材料和试剂

1.纱布（Dentalcremer）

2. 16 G针（Becton Dickinson，目录号：305198 ）

3. 21克针（Becton Dickinson，目录号：305165 ）

4.剃须刀片（无特定品牌）

5.液体肥皂（无特定品牌）

6.注射器（5毫升和10毫升）

7.操作员防护装备：手术手套和口罩

8. Mononylon 3.0缝合线（Ethicon，强生医疗设备公司）

9. Mononylon 4.0缝合线（Ethicon，强生医疗设备公司）

10.从机构动物设施获得的雄性Wistar大鼠（200-300 g）

11.异氟烷100％（Cristália，Isoforine ® ），在室温下保存

12.亚胺培南西司他丁（默沙东公司，泰能® ），保存于4 ℃下

13.盐酸曲马多50 mg / ml

14.氯胺酮（BioChimico，cloridrato de cetamina），在室温下保存

15. 2％的甲苯噻嗪（Syntec，xilazin），在室温下保存

16.酒精70％（Rioquimica，rialcool 70），在室温下保存

17.无菌盐溶液0.9％wt / vol（Fresenius Medical Care Ltda）

18.聚维酮碘（Rioquimica，riodeinetopico），在室温下保存

设备

手术器械：解剖剪刀，显微解剖剪刀，笔直的手术钳，笔直的解剖钳和持针器（IncolInstrumentosCirúrgicos）。
注意：使用前，请通过高压灭菌器对这些器械进行灭菌。

婴儿床暖床（阳光加热垫，目录号：000756-500-000U）
异氟烷气化器（Harvard Apparatus，75-0239 INT，目录号：1073/216）

程序

术前设定
根据《国家研究委员会实验动物的护理和使用指南》（国家研究委员会，2011年）设计研究和实验。
称重动物以确认所有重量都在200-300 g范围内，并使用各个重量来确定抗生素的剂量和要使用的液体复苏的量，以及在需要麻醉的情况下氯胺酮和甲苯噻嗪的剂量。。
用消毒湿巾或酒精清洁和消毒手术台。

麻醉
用异氟烷（0.25-2.5％/ kg BW气体吸入）或氯胺酮（80-100 mg / kg BW ip ip）和甲苯噻嗪（5-15 mg / kg体重ip）麻醉动物，以进行常规测试，例如心血管疾病，肺部或肾脏研究。
注意：通常，体重约300 g的大鼠对麻醉药的耐受性更高，因此我们建议根据上述范围增加剂量。

捏住尾巴和脚趾，验证麻醉效果。通常，在施用麻醉剂后1-2分钟内，四肢无反应。根据我们的经验，异氟烷可用于所有程序。
使用液体肥皂和剃须刀片刮擦下腹部区域。用纱布，酒精和聚维酮碘消毒该区域（图1A）。
将大鼠平卧在仰卧位置（图s 1A-1I）。
注意：如果需要培训或出于某些原因而需要大量的手术时间，我们建议使用手术滴眼液保护大鼠的眼睛。

盲肠结扎和穿刺
用剪刀和镊子在消毒区域做一个纵向切口（3-4厘米长）（图1B）。
从腹部肌肉解剖肌肉筋膜，并小心地切一个3至4厘米的切口（图1B）。
找到盲肠，使用解剖镊揭露它（即，把它拿出来腹腔）。在许多情况下，盲肠位于腹部的左侧（图1C）。
注意：仅暴露盲肠并将肠留在腹膜腔内，注意不要损坏肠系膜血管（图1C）。

假手术组：完成步骤C3后，将盲肠放回腹腔，然后按照步骤C8和C9中的d所示，关闭腹部肌肉和皮肤。

用细镊子用不可吸收的丝线3.0穿过盲肠肠系膜以结扎盲肠（距盲肠尖端1.5厘米或盲肠的50％；图1D）。
注意：将盲肠内容物留在盲肠尖端附近，并保持肠道通道（通过回盲瓣）畅通（图1E）。

用16 G针刺穿盲肠远端盲肠两次。穿孔应穿过盲肠（图1F）。
挤压穿刺的盲肠远端，以提取少量粪便（约2滴）并将其分布在盲肠和腹膜腔周围（图1G）。
注意：提取相同数量的粪便，并将其分布在所有动物的相同区域。使用镊子分发

小心地将盲肠放回腹腔中（即不要在腹部抽出更多的粪便）。
通过简单的缝合即可闭合腹部肌肉。在完成封闭之前，在37°C（25 ml / kg BW ip ip）下用预热的0.9％盐水溶液或0.15 M NaCl进行液体复苏，如图1H所示。
用简单的缝合线闭合腹部皮肤（图1I）。
注意：理想情况下，所有这些步骤均应在10分钟内执行，并应从第一个手术步骤开始控制（视频1 ）。

图1.大鼠盲肠结扎和穿刺模型。A.下腹部消毒和剃须。B.在皮肤和肌肉筋膜中的纵向切口。C.盲肠暴露。DE。盲肠结扎（盲肠中）。F.用16 G针刺穿盲肠远端。G.在盲肠和腹膜腔周围挤压和分布粪便。你好。腹部肌肉筋膜和皮肤关闭。

视频1.大鼠的盲肠结扎和穿刺模型。该视频是根据圣保罗大学动物护理指南从圣保罗大学（USP）制作的，并由圣保罗大学医学院研究伦理委员会批准，协议编号为378603 。

术后护理
腹部闭合后，注射盐酸曲马多50 mg / ml（剂量：5 mg / kg im，每8小时一次）用于术后镇痛，并在必要时继续进行。
立即将大鼠放回预热的笼子中，并在每个笼子下面放一个婴儿床（25°C）。注意：应提供食物和水。
手术后6小时（假手术或CLP），在异氟烷麻醉下，施用亚胺培南-西司他丁（13 mg / kg体重的生理盐水，皮下注射）。然后在25°C下注入0.9％的盐溶液（在盐溶液sc中为25 ml / kg BW）。
注：生理盐水皮下注射（SC），应分配ð在不同的腹部地区，我们建议在至少5个名额。注意并避免在特定区域内使用大量溶液

立即将大鼠放回到温度受控的环境（20°C）中的笼子中，进行12/12小时的明暗循环，可以随意获取食物和水。应每6小时对动物进行一次监测，并应在24 h或48 h评估结果。

笔记

该大鼠CLP协议反映了败血症患者的临床情况。尽管在脓毒症诱发后6小时进行了液体和抗菌疗法，但大鼠仍会发展为MODS，总死亡率为30-60％（图2）。结果是可再现的，如已经在临床前研究中得到证实（Rodrigues的等人，2012;莫雷拉等人，2014; COND或等人，2016; CAPCHA等人，20 20 ）。但是，与规程的偏离，特别是在盲肠结扎或盲肠穿刺步骤中，可能会导致某些可变性。容积复苏对于维持大鼠的中心血容量极为重要。进行液体复苏是为了模拟败血症早期（超动力）阶段给予患者的治疗。将盐溶液预热（至37°C）以避免医源性体温过低，这很可能会影响CLP程序的结果，这一点也很重要。应采取预防措施，避免盲肠出血和回盲肠阻塞，这可能导致大鼠停止饮水并进入低血容量性休克。

图2.大鼠的生存曲线。通过盲肠结扎和穿刺（CLP，n = 12）或进行假手术（n = 16）诱发败血症的大鼠的存活率，在手术后6 h进行液体和抗菌治疗。

在脓毒症患者，流体如盐水或晶体液（即，林格氏乳酸盐溶液）按照制定的准则被施用（歌手等人，2016）。尽管总给药量根据每个患者的病情而有所不同，但应足以恢复正常的血液量和压力，从而确保器质性灌注。在临床实践中，初始抗微生物应该是一种广谱抗生素，应该重新-微生物学结果是已知的后评价。早期的抗微生物治疗和重点控制与良好的预后相关（Rello et al。，2017）。在我们的机构中，我们使用广谱抗生素亚胺培南-西司他丁作为败血症患者的一线治疗药物。与患者一样，在脓毒症的实验模型中应牢记所有这些要点，以便在轻微控制疾病的同时诱导MODS。

在我们的临床前研究（Rodrigues的等人，2012;莫雷拉。等人，2014;Ç ó ndor 。等人，2016; CAPCHA 。等人，20 20 ），MODS在24小时观察到的CLP后。已经采用我们的CLP协议的版本研究报道，主要的作用是肾，心血管和肺功能障碍（罗德里格斯等人。，2012;莫雷拉等人2014;Ç ó ndor等人，2016年CAPCHA等。，20 20 ）。此类研究还报告了败血症诱发的急性肾损伤，可通过评估菊粉清除率，肾小管转运，尿渗透压和线粒体形态以及肾小球功能障碍，肾小管病变（尿液浓缩缺陷和电解质分数排泄减少）来确定，以及炎症（Rodrigues的等人，2012;莫雷拉等人，2014;ç ó ndor 。等人，2016）。我们的CLP协议的版本还促进肺部炎症，由较大的巨噬细胞浸润和TLR4的表达所证明巨噬细胞的表面上的（C ó ndor等人，2016; CAPCHA 。等人，20 20 ）。

CLP后，血清中细胞因子水平显着增加，导致微血管内皮细胞受损。还已经证明，CLP导致内皮一氧化氮合酶Slit2和Robo4的表达下调，这些蛋白负责维持内皮屏障的完整性（Moreira等，2014）。此外，有相当多的证据表明该手术会导致心脏损伤，表现为舒张功能障碍，左心室舒张末期直径和压力降低以及心率持续升高（Moreira等人，2014）。脓毒症可以减少的Klotho，其已经用更糟糕的结果相关联的肾表达（C ó ndor等人，2016）。脓毒症的特征在于高炎症机制，TLR4 /核因子-κB信号传导是最常被定义为评估治疗结果的参数的机制之一。此外，据报道在诱发败血症的动物中肾脏，脾脏，心脏和血清中促炎性细胞因子的过表达。由于这种炎症性疾病，还报道了涉及BAX和Bcl-2表达以及末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记阳性细胞的凋亡机制（Rodrigues等，2012； Moreira等）人，2014;ç ó ndor 。等人，2016）。我们的CLP协议版本可以引起这些败血症的主要机制。

CLP模型可以适应每个实验室的需求/目标。在我们的CLP协议版本中，死亡率达到了MODS的终点。建立这种新颖的CLP方案是为了模拟ICU败血症患者的病情。如果仔细管理所有技术参数，则涉及受控MODS的该方案已被证明可重复进行。

致谢

这项研究得到了圣保罗埃斯帕多萨·安帕罗基金会的资助（圣保罗研究基金会，FAPESP；批准号：2010 / 19012-0）。JMCC是FAPESP赠款的获得者（赠款编号2015 / 21308-9）。LA是来自巴西的赠款的接受者Conselho国立DesenvolvimentoCientíficoËTecnológico （国家委员会科学和技术发展;授予第301193 / 2016-9）。

本协议改编自Wichterman等人。（1980）。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突或利益冲突。

伦理

位于巴西圣保罗市的圣保罗大学医学院附属医院dasClínicas的研究伦理委员会已批准使用此协议（参考号378603）。所有程序均符合《美国国家研究委员会实验动物的护理和使用指南》（国家研究委员会，2011年）。

参考

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