材料和试剂
纸巾
铅笔
橡皮
丁腈手套（例如，Genesee Scientific，X-GEN丁腈手套，目录号：44-100）
微光源（即，台灯）
食物奖赏（即，可可卵石TM ）
称量皿（例如，鱼呃科学，六角称重盘，catalo摹号：02-202-102）
数据记录表（请参阅附录1）
实验上幼稚的雄性Long-Evan大鼠，体重在300克至400克之间（约3-4个月大）；从查尔斯河订购
水
乙醇70％（例如，Fisher Scientific，Decon Laboratories，目录号：04-355-223）
注意：本节中列出的材料是根据使用提供的协议在实验中成功使用的材料得出的；然而，使用不同的大鼠品系/体重/性别和食物奖励也可能是成功的。

设备

图8-迷宫（图1）
迷宫由磨砂的灰色硬质聚氯乙烯制成。

尺寸：跑道尺寸为10.3厘米，每侧高3厘米。迷宫的中央茎测得为120.4厘米，中央茎末端的横片长90厘米。将迷宫放在五只腿的顶部，每只腿的长度为68.5厘米。两个可移动的障碍物在中央茎的一端相隔26.3厘米。两个可移动门之间的侧墙高24.5厘米，并创建了延迟区域。顶部十字形末端的两个圆圈是奖励位置（奖励位于延迟期结束时的位置）。

图1.图8迷宫用于行为测试。A. 8号迷宫的照片。延迟位点位于中心茎远端的侧挡板内。B.迷宫的插图以及每个部分的测量规格。圆圈标识奖励站点。

秤（例如，Fisher Scientific，目录号：20031）
PVC障碍物：尺寸：10.3厘米宽以适合跑道宽度
秒表（如。，Fisher Scientific公司，目录号：14-649-8）
笔记本电脑
红外摄像机（ZOSI 1080P HD 1920TVL，型号：1AC-2317A-B）
白噪声发生器（例如，HoMedics Sound Spa的Portale白噪声声音机； 2,000 Hz，70dB）

软件

以下列出的软件与根据提供的协议成功使用的软件有关；因此，使用替代软件进行评分也可能是成功的。

微软Excel
在线音调发生器（https://onlinetonegenerator.com/）
统计软件包进行数据分析（即，的GraphPad Prism，SPSS，R）

程序

一般信息
大鼠应单独饲养。
使大鼠处于12小时的明暗循环中，并在亮周期中进行行为测试。注：乙在黑暗阶段ehavioral测试也可能是成功的。
行为训练之前，只应逐渐剥夺食物，直到REAC兴80％-85％，他们的自由采食量，而且应保持在整个实验过程中这个重量。
应始终保持有水。
动物应在习惯日前至少4天在其家笼中接受可可卵石TM 。
在这4天内，所有实验人员都应处理动物（实验人员每只动物约5分钟）。
在行为训练之前，应每天对大鼠称重。
每次行为训练结束后，应在30分钟内给大鼠喂食。
实验应始终在一天的大约同一时间进行，并且要完全安静，但白噪声发生器在低音量下会产生恒定的白噪声。
每只大鼠应被带到实验室并分别返回到饲养箱。
应避免任何不必要的干扰。
应提供气味提示，以防止老鼠根据奖励的气味做出决定。可以将充满可可卵石TM的称量船用胶带粘贴在两个奖励区域下的迷宫下方，以平衡所有嗅觉提示。
实验人员不应穿着古龙水/香水或浓烈的除臭剂。
房间中应有明显的视觉提示（例如，不同大小和图像的墙贴），并且应保持恒定。

^ h abituation
每只大鼠将被允许自由地自由探索迷宫，并连续两天熟悉房间和迷宫10分钟。可可卵石TM应该散布在整个迷宫中。
每隔10分钟结束后，将大鼠放回笼子中，并用70％的乙醇溶液清洁迷宫。在将下一只老鼠放在迷宫之前，请确保迷宫是干燥的。
确保家笼床上用品保持清洁以避免老鼠消耗其废物。这可能会干扰食物剥夺程序/体重减轻。
在行为训练结束后的30分钟内，根据体重给所有大鼠喂食，以使受试者保持在其随意体重的〜80％-85％左右。
在整个习性中，将部分食物奖励添加到动物的笼子中，以避免恐惧症。

训练阶段
1.在两个单独的窗口中打开在线音频生成器（https://onlinetonegenerator.com/）（图2）。

设置一个窗口中播放10秒2 ，在70 dB的体积000赫兹音调
设置另一个窗口打了20秒2 ，在70分贝音量000 Hz的音调

图2.在线音调发生器设置配置。在行为测试过程中，便携式计算机上用于传递相应音调的窗口布置的示例。

2.在第七天，称重动物并将其放在器械中央茎的底部，面对延迟区。每次审判都应从这个位置开始。

3.将动物放置在延迟区域后，关闭障碍物，并使用先前设置的在线音调发生器播放10 s或20 s音调。

4.声音结束时，抬起延迟区域障碍物，并用可移动的障碍物迫使动物在延迟时间为10-s时向左转，或在延迟时间为20-s时向右转。可以在动物之间平衡手臂（左/右）和延迟（10-s / 20-s）（这样一些动物被训练在延迟10s后向左转，而其他动物被训练在这种延迟后向右转））和两次试验之间（以便每次会议之间的试验顺序都不同）。Ť这里应该总是在选择臂端部的奖励。有关培训阶段的说明，请参见图3。

图3.培训阶段的示意图。A.图8迷宫的插图，每个延迟间隔都带有奖励站点。B.相应音调和转向的示意图，以便获得奖励。在测试之前对动物进行训练，方法是在播放十秒钟的音调后向左强制，在播放二十秒钟的音调后向右转。

5.消费完奖励后，老鼠必须返回到延迟区。防止老鼠转身并追回自己的路线至关重要。

6.每节应持续30分钟或40次试验（以先到者为准），并且10秒和20秒试验的次数应相等。

7.重复此过程，使用可移动的障碍物引导动物，直到动物一致且正确地导航迷宫并在连续2天的每次试验中吃掉奖励。

注：我ñ我们的研究中，大鼠需要的任何地方从7-25天达到这个标准。

8.每次实验后，用70％的乙醇溶液清洁迷宫，并在开始下一只动物之前确保其干燥。

9.根据行为量，在行为练习结束后30分钟内给大鼠喂食。

测试阶段
1.称重被摄对象，并将其放置在设备中央柄的底部，面对延迟区域。每次审判都应从这个位置开始。

2.应逐步淘汰使用障碍物迫使动物向左或向右转弯。在延迟期间播放10或20 s音调后，将解除障碍，老鼠将可以自由进入任一选择臂。

仅因选择与歧视性刺激配对的手臂而获得奖励（例如，延迟10秒=左侧奖励；延迟20秒=右侧奖励）。有关测试阶段的说明，请参见图4。

图4.测试阶段的图示。A.图8迷宫的插图，每个延迟间隔都带有奖励站点。B.正确和不正确试验的示意图。每次延迟后，大鼠都可以选择向左或向右转；延迟10秒后向左转或延迟20秒后向右转获得奖励。

3.即使允许大鼠无障碍奔跑，实验者也应确保通过转弯时保持障碍物的方式来阻止大鼠在任何时候追踪步伐。

4.每节应持续30分钟或40次试验（以先到者为准），并且10秒和20秒试验的次数应相等。

5.对于每个试验中，得分选择臂为正确或不正确（S EE附录1 FO ř样本评分表）。

6.在行为训练结束后30分钟内，根据体重给每只动物喂食。

7.每次使用后，用70％的乙醇溶液清洁迷宫。

8.每天重复测试阶段，直到动物在3天内的2天内以90％的正确应答执行任务。

9.当大鼠连续3天中有2天达到至少（90％）次正确试验的标准性能时，可以进行类似病变手术的操作。

注：我ñ我们的研究中，大鼠需要的任何地方从5-25周达到这个标准。

10.在术后阶段，重复该过程，以测试所执行的操作是否CA所使用的行为或生理损害。

11.图5展示了改编自Sabariego等人的样品测试时间表。（2021年）。

图5. TDD任务中病变实验的测试时间线示例。样本实验时间表（改编自Sabariego等人，2021年）。

数据分析

注意：使用Microsoft Excel或类似软件记录实验每个阶段的行为数据。

在测试阶段，使用以下各列将数据输入到Excel电子表格中（图6）
测试日（例如，第1天，第2天，第3天）
老鼠编号/字母
试用次数（1-40）
正确的审判
试用不正确
％正确的

图6. Excel电子表格，显示第二阶段的记录数据以及结果汇总表（右侧），其中包含正确试验的总和，错误试验的总和以及正确试验的百分比。列1代表小号会话（天）每只大鼠。每节（一天）总共有40个试验：所有试验均用于分析，但此图中显示的试验仅限于试验1、2、3、38、39和40。有8只大鼠：AD是假大鼠，EH是患病的大鼠。

每次完成正确的试验后，输入1，否则输入0。
正确试验和不正确试验的列应为正确/不正确试验的计算所得之和，正确率百分比应为正确试验的计算所得百分比。
在整个测试阶段，将数据输入一个单独的表中，以跟踪每个大鼠何时达到以下各项的标准性能（请参见图7）。
测试日期（例如，第1天，第2天，第3天）
每只大鼠用单独的柱子。
记录每天每只大鼠的正确百分比。
突出显示超过80％的任何内容。
突出显示90％+的其他颜色。

图7. è艾克赛尔表格显示了正确的百分比有关测试的每一天每只大鼠。以蓝色突出显示的方框是大鼠得分为80 ％-89％的会话，以绿色突出显示的方框是大鼠达到90％标准的会话。连续三天中有两天达到标准性能的大鼠已完成测试。这些大鼠被指定了手术类型，并且测试的最后一天记录在其栏的底部。

使用统计软件包（即，SPSS，ģ拍摄和P广告P RISM，R）叔Ô执行双向ANOVA推论来分析动物组和类型德拉之间的差异YS。图8示出了从Sabariego等人改编的代表性数据。（2021年）。穆的显著的相互作用ltiple比较可以采用事后检验来分析。

图8 。在TDD任务中从病变实验绘制的示例代表性数据示例。在每只大鼠的术后测试的前10天中，海马（HIPP）和假病变大鼠的正确反应百分比以延迟时间分隔。的TDD任务期间获得正确反应百分比的方差的三因素分析发现显著相互作用天×延迟X病变以及x延迟天之间，和病变的主要效果，* P < 0 0.05，** P < 0 0.01（改编自Sabariego等人，2021）。

致谢

该协议改编自Sabariego等。（2021年）。这项工作得到了圣地亚哥大学文理学院和霍利奥克山学院的支持。作者要感谢S cidraw.io （doi：10.5281 / zenodo.3926042。）提供了免费的图形，以帮助创建图形摘要。

利益争夺

作者没有利益冲突。

伦理

所有实验程序均由圣地亚哥大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC批准号0416-01和0319-01）和霍利奥克山学院（IACUC批准号NR-01-0620）批准。

参考

Eichenbaum ，H.（2014年）。海马中的时间细胞：映射记忆的新维度。纳特ř EV神经科学15（11）：732 - 744。
Heys，JG和Dombeck，DA（2018）。内侧内嗅皮层中一个子回路的证据代表了固定期间的消逝时间。纳特Ñ eurosci 21（11）：1574年- 1582年。
Kraus，BJ，Brandon，MP，Robinson，RJ，2nd，Connerney，MA，Hasselmo，ME和Eichenbaum，H.（2015年）。在就地运行期间，网格单元会整合经过的时间和距离运行。神经元88（3）：578 - 589。
MacDonald，CJ，Lepage，KQ，Eden，UT和Eichenbaum，H.（2011）。海马“时间细胞”弥合了内存中的不连续事件。神经元71（4）：737 - 749。
Sabariego，M.，NS，Tabrizi，G.Marshall，GJ，McLagan，AN，Jawad，S。和Hales，JB（2021）。在情景记忆的时间结构中，海马支持经历的时间。海马31（1）：46-55 。
Schlesiger，MI，Cannova，CC，Boublil，BL，Hales，JB，Mankin，EA，Brandon，MP，Leutgeb，JK，Leibold，C.和Leutgeb，S.（2015年）。内嗅皮层对于海马神经元活动的时间组织是必需的。Nat Neurosci 18 （8）：1123年- 1132年。