃下）

19. B-27 TM补充（50 × ），减去维生素A（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：12587010，500的等分试样μ升，在-20商店℃下）

20. B-27 TM补充（50 × ），血清-自由（热Fisher Scientific公司，Gibco公司，Ç atalog号：17504044 ，500的等分试样μ升，在-20商店℃下）

21.基质胶®生长因子降低（GFR）基底膜基质（康宁，Ç atalog号：356231，500的等分试样μ升，储存在-20 ℃下）

22. d-PBS - / - ，1 × ，瓦特ithout Ç alcium和米agnesium（野牛之生物制品，目录号：311-425-CL，保存于4 ℃）

23.胚状体介质（EB介质）（请参阅食谱）

24.神经感应介质（请参阅食谱）

25.没有维生素A的脑型器官分化培养基（CDM-A）（请参阅食谱）

26.含维生素A（CDM + A）的脑类器官分化培养基（请参阅食谱）

设备

的Nalgene TM广场PETG米EDIA b ottles（250米升）（Gibco公司，热Fisher Scientific公司，Ç atalog号：2019-0250）
移液器（5 ml ，10 ml ，25 ml ，50 ml ），微量移液器（10 µl ，20 µl ，200 µl ，1,000 µl ）
多通道移液器仪（Eppendorf，米Odel等：研究加上12信道移液管，Ç atalog号：ES-12-300）
水浴
离心机
相衬显微镜
血细胞计数器
37 °C ，5％CO 2细胞培养培养箱
轨道摇床可安装孵化器内（如热费舍尔，Ç atalog号：88881101 ）
刀片和小号calpel

程序

胚状体制作：单个化的d电镀ħ UMAN胚胎干细胞（胚胎干细胞）
1.准备无生长因子的EB介质，并使用水浴预热至37 °C 。EB培养基（不含生长因子）可被存储为最多1周，在4 ℃下，并且一旦加热，该股票应使用或丢弃。

2.洗净的hESCs ，这已达到70 - 80％confluenc ë ，两次，用3倍体积的d-PBS的- / - 。

注意：使用建立此协议的hESC在小鼠中培养embryoinic成纤维细胞（MEF）的条件培养基补充有bFGF的至4纳克/立方米的最终浓度升（Sivitilli 。等人，2020）。

3.加入1 ml TrypLE，并在室温（22 °C）下孵育5分钟。

4.轻轻移液器上下解离的殖民地一个单-的细胞小号uspension 。

5.中和的TrypLE用4个体积（即，4毫升）EB培养基并加入所得悬浮液以15 -毫升˚F爱尔康管。

6.使用血球计数的细胞。避免使用自动细胞计数器，这可导致不准确的细胞NUM的BER因为人类胚胎干细胞倾向于结块。

7. Cenrifuge细胞以150 ×克为在室温下（22 5分钟℃）。

8.在离心过程中，通过添加4 ng / ml的bFGF和50 µM Y-27632（ROCK抑制剂）来制备EB培养基。为此，请使用15 m l的EB培养基，其中含有1.5 µl bFGF （来自40 ng / µl的储备液）和7.5 µl Y-27635（来自100 mM的储备液）。

9.重悬SINGL ë的hESC至80,000个细胞/米的最终浓度升在新鲜制备的EB媒体补充有bFGF的和Y-27632。

10.传输所述重新悬浮的细胞中的无菌的一次性试剂贮存，并添加150μ升细胞悬浮液（12,000个细胞）到每个孔中96孔V形底的ED非约束板使用多-通道移液器。

11.将板在37 °C的CO 2培养箱中放置2天。

胚状体生产：饲喂
1.每天准备新鲜的EB Media，并使用水浴预热至37 °C 。

2.在第2天，进料的EB中补充有2毫微克/米EB媒体升的bFGF 。为了达到所需的浓度，将15 ml EB培养基与0.75 µl bFGF （40 ng / u l ）混合。

3. ř EMOVE 135μ升从每个孔的培养基一起温育96 -孔板使用多-通道移液器。

4.转让EB培养基（补充有2纳克/立方米升的bFGF ）到无菌一次性试剂贮存，并添加150个μ升使用多EB媒体-通道移液器。

5.返回所述板的CO 2培养箱中进一步2天。

注意：由于蒸发，向96的周缘的孔-孔平板可以具有略低的体积。这是正常现象，EB仍应正确形成。

胚状体生产：评估检查站
在第5天，使用测量EB大小明MI croscope以确定是否所述的EB是准备用于神经诱导（图2）。如果大小的EB中为350 - 600微米，进行到步骤d （神经我nduction）; 我F上的尺寸低于350微米，然后重复步骤乙; 我F上的尺寸是上述600微米，我们建议不要继续与该协议。ř estart协议和双重检查细胞计数在程序A，以确保准确性播种的EB时，开始另一批次。

图2.在第5天衍生自H9 hES Cs的代表性EB 。

神经归纳法：转移到神经归纳法
为每次分化准备新鲜的神经感应培养基，并使用水浴将等分试样预热至37 °C 。神经感应培养基可以在4 °C下保存1周。加热后，不应再使用神经感应培养基。
选择的EB日在相遇的尺寸和视觉标准（图2）。
切口2 - 3毫米断极值我TY 200的-微升过滤移液管尖端使用剃刀刀片作出较宽的开口。
通过向每个孔中加入500 µl预热的神经感应培养基来制备24孔超低附着板。
使用一个解剖范围和一个切口200微升移液管尖端，拿起的EB并转移到一个24 -阱ü ltra-升流一个ttachment板。设置的吸液管，以20微升，PLA Ç Ë结束在微博井的TTOM和吸管了EB。每孔最多可以添加2个EB ; 其他EB增加了进一步聚合的可能性。
将板放在CO 2培养箱中2天。

神经感应：喂养
使用水浴将神经感应介质预热至37 °C 。
订阅了通过添加额外的500μ的EB升神经诱导培养基到每个孔中。
返回板在CO 2培养箱中培养另外的2天。

神经感应：评估检查点
1.我们Ë一个明场显微镜来检查neuralized的EB为光透明在外100微米的EB（图3）的。外环结构应突出，并通过形成鲜明标记的不透明度变化作为比较用的CEN二尖瓣区域的的EB。这是一个关键的检查点; EB的不具有的正确组织的上皮[R ING不会形成类器官。

图3.在第9天，源自H9 hESC的EB中的神经外皮形成。

神经上皮è xpansion：转移到固相基质胶脚手架
1.解冻生长因子在冰上还原基质胶2 h。一旦融化，Matrigel可以使用长达6小时，但必须放在冰上。融化后，Matrigel无法再冷冻。

2.准备CO分化培养基不V itamin A（CDM-A）新鲜每个分化和prewarm等分试样至37 ℃下使用水浴。CDM-A可以在4 °C下保存2周。加热后，不应重新使用CDM-A 。

3.准备的宽的盒-通过切割3孔的提示- 4毫米关闭末端200μl的过滤移液管尖端的使用剃刀刀片作出较宽的开口。拾取的一个的EB一个使用200 μ升切割尖端和传递到每个的中心孔的4孔板（每孔1 EB）。

4.使用未切割200 μ升尖端，绘制25μ升抽吸剩余神经诱导培养基从各孔中。关键是从EB删除所有介质在4 -孔板; ˚F ailure这样做将防止在基质胶附着于板面，并防止除去的基质胶中程序Ĵ 。

5.盖个ê neuralize d EB与一滴冷的基质胶（30μ升使用）的未切割200μ升尖端。

6.位置的在中心EB基质胶使用10μ液滴升尖端。确保该EB不搁在板的底部。

7.一旦板已被填充（4个EBS），TRAN sfer充分板在CO 2培养箱中10分钟，在37 ℃下进行聚合的基质胶。

8. 10分钟后，小心地加入500μ升预热CDM- A和返回到在CO 2培养箱中培养一个futher 2天。

注意：转移EB时，请与收集的介质量保持一致。我们建议收集EB的25个微升媒体创造的4滴-孔板。

神经上皮EXPA nsion：饲养
使用水浴将等分试样的CDM-A预热至37 °C 。
小心吸出所有培养基，并向4孔板的每个孔中加入500 µl CDM-A。
返回板到培养箱一个进一步2天。

神经上皮防爆潘申：评估的检查点
1.我们Ë一个明场显微镜来检查在类器官的周边区域的环结构的cos（图4）。CO的直径应大约为500 – 700 µm，并且在整个过程中应具有多个环结构；Ť他是一个重要的关卡，那些没有环结构不会形成类器官。

图4.代表性ħ的CO从H9衍生的hESC上13天之前基质胶提取。

转移到纺丝培养物中：从固相基质胶中提取
1.准备新鲜的CO分化培养基（CDM），并使用水浴将等分试样预热至37 °C 。CDM可以在4 °C下保存2周。加热后，不应重新使用CDM 。

2.准备宽-通过切割4孔移液管尖端- 5毫米关闭末端的200 μ升移液管尖端，使更宽的开口。

3.准备与3μm的6孔板升预热每孔CDM。

4.使用解剖显微镜，小心地围绕在植入的CO切割的基质胶液滴; 这里的目标是消除尽可能多的基底膜尽量不损坏CO过量。基底膜在这一阶段剩余的二氧化碳会导致囊肿的形成-象结构的纺纱文化。

5.我们Ë的切口200 μ升尖端到所述的CO转移到6 -孔板含有CDM ; 一米的4个aximum重质原油每孔是可接受的。

6.一旦所有的的CO已转移，将6孔板上的轨道摇床（赛默飞猫：88881101）在一个37 ℃的培养箱中于80的速度- 90转数（rpm可能会发生变化，如果一个不同的轨道摇床模型用来）。

转移到纺纱文化中：以纺纱文化为食
1.使用37 °C水浴预热CDM 。

2.暂停定轨振荡器并收集含有CO的平板。

3.小心地从每个孔中抽出总介质量的2/3 ；注意不要使吸出的与狱警的媒体，因为它们是悬浮的。

4.添加3米升预热CDM到每个孔中。

5.返回所述板以在培养箱中定轨摇床并初始化（图5）。

图5. 12周时衍生自H9 hESC的旋转培养物中的代表性h CO 。

菜谱

胚状体培养基（EB培养基）（表1）

表1. EB媒体组成。组件，股票和终浓度（续）列表，用于工作的股票和体积表示

神经感应培养基（每周新鲜配制）（表2）

表2组成的神经诱导培养基（对新鲜repared每周）。加热后，不应再使用神经感应培养基。组件，股票和终浓度（续）列表，用于工作的股票和体积表示

没有维生素A的脑型器官分化培养基（CDM-A）（表3）

表3.组成的脑组织体分化培养基没有维生素A成分，股票和终浓度（续）列表，和卷工作储备指示

脑器官样分化培养基与维生素A（CDM + A）（表4）

表4.组成的维生素A.脑组织体分化培养基成分，股票和终浓度（续）列表，和卷工作储备指示

致谢

这项工作得到了加拿大第一研究卓越基金会/医学设计基金会，克里姆比尔基金会和加拿大卫生研究院（CIHR）基金会对洛杉矶的FDN148455资助。本协议是根据Sivitilli等人发表的方法改编的。，（2020 ）。感谢Javier J. Hernandez和多伦多大学Applied Organoid Core（ApOC ）的工作人员提供的建议。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

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