材料和试剂
1.7 ml Posi-Click TM试管（Denvelle，目录号：C2170）
96孔平底板（Thermo Scientific，目录号：12565136）
铝箔（Fisher Brand，目录号：01-213-100）
微量移液器防渗吸头（10个起） μ l至1000 μ升）（杰纳西Scientific）中
8-10周大的C57Bl6 / j小鼠
4-硝基苯酚（Sigma-Aldrich，目录号：241326-50G）
4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N9376）
4-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N0877）
4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N7006）
新鲜或-80°C储存的粪便颗粒
丙酮（EM Science，目录号：AX0120-8）
脱氧核糖核酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：11284932001）
溶菌酶（Fisher Bi oReagents TM ，目录号：BP535-1）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M-0250）
甲醇（Fisher Chemical，目录号：A433P-4）
对硝基苯基α-L-呋喃果糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N3628）
对硝基苯基β-D-吡喃吡喃糖苷（Sigma-Aldrich，目录号：N2132）
Pierce TM BCA蛋白分析试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23227）
氯化钾（KC升）（西格毫安-Aldrich公司，目录号：P9541-500G）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（罗氏，目录号：26733200）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T-9284）
盐酸Trizma （（Sigma-Aldrich，目录号：S8045-1KG）
4-硝基苯基（4NP）标准曲线（请参见配方）
粘液溶解酶缓冲液（请参见食谱）
硝基苯基连接的底物及其相应的粘液溶解酶（请参见食谱）

设备

一对无菌钳
-80 °C冰箱（Thermo Scientific）
离心机（Thermo Scientific，Legend Micro 21R）
制冰机（星崎美国公司）
微量（从10微升至1 ，000微升）（Labnette ）
多通道移液器（300μl）（Fisher品牌）
带有3毫米锥形微尖端的声波发生器（Branson Digital Sonifier，型号：102C）
分光光度计（TECAN，SPARK 10M）
Vortex Genie 2（VWR科学产品）
称重天平（ADAM设备，PW124）

再修改的è

从每只小鼠收集2-3个粪便沉淀物（约50 mg）到管中。
注意：粪便可以在-80 °C下保存直至测量。

向装有粪便沉淀的试管中加入0.5 ml冰冷的粘液溶解酶缓冲液（配方1 ），并轻轻涡旋。
注意：如果粪便不牢固，则无需进行顶点处理。

使用超声处理器超声处理样品5秒钟，振幅为35％，并在冰上放置3 mm的锥形微尖。间隔10 s后重复超声处理，共9个周期或45 s。
在4 °C下以10,000 × g超声处理样品10分钟。
将〜400μl上清液转移到新鲜的1.5 ml管中，并测量蛋白质浓度。
注意：上清液可以在-80°C下保存，直到测量。

通过添加冰冷的粘液溶解酶缓冲液将蛋白质浓度调节至1 mg / ml。
将特定粪便样品的5μl（5μg蛋白）上清液转移到96孔平底平板的三个孔中（每个5μl）。加入150μl在冰冷的粘液溶解酶缓冲液中制备的基于10 mM硝基苯的特定底物（配方2 ）。对于每种测试的酶，将相应的底物添加到包含相同样品的一式三份孔中。当使用多个样本时，将重复这些过程。
每隔30分钟在37°C的读板器中测量405 nm处的吸光度。
使用已知浓度的4-硝基苯酚标准曲线（配方3 ），确定各个粘液分解酶的活性（图1）。

图1.小鼠粪便样品中随时间变化的粘液分解酶活性。如协议所述，将从健康小鼠收集的粪便样品均质化并进行处理。指示的酶瓦特的活性如在以下的方案中描述的方法中的粪便裂解物测定。

菜谱

粘液溶解酶缓冲液（pH 7.25）
储备溶液工作溶液100毫升

1 M Tris 50毫米

100万KC l 100 mM

1 M氯化镁2 10 mM

溶菌酶5-10毫克

12％的Triton X-100 100 μ升

脱氧核糖核酸酶5-10毫克

蛋白酶抑制剂一粒

硝基苯基连接的底物及其相应的粘液溶解酶
硝基苯基连接的底物

粘液溶解酶

4-硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷

α-半乳糖苷酶

植物聚糖

4-硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷

粘蛋白

4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷

β-葡萄糖苷酶

植物聚糖

对硝基苯基α-L-呋喃核糖苷

α-岩藻糖苷酶

粘蛋白

对硝基苯基β-D-吡喃吡喃糖苷

β-木糖苷酶

植物聚糖

注意：我们上面提到了硝基苯连接的底物，我们在图1中使用了这种底物。

4- Nitrophen Ö升（4NP）标准曲线
4-硝基苯酚（4NP）是对硝基苯基连接的底物的酶促产物。在粘液溶解酶与其底物反应期间产生的4NP量对应于粘液溶解酶活性（配方2）。4NP提供黄色，可以在405 nm处用分光光度法测量。因此，可以使用4NP的标准曲线来测量粘液溶解酶及其对硝基苯基连接的底物的反应混合物中的粘液溶解酶活性。

一种。通过将0.0139 g（13.9 mg）4NP溶于1 ml甲醇中，制备100 mM 4NP（MW = 139.11）储备液。

b。准备1 mM 4NP（从100 mM 4NP）的工作储备液，用粘蛋白酶测定缓冲液进行标准曲线分析。

C。从在粘蛋白酶测定缓冲液中制备的工作储备液（1 mM）中制备一系列4NP浓度，范围从0到1,000 µM（或0到1 mM）。

d。将150 µl每种标准溶液加到包括空白的96孔板中，并在37°C下用分光光度计在405 nm处读取吸光度。

e。在X轴上绘制具有已知标准浓度的标准曲线，在Y轴上绘制吸光度。

致谢

该协议在Desai等人先前发表的研究中进行了较小的修改。（2016）。我们要感谢UT西南动物资源中心（ARC）对我们的小鼠群体的维护和照顾。Ť他的工作是预防癌症和得克萨斯州的研究所（CPRIT）个别研究者奖（RP200184）和UT西南资金给予支持HZ

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

这项研究已由机构动物护理和使用委员会（IACUC;批准号2016-101683）批准，并根据IACUC指南进行。

参考

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