材料和试剂

1. 50毫升塑料，锥形-基离心管螺帽（Sarstedt的，目录号：62.547.254）

2. 2 ml带卡扣的无菌塑料微量离心管（Eppendorf 022363433 ，Fisher Scientific，目录号：05-402-11 ）

3.带有适当提示的微量移液器

4.带有27G × 13毫米针头（BD，目录号：300635）的0.5 – 1 ml胰岛素注射器（例如Beckton -Dickinson，目录号：329651），或带有29G × 13 mm针头的0.5 ml胰岛素注射器（BD，目录号）：323001）

5. 100 ml的和250个毫升的玻璃瓶（VWR，目录NUM BER小号：10754-814和10754-816）

6.记号笔（请使用一个可承受乙醇和冷冻，如在黑色科学-标记VWR，目录号：76276-060）

7.剥离-A-瓦特AY ®嵌入模具（Sigma-Aldrich公司，目录号：E6032-1CS）

8. Superfrost Plus显微镜载玻片（Thermo Fisher Science，目录号：12727307）

9.盖玻片号。1 1/2（Sigma-Aldrich，目录号：CLS2980224-1000EA）

10.显微镜载玻片盒（VWR，目录号：82024-584）

11.应变，基因型，年龄的小鼠，和性别，你想分析。参见步骤一种用于所述协议为C57BL / 6小鼠（Taconic，丹麦）

12.甲巯咪唑（Sigma-Aldrich公司，目录号：M8506），保持的在干燥和通风良好的密闭容器区域。存放在4 摄氏

13.无菌生理盐水9毫克/毫升（例如，Estericlean ，目录号：7053249369080）

14.多聚甲醛（VWR，目录号：28794.295）。将粉末储存在4 °C

15.蔗糖（VWR，目录号：27480.294）

16. 10 × p hosphate -缓冲盐水（PBS），pH 7.4的（例如，PANREAC APPLICHEM ，目录号：A0965 ，9010 ）。在室温下溶解并储存

17. 5 M NaOH （VWR，目录号：31625.293）

18. OCT低温安装介质（Sakura FineTek ，目录号：45830）

19.干冰

20.甘油（VWR，目录号：BDH1172-1LP）

21.赫斯特33258（Sigma-Aldrich公司，目录号：ab228550）。配制1000 × 0.5％（重量/体积）的原液。将等分试样储存在– 20 °C

22.图1和图3中用于鉴定细胞类型的一抗是：

甲nti- Ç ytokeratin 5用于水平基底细胞（兔;稀释1：300，BioLegend公司，目录号：905501）
甲nti- IgGFc -结合蛋白（的Fc γ BP为）- [R espiratory小号ecretory细胞（兔，稀释1：200，Novus公司Biologicals公司，目录号：NBP1-90462）
细胞周期中细胞的一种nti抗原Ki-67（Ki-67）（兔，1：500，默克（Merck），目录号：AB9076）
成熟嗅觉感觉神经元的抗嗅标记蛋白（OMP）（山羊；稀释度1：1000，Wako Chemicals，目录号：544-10001）
抗- [R etinalaldehyde脱氢酶类型1/2（RALDH1 / 2），用于支撑和呼吸细胞（小鼠;稀释1：1000，Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：SC-166362）
适用于未成熟嗅觉感觉神经元的Anti-s Tathmin-1（STMN1）（兔子；稀释度为1：500，Abcam ，目录号：ab24445）

设备

解剖仪器
和：约15厘米（14001-14精细的科学工具，目录号）剪刀10厘米（精细的科学工具，目录号：14370-22），用于在去除毛皮的和切割通过骨，分别（昂贵的剪刀将是破坏ED ）
一把较小的用于修剪软组织的细剪刀（最好是钝头，精细科学工具，目录号：14108-09）
少数钳子，如第ë细指出了用于去除牙齿的人（翅片ê科学工具，目录号：11231-30），钝那些（精细的科学工具，目录号：11000-12），以及一个小号带齿（精细科学工具，目录号：11028-15）。使用钝塑料镊子检查的脱钙（精细的科学工具，目录号：11700-03）
RDO快速脱钙剂（ApexEngineering直接www.rdodecal.com/contact/或ESBE科学，目录号：APE-RDOL4L）
精密实验室规模和分析天平（用于化学品）
精密实验室秤（用于小鼠）
摇摆平台或轨道振动器
磁力搅拌器
微W¯¯一个v é炉
低温恒温器有一个硬组织刀
倒置荧光显微镜，带照相机和× 4，× 10，× 20和× 40物镜。甲用于蓝色荧光滤光器（Hoechst的33258是EXCITE d通过的光的吨350波长并发射在波长约455）需要在所述至少
- 80 ℃下FREEZ ER
可选：V acuum室或真空烘箱中

程序

确定所需的甲巯咪唑剂量的中试实验（推荐）
我们强烈建议在进行更大的实验研究之前确定所需的甲巯咪唑剂量，以确保可以在想要研究的年龄和特定品系的小鼠中实现OE的可再现消融。请注意，这是未知道是否他巴唑是有毒的小鼠OE年轻比10天老（铃川等，2011）。据了解，在几种酶的OE是重要的元b的olism满足himazole ; 因此小鼠品系差异会占到差小号在所需的剂量（解等人，2011）。在计划阶段，确定您要评估的甲氨唑剂量。我们评估了体重40至60 g的成年2至5个月大的成年雄性和雌性C57BL / 6小鼠的50 mg / kg ，75 mg / kg和100 mg / kg （Håglin等人，2020年）。请注意，RTECS（学籍牛逼好氧Ë的ffects Ç hemical小号ubstances）列出的IP 。小鼠的LD 50为500 mg / kg。建议每剂至少分析3只动物。
制备甲巯咪唑在无菌条件下于无菌生理盐水上的同一天的注射。甲基咪唑粉末将完全溶解，没有可见的沉淀。对于例如，我˚F75毫克/公斤，计划的注射，制备75毫克甲巯咪唑在2ml无菌p粉末hysiological盐水。如果您更愿意注入更大的体积，则以2 µl / g的剂量注入或在生理盐水中进一步稀释。ip的最大音量。小鼠的注射剂量为10ml / kg （Morton等，2001）。
在整个实验过程中，请确保您可以识别出每只小鼠，确定其接受的剂量以及从该小鼠身上采集的组织样本。称重每只小鼠以确定单独的剂量，并为每只小鼠做笔记。
当执行ip时。注射时，必须意识到由于技术问题而导致注射失败的频率相对较高（Steward等，1968）。提供了有用的指导视频（Machholz等，2012；纽卡斯尔大学，2021）。Practi CING腹膜内。对最近进行安乐死的小鼠进行注射，用食盐水稀释后的食物色素，然后立即检查腹膜腔中的颜色分布，可以确保正确技术的性能（图1A）。
监测的小鼠密切立即以下和后一天他巴唑注射，因为一个成功的IP 。注射的甲巯咪唑通常导致一些不适，其可被观察为打喷嚏和鼻的摩擦。重要的是，鼠标不应该在其一般状况下遭受损坏。
牺牲的小鼠后2天IP 。注射并通过分析组织切片评估消融效果（有关组织学分析，请参见方案C）。效应最早甲巯咪唑发生后4小时（Brittebo ，1995; BERGSTROM等人，2003），和OE不完全再生直到之一后一个月-治疗与甲巯咪唑（铃川等人，2011）。
评估d在不同区域消融egree S（称为区域）的所述在沿前几个层次OE和-鼻腔（图的前后轴小号1C ，d ）。的有效剂量的成功注射甲巯咪唑在结果中的所有细胞脱离S，除了通常非常平坦的水平基底细胞衬基底层的单层。甲巯咪唑给药后2天，经常在鼻腔中观察到数量不同的分离组织（图1 B ）。

图1的实施例他巴唑的消融的OE和一个用于分析不同的解剖水平引导。A. ip的示例。注射具有绿色食用色素的安乐死小鼠。注射后立即打开腹腔，因为正确的注射导致迅速diluti上和分布使对颜色的贯穿整个腹腔。需要注意的肠子（箭头一些绿色外头的插入）。通常可以看到不正确地注射到腹部器官。星号（*）表示的胸骨。的一部分的B.免疫荧光分析的OE在对照（盐水）的小鼠和的单次剂量后48小时巴唑节目小号OE消融治疗后。虚线显示了基底层的位置。分析ü š荷兰国际集团一个ntibodies针对标志物蛋白为未成熟（STMN1在品红）和成熟（绿色OMP）的神经元显示小号，这些细胞被烧蚀的同时与所有OE细胞，除了为横向基底祖细胞（参见图3为一个紧密-up示例）。请注意，在甲巯咪唑处理后48小时，单个OE切片中可能存在大量脱落的细胞碎片（箭头）或不存在脱落的细胞碎片。小鼠头部切口的前部的下示意图鹭吨帐簿在所述中线; a – d表示建议用于整个前-后轴的OE分析的近似解剖学水平。D.从C中的a - d取的组织切片外观插图。OE分为几个通常称为区域的区域。在SE的区域具有不同的特性; 第EREF矿石，明智的做法是评估的效果巴唑在代表点在OE和也在在OB嗅觉感觉神经元突触区域的对应区域。区域s 1（Z1，棕色），2（Z2，黄色）和4（Z4，紫色）的彩色线标记了代表位置。E.甲截面的显微照片，从电平d取，与所述核用Hoechst染色。

一次或多次消融的甲硝唑注射液–再生周期（主要方案）
第一LY，使实验计划和d ecide WH ICH阶段regener的通货膨胀要被分析（增殖期，神经元分化阶段，或突触发生）。这将决定如何消融后不久将小鼠sacrific版。分析在2增殖- 6天，神经元分化的不同阶段在3 - 7 21天，和突触- 21天（从所述第一突触联系到几乎完全再生）后甲巯咪唑治疗。接下来，考虑是否要学习的一个后OE他巴唑消融，反复损伤，或两者兼而有之。成熟OE细胞可能produc Ë酶即metaboliz Ë甲巯咪唑成细胞毒性产物。我们等待之间21天他巴唑诱导的消融，使为成熟OE细胞的再生。计划在您的实验中包括接受IP生理盐水控制的小鼠。注射。您也可以考虑注入荷兰国际集团溴脱氧尿苷以检查在后的特定时间点的细胞在S期甲巯咪唑治疗（如果有的话，请参阅参考资料一康，2013; Håglin等，2020）。
管理所述的第一剂量他巴唑，如协议A.注意概述吨他的协议，用于重复消融-再生周期中建立了C57BL / 6小鼠，通常重达40 - 60克和接收地E中的75毫克/千克IP 。甲咪唑的剂量。如果已根据协议A为特定鼠标线优化剂量即你计划来分析，使用该剂量来代替。
可选：对于单个消融周期，牺牲了在所决定的时间点小鼠和制备的组织（协议C）。
对于重复的甲硝唑诱导的消融后的组织分析，请等待21天。
管理的第二次注射甲巯咪唑在75毫克/千克IP 。（或您的最佳剂量）。
可选：对于两个消融周期，牺牲了在所决定的时间点小鼠和制备的组织（协议C）。
等待后21天-注射。
管理在第三次注射的甲巯咪唑在75毫克/千克IP 。（或您的最佳剂量）。我们评估了三个消融-再生循环，之后其中t他OE WA个相当严重的影响通过化生的大区域。
三个消融周期，牺牲的小鼠在所决定的时间点的第二制备的组织（协议C）。

组织制备，FIXa的灰，和组织学分析（支持协议）
这是用于优化的完全消融所需的剂量时产生OE组织切片进行快速分析的通用协议的OE，作为解决由协议A.该通用协议也为analys有用是在使用OE和OB许多不同的抗体。但是，根据计划在组织上进行的分析，您可能需要定制方案或使用其他方案，因为某些抗体会识别组织中低聚甲醛固定后无法接近的抗原表位。此外，染色后卓越的标准组织学检查，以苏木-伊红例如，建议您在石蜡切片前嵌入组织。
制备4％在PBS（重量/体积）的多聚甲醛（4％PFA）上的同一天。请注意，PFA被分配了危险说明H350（可能导致癌症）和H317（可能导致皮肤过敏反应）；因此，请戴上手套和护目镜以防万一。在通风橱中处理工作时的粉末和解决方案。100ml的：w ^ eigh4克PFA并转移到一个玻璃瓶含有上的毫安的磁体和地点gnetic搅拌器。温90毫升蒸馏水在炉内的微波到几乎b注油，并倒入热水进入玻璃瓶，同时搅拌。加入5 - 10微升的5M的NaOH ，以促进溶解第ëPFA 。溶解后，加入10 ml 10 × PBS。每只小鼠计划至少40 ml 4％P FA。
另外，准备相同体积的1 × PBS和20％蔗糖的1 × PBS。这些溶液在使用时应该是冷的（例如，放在冰上）。

计划从实验小鼠及其控制中并行牺牲和收集组织，以避免可能的实验混淆因素。对于每个小鼠，标记一个50 -毫升管与动物的唯一标识号（或等同物）和地点在冰上。
按照牺牲小鼠与地方法规。一种建议是颈椎脱位，然后立即放血。请务必接受有关如何正确执行此过程的培训。
如图2所示，快速解剖OE和OB 。组织没有时间干燥。如果您打算在非常快速的表情动态，如蛋白质磷酸化分析的标记，你可能需要使用一个协议的通过心脏灌注组织的固定。注意然而，随着OE是在鼻腔肤浅，所述固定液体到达细胞的OE相当快，一旦该组织在4％PFA淹没，特别LY如果鼻腔被切开。
允许将OE组织在4％PFA中于4°C固定至少3小时（注意，使用某些抗体进行分析需要过夜固定）。每管使用约40 ml 4％PFA。建议使用摇摆平台对样品进行非常温和的搅拌。
倒掉4％PFA和冲洗的组织和管与1 × PBS。除去的使用一小块纸张T的管过量的PBS owel 。
对于小鼠年轻比2周老，这一步我运动自选。2.5至3周以上小鼠的组织需要脱钙以获得完整的组织切片，因为OE组织的鼻腔鼻甲中含有钙化的骨。支付与RDO组织decalcifi纳克溶液直到在组织软化骨。使用钝塑料（不是金属）镊子从现在开始到监控作为牛逼他的骨软化。骨骼应承受轻微的压力，根据老鼠的年龄，脱钙需要30到60分钟。在相同的时间长度内并行处理实验组织和对照组织。
注意：RD O脱钙显着降低了原位杂交信号。如果在原位杂交分析对所使用，过夜考虑4％PFA固定，在4℃，接着decalcif ication与0.215 - 0.5在1M EDTA × PBS在4℃下，而不是（至少1 - 2晚，检查骨的柔软度（用镊子）（Ryan等，1991 ；Ishii等，2004 ）。

倒掉RDO和冲洗的组织和管与1 × PBS。除去的过量PBS的管与小片纸吨的owel 。
通过在4°C下于1 × PBS中的20％（重量/体积）蔗糖中孵育过夜至24小时，从而对组织进行冷冻保护。建议进行轻柔的搅拌。每个样品使用40毫升。
的组织的表面上的残留的蔗糖会导致困难在retriev荷兰国际集团的组织切片，因为该ÿ可以从分离冷冻安装包埋介质。倒掉蔗糖和迅速地除去的过量通过冲洗的组织和管1的小体积× PBS ; 这样可以避免冷冻后在组织周围形成蔗糖膜。除去的过量PBS的组织与小纸片吨owel但不允许组织干燥。
将在组织中的标记cryomold与该朝上鼻子。我ndicate在模具上的鼻子的方向，让您在以后安装cryoembedded组织在低温恒温器的正确方向。用冷冻剂包埋介质填充模具，使其完全覆盖组织。
可选：Ó向上rient鼻子和将模具下一个高达500毫巴的真空进行10 -在室温下20分钟。如果鼻腔中存留有空气，它将缓慢地浮出水面（注意气泡）。去除空气可以减少组织切片的难度。
将模具放在干冰上，并用镊子或移液器吸头将组织冻结，使组织保持正确的方向。使其完全冻结，然后将模具直接移至– 80°C进行存储。
冠状OE组织切片通常用于分析。计划你如何应该安排在显微镜载玻片上的截面和沿前分析不同级别- posterio鼻腔的R轴（图1 d ）。切口10 - 12微米厚的切片，在一个相对冷的温度，例如围绕- 20℃。从组织的鼻端开始切片。收集截面的pproximately每10 - 20部分，以评估是否你已经达到OE和/或OB的区域和磨片ñ更频繁地收集部分用于特定的实验。
注：我t是很难从鼻腔比从软组织收集完整部分，因为鼻区域具有组织的组合具有非常不同的硬度和弹性。如果很难获得完整的切片，请考虑将脱钙时间超过30分钟。

使用前，将组织切片的切片保存在– 20°C或– 80°C下。
解冻滑动š在室温下，让干燥约15分钟。
对消融污渍的程度进行快速评估，例如，使用浓度为0.0005％（重量/体积）的荧光核染色剂Hoechst进行3 – 5分钟，然后使用自来水进行3 – 5分钟。使用甘油或所选的安装介质和盖玻片进行安装。
在带有过滤器的荧光显微镜下检查组织切片是否发出蓝色（图1E）。

图2。鼻和OB组织的解剖。A.解剖程序的示意图。是光- ^ h相与不要用手握住组织挤压，而用另一只手解剖。乙Ë快速（practi ç执行计划实验前ê夹层）。1 =头; 2 =揭去使用钝器解剖（皮肤即，手指）镊子和; 3 =切断下颌; 4 =小心地切开前牙周围的骨头; 并去除牙齿通过仔细分离使用包换反复轻柔侧向移动用钳; 5 =剪去O的颧骨骨和除去的眼睛和任何软组织仍然在面部骨骼; 6 =用镊子剥去软pa（灰色）。握住牙齿并用镊子小心向外弯曲牙齿; 7 =切下颅骨，使其“鼻子朝上”地站立在冷冻嵌入模具中。要确保你知道哪里有OB是这样，你不砍它的路程，如果你计划分析的OB（如果没有，它可以被删除）。B.解剖的鼻组织的图像。中号方舟其中OE是用在鼻腔和嗅球的位置在OB 。甲克颖星号（*）标记的相应区域在示意图中所述的7和B.

图中的细胞类型的3。实施例的一个后OE甲巯咪唑治疗或重复OE消融-再生循环。A.在神经系的示意图的OE（sustentacular ，微绒毛，并Bowmann的腺细胞是未示出）。成熟嗅感觉神经元（OSNm ，阳性OMP，绿色），未成熟的嗅觉感觉神经元（OSNI ，阳性STMN1，在品红色），球状基底祖细胞（GBC，正面为Ki-67的，在白色），和水平基础祖细胞（HBC，正面为ç ytokeratin 5，在黄色）。B.的免疫荧光分析的前正常OE甲巯咪唑治疗（成熟绿色，未成熟的神经元的神经元在品红色）。甲巯咪唑处理后48小时，仅保留具有圆形形态的活化水平基底细胞（黄色）。后6天-处理与甲巯咪唑，最突出的细胞类型是分割球形祖细胞（白色）。在的外观上的差异的单次剂量后OE 2和4周之间的甲巯咪唑是，更多的未成熟的神经元（品红色）有4周分化为成熟的神经元（绿色）。反复消融由他巴唑治疗，每21天导致OE不再regenerat荷兰国际集团有效。此外，重复的消融后，存在分泌的逐渐增加（阳性的Fc γ BP ，在绿色）和纤毛ř espiratory化生补丁（阳性RALDH1 / 2，在绿色）中的OE （Håglin等人，2 020 ）。虚线标记了基底层的位置。所有切片均用蓝色的核染色剂Hoechst染色。比例尺，25 µm。

致谢

这项工作是由瑞典脑基金会（项目编号FO20180195）的支持d的在技术，自然科学教师于默奥大学。该协议改编自（Håglin等人，20 20）。

利益争夺

笔者小号声明没有C ompeting经济利益小号。

伦理

所述experime NTS导致协议的发展是由核准大号OCAL Ë thics Ç ommittee为甲nimal - [R esearch在Ç的ourt甲ppeal为诺尔兰的上北部地区，乌默奥，瑞典（ID A15-2015为周期4/24/2015至4/24/2020 ）。

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