材料和试剂
TC处理的烧瓶（Genesee，目录号：25-210）
奥林巴斯真空过滤系统500米升（杰纳西，目录号：25-227）
隼15米升锥形离心管（Fisher Scientific公司，目录号：14-959-53A）
隼50米升锥形离心管（Fisher Scientific公司，目录号：14-432-22）
康宁Transwell聚碳酸酯膜细胞培养插入物（Millipore Sigma，目录号：CLS3401-48EA）
无RNase微量离心管（1.5 m l ）（Fisher Scientific，目录号：AM12400）
Precellys裂解管VK05 ，2米升（Bertin的仪器，目录号：P000913-LYSK0-A）
Sep-Pak C-18 40毫克96孔酱（沃特世，目录号：186003966）
Fisherbrand 96孔DeepWell聚丙烯微孔板（Fisher Scientific，目录号：12-566-120）
康宁96孔固体黑色聚苯乙烯微孔板（Fisher S cientific，目录号：07-200-590）
人结肠直肠腺癌细胞系Caco-2（ATCC，目录号：HTB-37）
人结肠直肠腺癌细胞系NCI-H716（ATCC，目录号：CCL-251）
DMEM，高葡萄糖，带有L-谷氨酰胺（Genesee，目录号：25-500）
RPMI 1640，带有L-谷氨酰胺和酚红（Genesee，目录号：25-506）
GenClone胎牛血清（Genesee，目录号：25-514）
青霉素-链霉素100 ×溶液（Genesee，目录号：25-512）
胰蛋白酶-EDTA，0.25％1 × ，酚红（Genesee，目录号：25-510）
Gibco台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific ，目录号：15250061）
异硫氰酸荧光素-葡聚糖4 kDa（Millipore Sigma，目录号：46944-100MG-F）
Opti-MEM减少的血清培养基，GlutaMAX Supplement（Thermo Fisher Scientific，目录号：51985091）
Lipofectamine 3000转染试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：L3000001）
PBS 1 × （Genesee，目录号：25-507）
三氟乙酸（TFA）（Millipore Sigma，目录号：T6508）
盐酸（HCl）（Millipore Sigma，目录号：H1758）
甲酸（Millipore Sigma，目录号：F0507）
氯化钠（Millipore Sigma，目录号：S9888）
异丙醇（Millipore Sigma，目录号：563935）
GLP-1 EIA试剂盒（Millipore Sigma，目录号：RAB0201-1KT）
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific目录号：155626）
Promega CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒（Promega，目录号：PR-G7570）
细胞活力和增殖的MTT分析（Millipore Sigma，目录号：11465007001）
完整的媒体（请参阅食谱）
转染介质（请参见食谱）
用于GLP-1分泌的低血清培养基（请参阅食谱）
细胞裂解缓冲液（请参阅食谱）

设备

用于细胞计数的血细胞计数器（Weber Scientific，目录号：3048-12）
- 80 ℃的冰箱中
生物安全柜
水浴（37 °C）
组织培养培养箱（37 °C，5％CO 2 ）
倒置显微镜（Amscope）
台式离心机
荧光和吸光度板读取器（FlexStation 3，分子设备）
MagNA Lyser（罗氏诊断公司）
SpeedVac真空浓缩器（Thermo Fisher Scientific）
超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）和6120四极杆LC / MS光谱仪（Agilent Technologies）
qPCR仪器（QuantStudio 7 Pro，Thermo Fisher Scientific）

软件

SoftMax Pro 7（分子设备，http：//www.moleculardevices.com）
OpenLab色谱数据系统（安捷伦科技）
Applied Biosystems qPCR分析软件（QuantStudio 7 Pro，Thermo Fisher Scientific）
用于数据绘图和分析的Microsoft Excel和GraphPad Prism 7（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

生长细胞至融合
准备并过滤完整的DME M和RPMI介质（方案1）。使用前，将介质温热至37 °C。
解冻贴壁细胞系Caco-2，并重悬于完全的DMEM培养基中（Gagnon和Brubaker，2015）。解冻悬浮细胞系NCI-H716，并重悬于完全RPMI培养基中（Gagnon和Brubaker，2015； Lea，2015）。
分别接种两种细胞系成TC处理的烧瓶（接种密度为Caco-2细胞，1 × 10 4每厘米细胞2 ; NCI-H716细胞，4 × 10 5 -8 × 10个5每米细胞升），并立即转移他们到组织培养箱（5％CO 2 ，37 ° C）。介质在0.2微米加入升每cm 2 。
通道Caco-2细胞由第一剥离细胞与1 ×胰蛋白酶-EDTA（1米升每cm 2 ），用于在组织培养箱中不超过10分钟。细胞脱离后，将完整的DMEM培养基添加到烧瓶中以使胰蛋白酶失活，然后重悬于烧瓶中的完全DMEM培养基中，并以1：5的亚培养比例转移至烧瓶中，然后在组织培养箱中孵育。通过在Falcon管中收集细胞并在500 × g ，5分钟，室温下离心来传代NCI-H716细胞。除去上清液，将细胞重悬在新鲜的完整RPMI培养基中，以1：5的亚培养比例转移至培养瓶中，然后在组织培养箱中孵育。
在经过TC处理的烧瓶中培养Caco-2和N CI-H716细胞长达2周，以获得所需数量的细胞用于播种和分化（请参阅步骤A 3）。解冻细胞的适当数量的在小号TEP A2スCH其在2周内获得了所需的细胞数量，这是最佳的生长时间为健壮分化。细胞传代不得超过15次，以避免染色体分布的异质性，异质性会影响细胞系的分化和基因表达。使用台盼蓝染色在血细胞计数器中计数Caco-2和NCI-H716细胞。一旦达到所需的融合度，请继续进行区分步骤。
注：对于一个24孔转孔，20 Caco-2细胞和50,000个NCI-H716细胞将被要求启动分化（见小号TEP B3）。因此，每个细胞系用1个融合75 cm 2 TC处理过的烧瓶，可以播种约40个24孔transwell用于分化。

在Transwells中播种并分化细胞
要开始分化和共培养，请胰蛋白酶消化并收集Caco-2细胞，并在50 ml的Falcon管中收集NCI-H716细胞，然后离心（500 × g ，5分钟，室温）。
除去上清液，将细胞重悬在所需体积的新鲜完整DMEM培养基中。
在Falcon管中将200,000个Caco-2细胞与50,000个NCI-H716细胞混合，并在每个24孔板transwell插入物中接种以模拟人结肠中上皮细胞与肠内分泌细胞的比例（Cristina等，1978）。每个transwell插入物中的培养基和细胞的最终体积应为100 µl ，每个transwell插入物中接种的细胞的最终数量为250,000。
在transwell插入物的基底外侧腔中添加500 µl完整的DMEM培养基。在整个分化过程中使用DMEM介质。将板转移到组织培养箱中进行分化（第1天）。
在第4、8、12、16和18天更换培养基以区分细胞（Lea，2015年）。要更换培养基，请小心地取出培养基，首先从transwell的顶室（不要打扰或触摸接种的细胞），然后再从基底外侧室取出。替换为新鲜的，完全预热的DMEM培养基，首先是将100 µl培养基添加到顶端腔中，然后将500 µl培养基添加到Transwell插入件的基底外侧腔中。
细胞分化将需要21天。在第21天，分化的极化细胞已准备好进行测定（图1），并且必须在第27天之前使用。

图1.跨孔肠细胞的电子显微镜图像。A.第1天（未分化）和第21天（分化）Caco-2 + NCI-H716细胞的扫描电子显微镜（SEM）图像。分化的细胞具有单层细胞，细胞具有不同的微绒毛。比例尺从左到右分别为400 µm和4 µm 。B.分化的Caco-2 + NCI-H716细胞的透射电子显微镜（TEM）图像。星号（*）显示相邻细胞之间紧密连接，箭头（>）显示桥粒。比例尺，400 n m 。C.分化的Caco-2 + NCI-H716细胞的透射电子显微镜（TEM）图像。左侧的细胞是Caco-2上皮细胞，而右侧的细胞是NCI-H716肠内分泌细胞，具有相对移位的核（*）和暗颗粒（>）存在（Gonzalez等，2013）。Sca le bar，400 n m 。D.来自（C ）的NCI-H716细胞的高倍放大，显示出暗颗粒的结构（>）。星号显示原子核（*）。比例尺，2 µm 。哈佛医学院EM核心执行电子显微镜检查。

siRNA或shRNA质粒转染分化的Caco-2 + NCI-H716细胞
在低血清培养基（例如OptiMEM）中用转染试剂（例如Lipofectamine 3000）准备所需浓度的siRNA或shRNA质粒（例如40 nM）（配方2）。在分化的第19天，按照制造商的说明进行转染。
通过将低血清且无抗生素的培养基中的siRNA或shRNA质粒添加到100 µl的根尖腔和500 µl的基底外侧腔中，进行第一个siRNA或shRNA处理，并孵育12小时。
孵育12小时后，用完整的DMEM培养基替换培养基12 h。
孵育12小时后，在分化的第20天，通过将低血清和无抗生素培养基（例如OptiMEM）中的siRNA或shRNA质粒添加到100 µl的根尖腔和500的基底外侧腔中，进行第二次siRNA或shRNA处理μ升并允许温育12小时。
孵育12小时后，用完整的DMEM培养基替换培养基12 h。
在第21天，经过siRNA或shRNA处理的分化极化细胞已准备好进行测定，必须在第23天之前使用。

用小分子如胆汁酸处理分化的细胞以进行GLP-1分泌测定
在合适的载体（例如DMSO或PBS）中以所需浓度制备要测试的浓缩分子储备液。使用适当的媒介物作为阴性对照。不要使用> 10％的DMSO溶液以最小化DMSO对细胞和单层完整性的毒性作用。
准备不含抗生素的低血清RPMI培养基（0.5％FBS）（配方3），并在该培养基中制备分子稀释液（Gagnon和Brubaker，2015）。
在分化的第21天，从transwell的顶室和基底外侧室中取出培养基。
为测试分子在顶端处理时是否能诱导GLP-1分泌，可将稀释在低血清RPMI培养基中的分子（Gagnon和Brubaker，2015）添加到transwell插入物的顶端腔中，总体积为100 µl 。将500 µl低血清RPMI培养基添加到基底外侧腔中。单层将防止介质在腔室之间扩散。
为测试分子在基底外侧处理时是否能诱导GLP-1分泌，可将稀释在低血清RPMI培养基中的分子添加到transwell插入物的基底外侧腔中，总体积为500 µl 。将100 µl低血清RPMI培养基添加到根尖腔中。
在组织培养箱中孵育2小时。
在孵育过程中，用1％的TFA水溶液制备微量离心管，以收集基底外侧培养基，以使TFA的最终浓度为0.1％。保持冰上。例如，要收集1 ml的培养基，请准备在冰上装有10 µl 1％TFA的试管。
准备新鲜的细胞裂解缓冲液（配方4）并保持在冰上。
孵育后，收集基底外侧培养基，并转移至带有TFA的准备好的Microfuge管中。
除去顶端培养基，向每个孔中加入200 µl冷细胞裂解缓冲液（配方4）。轻轻刮擦transwell，收集细胞，然后将内容物转移到带有珠子的Precellys裂解管中。
溶解细胞，在一个的MagNA Lyser均质化在2 ，800 ×克1分钟，理想地在冷室中，以防止在均化过程的样品的加热。
将收集的细胞和培养基在-80 °C冷冻，以用于E中所述的将来分析。也可以使用GLP-1肽纯化和测量的替代方案。

GLP-1肽的纯化和定量（用于基于ELISA的GLP-1检测）
解冻在冰上冻结n个样品。
离心机媒体在1 ，800 ×克，在4 10分钟℃至沉淀细胞碎片。
在离心过程中，准备GLP-1肽纯化和洗脱缓冲液。缓冲液A（洗涤缓冲液）为0.1％TFA的水溶液，缓冲液B（洗脱缓冲液）为0.1％TFA的80％异丙醇的水溶液。
通过加入500μ预处理的Sep-Pak柱升缓冲液B的缓冲允许通过列或使用空气压力或离心机滴落在通货膨胀11000 ×克，1分钟通过列迫使缓冲。丢弃洗脱液。
通过添加500 µl缓冲液A平衡Sep-Pak色谱柱。使缓冲液滴入色谱柱中，或者使用气压或11,000 × g的离心力1分钟使缓冲液通过色谱柱。丢弃洗脱液。
用200-300 µl的培养基或细胞裂解液加载色谱柱。在室温下孵育5分钟。
使缓冲液滴入色谱柱，或者使用气压或11,000 × g的离心力1分钟，使缓冲液通过色谱柱。丢弃洗脱液。
加入500 µl缓冲液A进行洗涤。使缓冲液滴入色谱柱中，或者使用气压或11,000 × g离心1分钟，使缓冲液通过色谱柱。丢弃洗脱液。
加入500 µl缓冲液B洗脱GLP-1肽。让缓冲液滴入色谱柱中，或者用气压或以11,000 × g的速度离心1分钟，使缓冲液通过色谱柱。通过让流通液滴入孔中，直接将洗脱液收集在96孔板中。
将含有纯化的GLP-1肽的洗脱液在SpeedVac中干燥4小时。
重悬于100 µl 0.1％TFA水中，并于-80 °C冷冻，用于GLP-1测量分析。
根据制造商的说明，使用GLP-1 EIA试剂盒中的纯化肽测量总GLP-1水平，除用于标准化的媒介物对照外，还使用0.1％TFA的水作为阴性对照（图2A）。以下计算可用于确定GLP-1分泌百分比：
GLP-1分泌百分比=（分泌到培养基中的总GLP-1）/（分泌到培养基中的总GLP-1 +细胞裂解物中的总GLP-1）× 100。

用诱导TGR5表达的分子处理分化的细胞
在合适的载体（例如DMSO或PBS）中以所需浓度制备要测试的浓缩分子储备液。使用适当的媒介物作为阴性对照。不要使用> 10％的DMSO溶液以最小化DMSO对细胞和单层完整性的毒性作用。
在完整的DMEM培养基中准备分子的稀释液。
在分化的第21天，从transwells的顶端和基底外侧室中去除培养基。
要测试在顶端处理时分子（在这里我们测试的是胆汁酸代谢产物）是否会诱导TGR5表达，请将在完全DMEM培养基中稀释的分子添加到Transwell插入物的顶端腔中，总体积为100 µl 。加入500 µl完整的DMEM培养基至基底外侧腔。
为测试分子在基底外侧处理时是否能诱导TGR5表达，可将稀释在完全DMEM培养基中的分子添加到Transwell插入物的基底外侧腔中，其总体积为500 µl 。将100 µl完整的DMEM培养基添加到根尖腔中。此处使用完整的DMEM培养基为细胞提供最佳的FBS和葡萄糖，以便在下一步的过夜孵育过程中不会损害单层的完整性。
在组织培养箱中孵育过夜（最多16小时）。
孵育后，从顶室和基底外侧室移出培养基，并用PBS轻轻洗涤过孔。
将TRIZol或其他合适的缓冲液直接添加到Transwell进行RNA提取，并刮擦细胞以收集到Microfuge管中。
在-80 °C下冷冻，以备将来提取RNA和进行qPCR分析（图2B）。

图2.使用共培养transwell系统测试小分子TGR5激动剂诱导TGR5表达和GLP-1分泌。AB。胆酸-7硫酸盐（CA7S），一种天然存在的TGR5激动剂和GLP-1促分泌素，在顶端或基底外侧处理时，可诱导分化的Caco-2 + NCI-H716细胞中GLP-1分泌（A ）和TGR5表达（B ），与先前的观察相似（Chaudhari等，202 1 ）。（每种条件≥3生物学重复，CA 7S心尖GLP-1，** P = 8 × 30 -3 ; CA7S基底外侧GLP-1，* P = 0.03; CA7S心尖TGR5，*** P = 3 × 1 0 - 4 ; CA7S基底外侧TGR5，* P = 0.01，韦尔奇吨-试验）。仅在分化的Caco-2细胞中未观察到可检测的GLP-1或TGR5表达诱导。如先前所述（Chaudhari等，202 1 ）在哈佛医学院的ICCB-朗伍德筛选设施中进行了GLP-1吸光度读数和qPCR分析。图片数据一个在A.用于相对于GLP-1分泌的计算nalysis部的所有数据表示为平均值±SEM。

用分子处理分化的细胞，以确定肠道限制性特性，细胞毒性以及对肠道通透性的影响
在合适的载体（例如DMSO或PBS）中以所需浓度制备要测试的浓缩分子储备液。使用适当的媒介物作为阴性对照。不要使用> 10％的DMSO溶液以最小化DMSO对细胞和单层完整性的毒性作用。
在完整的DMEM培养基中准备分子的稀释液。
在分化的第21天，从transwells的顶端和基底外侧室中去除培养基。
要测试分子是否受到肠道限制，请将在完全DMEM培养基中稀释的分子以100 µl的总体积添加到Transwell插入物的根尖腔中。加入500 µl完整的DMEM培养基至基底外侧腔。
在组织培养箱中孵育过夜（最多16小时）。
潜伏期过后，在微离心管中收集基底外侧培养基。
使用适当的仪器和测定法检测和定量基底外侧介质中的分子（图3）。

图3.使用共培养transwell系统测试小分子TGR5激动剂的肠道限制性特性。A.胆酸酸-7-硫酸盐（CA7S，100μM）在分化的Caco-2 + NCI-H716细胞顶部处理时在基底外侧室未被发现。B.在分化的Caco-2 + NCI-H716细胞中进行基底外侧（100 µM）处理时，在根尖腔中未检测到CA7S。这些数据（A和B ）表明CA7S不通过肠上皮单层，并且表明CA7S受肠限制（每种条件≥3个生物学重复）。C. A和B的代表性UPLC-MS跟踪。D.在分化的Caco-2 + NCI-H716细胞中经顶端（100 µM）处理后，在基底外侧室中检测到天然存在的TGR5激动剂牛磺脱氧胆酸（TDCA）。E.基底外侧（处理当TDCA在心尖室少量检测100μM的分化的Caco-2 + NCI-H716细胞）。这些数据（D和E ）表明TDCA确实通过了肠上皮单层，并且表明TDCA没有肠胃限制（每种条件≥3个生物学重复）。F. D和E的代表性UPLC-MS迹线。如先前所述（Yao等人，2018 ; Chaudhari等人，202 1 ），通过基于UPLC-MS的检测直接在培养基中对CA7S和TDCA进行定量。所有数据均以平均值±SEM表示。

为了测试分子对单层细胞是否有毒性，可以根据制造商的说明和相应试剂盒中提供的培养基，使用MTT测定法或CellTiter-Glo测定法测定细胞活力（图4A）。
要测试分子是否损坏/影响肠屏障完整性，请通过异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-D，4 k Da）通透性测试来测试transwell的上皮完整性。
在黑暗中在PBS中制备5 µM FITC-D。
在分化的第21天，从transwell的顶端和基底外侧隔室中移出培养基。
将5 µM FITC-D溶液添加到带有细胞的穿孔插入物的顶腔中，然后将500 µl PBS添加到基底外侧腔中。
将板转移到组织培养箱中，并精确孵育20分钟。
孵育后，取出并丢弃transwell插入片段。
将100 µl的基底外侧室PBS转移到黑色的96孔板中。
通过在荧光板读数器中以485 nm的激发波长和530 nm的发射波长测量荧光来测量FITC-D（图4B）。

图4.使用共培养transwell系统测试小分子TGR5激动剂的毒性和对肠通透性的影响。A - B 。天然存在的TGR5激动剂7硫酸胆酸（CA7S）和牛磺脱氧胆酸（TDCA ）在MTT分析中不影响细胞活力（A ），在分化的Caco中的FITC-D分析中也不诱导肠道通透性（B ）。 -2 + NCI-H716细胞。这些结果表明，CA7S和TDCA对人肠上皮和肠内分泌细胞无毒。当TDCA经根尖治疗时，该化合物不会引起上皮毒性或破坏肠屏障完整性，这表明TDCA在基底外侧腔中的蓄积（图3D，F）可能通过主动或被动运输发生。未标有星号（*）的数据不重要。（每种条件≥3生物学重复。阿。CA7S与DMSO，P = 0.93; TDCA与DMSO，P = 0.62;乙。CA7S与DMSO，P = 0.26; TDCA与DMSO，P = 0.45，单方差分析（ANOVA）之后是邓尼特（Dunnett）的多重比较测试（）。如前所述（Chaudhari等，202 1 ）在哈佛医学院的ICCB-朗伍德筛选中心进行了MTT吸光度和FITC-D荧光读数。所有数据均以平均值±SEM表示。

数据分析

根据制造商的说明，使用从GLP-1 EIA试剂盒中的对照和试剂获得的标准曲线确定GLP-1的水平。GLP-1分泌百分比的计算方法如下：

GLP-1分泌百分比=（分泌到基底外侧培养基中的总GLP-1）/（分泌到基底外侧培养基中的总GLP-1）+细胞裂解物中的总GLP-1）× 100。绘制相对GLP-1分泌百分比（％）相对于DMSO控件。

笔记

所有细胞培养实验均应在生物安全柜中进行。
所使用的移液器吸头和血清移液器应预先消毒，并只能在生物安全柜中打开。
如前所述，使用基于UPLC-MS的分析方法进行胆汁酸的检测和定量（Yao等人，2018 ; Chaudhari等人，202 1 ）。

菜谱

完整的媒体
DMEM或RPMI媒体

10％FBS

1 ×链球菌

转染培养基
40 nM siRNA或shRNA质粒

OptiMEM介质

脂质体

用于GLP-1分泌的低血清培养基
5亿升RPMI

0.5％胎牛血清

细胞裂解缓冲液（新鲜制备）
1％TFA

1 M盐酸

5％甲酸

1％氯化钠

致谢

我们感谢Devlin实验室（哈佛医学院，HMS）的成员进行的有益讨论。我们想感谢HMS的Clardy实验室和ICCB-Longwood筛选设施在设备和试剂方面的帮助。我们感谢HMS电子显微镜核心对SEM和TEM成像的帮助。这项工作得到了NIH MIRA资助（R35 GM128618）（ASD），哈佛大学的Blavatnik生物医学加速器资助（ASD），HMS的转化研究进展与种子四边形基金（Q-FASTR）的支持（ ASD），美国心脏协会博士后研究金（SNC）和HMS生物化学与分子药理学研究金（SNC）。

竞争我nterests

ASD是Takeda Pharmaceuticals和HP Hood的顾问。

参考

1. Allaire，JM，Crowley，SM，Law，HT，Chang，SY，Ko，HJ和Vallance，文学士（2018）。肠上皮：粘膜免疫的中央协调员。趋势免疫学39（9）：677-696。

2. SE，Blutt，SE，Crawford，SE，Ramani，S.，Zou，WY和Estes，MK（2018）。工程人类胃肠道文化，以研究微生物组和传染病。Cell Mol Gastroenterol Hepatol 5（3）：241-251。

3.曹浩，陈振兴，王克宁，宁明敏，邹卓安，冯勇，叶烨林，冷勇和沉建华（2016）。配备季铵盐的肠靶向TGR5激动剂具有改善的降血糖作用和降低的胆囊填充作用。科学代表6：28676。

4. Chaudhari，SN，Harris，DA，Aliakbarian，H.，Luo，JN，Henke，MT，Subramaniam，R.，Vernon，AH，Tavakkoli，A.，Sheu，EG和Devlin，AS（202 1 ）。减肥手术显示出肠道受限的TGR5激动剂具有抗糖尿病作用。Nat Chem Biol 17 ：20-29。

5. Cristina，ML，Lehy，T.，Zeitoun，P.和Dufougeray，F.（1978）。正常人大肠内分泌细胞的精细结构分类和比较分布。胃肠病学75（1）：20-28。

6. Duboc，H.，Tache，Y.和Hofmann，AF（2014）。胆汁酸TGR5膜受体：从基础研究到临床应用。Dig Liver Dis 46（4）：302-312。

7. R. Eissele，R. Goke，R. Willemer，Harthus，HP，Vermeer，H.，Arnold，R.和Goke，B.（1992）。大鼠，猪和人的胃肠道和胰腺中的胰高血糖素样肽-1细胞。Eur J临床投资22（4）：283-291。

8. Gagnon，J.和Brubaker，PL（2015）。NCI-H716细胞。在：食品生物活性成分对健康的影响：体外和离体模型。Verhoeckx，K.，Cotter，P.，Lopez-Exposito，I。等。（编辑）。湛（CH）：221-228。

9. Gonzalez，LM，Williamson，I.，Piedrahita，JA，Blikslager，AT和Magness，ST（2013）。猪模型中的细胞谱系鉴定和干细胞培养，用于研究肠上皮再生。PLoS One 8（6）：e66465。

10. Harach，T.，Pols，TW，Nomura，M.，Maida，A.，Watanabe，M.，Auwerx，J.和Schoonjans，K.（2012）。TGR5增强了对阴离子交换树脂的GLP-1分泌。科学代表2：430。

11.霍奇，RJ和努涅斯，DJ（2016）。武田G蛋白受体5（TGR5）激动剂的治疗潜力。希望还是炒作？糖尿病肥胖代谢18（5）：439-443。

12. Kim，KS，Lee，IS，Kim，KH，Park，J.，Kim，Y.，Choi，JH，Choi，JS and Jang，HJ（2017）。肠道嗅觉受体的激活刺激了肠内分泌细胞中胰高血糖素样肽1的分泌，并减轻了2型糖尿病小鼠的高血糖症。科学代表7（1）：13978。

13. Lea，T.（2015）。Caco-2细胞系。在：食品生物活性成分对健康的影响：体外和离体模型。Verhoeckx，K.，Cotter，P.，Lopez-Exposito，I。等。（编辑）。湛（CH）：103-111。

14. H. Sato，A。Macchiarulo，C。Thomas，Gioiello，A。Une，M.，Hofmann，AF，Salatin，R。Schoonjans，K.，Pellicciari，R。和Auwerx，J.。（2008）。作为TGR5激动剂的新型有效和选择性胆汁酸衍生物：生物筛选，结构-活性关系和分子建模研究。医学化学杂志51（6）：1831-1841。

15.姚·L·西顿，南卡罗来纳州西顿，南达塞·费特·南卡罗来纳州，阿迪卡里，AA，北迪本尼迪托，米纳，人工智能，银行，AS，布赖·L和德斯林（AS）（2018年）。选择性肠道细菌胆汁盐水解酶可改变宿主的新陈代谢。网上生活7：e37182 。