材料和试剂
厚1的圆形盖玻片（ThermoScientific TM ，目录号：CB00120RA120MNT0）
6孔细胞培养板（Corning ® ，Costar公司® ，目录号：CLS3516-1EA）
Superfrost TM显微镜载玻片（ThermoScientific TM ，目录号：AA00008332E00MNT10）
聚乙烯亚胺，线性，MW 25 ，000，转染级（PEI 25K TM ;自Polysciences，目录号：23966-1）。
60-70％融合的HeLa细胞
1 × Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），无钙，无镁（Life Technologies，Gibco，目录号：14190144 ）。储存温度：4 ℃。
pIRESneo3-Str-KDEL-MMP2-SBP-EGFP载体（图2）。储存温度：-20 °C
重要说明：此质粒是通过用Addgene质粒编号65264（Str-KDEL_ST-SBP-EGFP）中的MMP2（我们的目标蛋白）替换ST（ST6GAL1）序列而产生的。

图2 。在本协议中以pIRESneo2-Str-KDEL-MMP2-SBP-eGFP构建体为载体的图谱。该质粒描述了结合KDEL的链霉亲和素和报道分子MMP2-SBP-eGFP。质粒中的IRES元件可在单个质粒中同时表达Str-KDEL和MMP2-SBP-eGFP。有关构建体的更多详细信息，请参见Boncompain等。（2012年）。地图与SnapGene产生® 。

的Opti-MEM ®减少血清培养基（Life Technologies公司，GIBCO，目录号：31985070）。储存温度：4 °C
500 mM d生物素（Merck，SUPELCO，目录号：47868）。储存温度：4 °C
1 × PBS中的4％多聚甲醛（PFA）。使用甲醛溶液制备，ROTIPURAN ® 37％，PA，ACS（罗斯，目录号：4979.1）
一抗
对于感兴趣的蛋白质
根据分析，可以使用特定的细胞器标记。例如，钙结合蛋白可以用作ER标记，而根据分析评估，可以使用不同的Golgi标记（例如，顺式-Golgi为GM-130 ，反式-Golgi网络为TGN-46 ）
二抗
我们的研究使用针对不同物种的Alexa-Fluor抗体488、594和633 （Life Technologies，ThermoScientific，目录号根据物种和波长而变化）进行。储存温度：4 °C 。

ProLong金抗褪色试剂（Life Technologies，Invitrogen，目录号：P36934）
PEI溶液的浓度为1 mg / ml （请参阅食谱）
Dulbecco的改良Eagles培养基（DMEM）完全培养基（请参阅食谱）
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM补充剂，丙酮酸（Life Technologies，Gibco TM ，目录号：31966021）
胎牛血清（FBS，Life Technologies，Gibco TM ，目录号：10270106）
青霉素/链霉素（P / S，Life Technologies，Gibco TM ，目录号：15140122）
增透溶液（请参见配方）
海卫一X-100（卡尔·罗斯，目录号3051.2）
十二烷基硫酸钠（SDS）10％溶液
阻止解决方案（请参阅食谱）
牛血清白蛋白（BSA）冻干粉（PAN B iotech，目录号：P06-1391050）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）粉末（Sigma，目录号：P3813-1PAK）：根据制造商的说明制备1 ×溶液

设备

镊子
层流罩
细胞培养箱设置在37 °C ，5 ％CO 2
水浴温度设定为37 °C
蔡司激光扫描LSM780共焦显微镜（卡尔·蔡司）
蔡司100×（NA 1.46，油）物镜（卡尔·蔡司）
488-nm激光线

软件

Zeiss Zen软件2010（Zeiss，https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html）
ImageJ v.1.37（美国国立卫生研究院[ NIH ] ，https: //imagej.nih.gov/ij/ ）
用于“ RUSH-Vesicle-Analysis”的ImageJ宏（https://github.com/MehrshadPakdel/RUSH-Vesicle-Analysis）

程序

细胞培养和质粒转染
所有涉及细胞培养的步骤都必须在层流罩中进行。
在每孔含2 ml的DMEM完全培养基的6孔板中接种3 × 10 4 HeLa细胞，其中含有2-3个小盖玻片。制备每个时间点1个阱（见Ñ OTE 1）。
将细胞在37 °C ，5％CO 2下孵育24小时。
孵育24小时后，建立PEI转染反应。每口井：
200 µl OptiMEM
2 µg RUSH构建体，例如pIRESneo3-SS-Str-KDEL-MMP2-SBP-EGFP
15 µl 50mM PEI解决方案
涡旋转染反应，并在室温下孵育20分钟。
滴加到细胞中，并在37 °C ，5％CO 2下孵育至少16小时。避免孵育时间超过24小时。如果有必要，请在24小时后更换细胞培养基。

RUSH实验
温育后，制备2-米升DMEM完全与d -生物素，以每孔40μM的终浓度。根据W的数量准备足够的体积厄尔来分析（例如，对于4个孔（2米升每孔培养基），制备9米升DMEM的完全+ 7 。2μ升d -生物素500毫米）。将其保持在37 °C的温度下。
用微量移液器或真空泵从细胞中去除培养基，并用1 × DPBS洗涤一次。
添加2米升DMEM完全没有生物素，除了最新一期各时间点（见ñ OTE 2）。例如，对于MMP2，分析了四个时间点（0、15、30和45分钟）。仅向标记为0、15和30分钟的孔中添加培养基。
添加2米升DMEM完全+生物素（来自小号TEP B1）到最新的时间点（MMP2，到孔标记为45分钟。图3中，“开始实验的”）。
在37 °C ，5％CO 2下孵育细胞。
孵育时间取决于每种构建体的运输动力学，为了便于进行实验处理，我们建议首先开始将生物素添加到需要孵育时间最长的孔中（对于MMP2，孵育时间为45分钟），然后继续使用的时间点（30和15分钟，参见方案˚F igure 3）。

重要的是：ħ建议ERE采取细胞从培养箱中在至少2分钟的在下一时间点（触发货物贩卖MMP2之前，将板在加入生物素到先前井，即后13分钟取出的保育箱的出，在开始下一个时间点之前2分钟。有关详细说明，请参见注释2）。

图3 。方案描述了RUSH实验的时间间隔内的处理时间。该方案描述了使用MMP2构造的有经验的人的处理时间，所述时间点为0、15、30和45分钟。

从下一个要分析的时间点取出培养基，并添加2 m l DMEM complete +生物素。
重复小号TEPS B2，B4和B5，直到完成所述专职周期（MMP2，45分钟，最后的生物素添加在15分钟固定之前，˚F igure 3）。

盖玻片蒙太奇
孵育即将结束之前，用1 × PBS洗涤细胞（所有孔）2次
在弱光条件下，将细胞在PBS中的4％PFA中孵育10分钟。确保盖玻片完全被PFA解决方案覆盖。
用1 × PBS清洗3至5次。
如果不进行共染色：向孔中加入少量PBS，以利于盖玻片的处理，并使用ProLong antifade Gold试剂将其安装。以此目的：
拿一张显微镜载玻片。
将一滴ProLong防褪色金试剂放在幻灯片上。
小心地用镊子盖好一张盖玻片。
将盖玻片面朝下放在ProLong防褪色金试剂的顶部（即，盖玻片上带有细胞的一侧必须与防褪色剂接触）。
小心地将它们存放在黑暗的地方，直到成像。建议让蒙太奇的幻灯片干燥至少24小时，理想情况下干燥48小时。
如果进行联合染色：
在弱光条件下，用通透溶液使细胞通透5分钟。
用1 × PBS清洗3至5次。
与封闭溶液在室温下孵育1小时，或在弱光条件下于4 °C孵育过夜。
通过在封闭溶液中稀释抗体来新鲜制备一抗溶液。取决于抗体，此信息可能由制造商推荐或需要实验室中的先前表征以确定理想的时间和温度。
用1 × PBS清洗3至5次。
与一抗在室温下孵育1小时，或在弱光条件下于4 °C孵育过夜。
通过稀释制造商推荐的封闭溶液中的抗体量来新鲜制备第二抗体溶液。
用1 × PBS清洗3至5次。
与二抗在室温下于弱光条件下孵育1小时。
用1 × PBS清洗3至5次。
安装使用的ProLong抗淬灭金试剂的载玻片（参见小号TEP C4）。

影像学
启动显微镜并预热所需的激光。根据激光和显微镜的不同，此过程最多可能需要30分钟。
设置Z堆栈获取实验。我们使用每个切片0.35 µm的距离，通常使用10到15个平面来覆盖大部分细胞体积。
聚焦单个细胞（或每个视野几个清晰定义且健康的单个细胞），并使用来自RUSH通道的信号设置要成像的堆叠数量。
如有必要，请调整其他通道的增益和强度。
开始成像。
重复小号TEPS D3和D4直至完成每个时间点至少15个细胞。
将文件另存为* .lsm 。

数据分析

打开斐济。
在斐济打开用于“ RUSH-Vesicle-Analysis”的定制ImageJ宏，网址为https://github.com/MehrshadPakdel/RUSH-Vesicle-Analysis。有关此宏中使用的ImageJ函数的更多详细信息，请参见注释7。
打开斐济的显微镜（* .lsm）文件。也可以使用其他显微镜文件，例如* .lif。
单击运行运行宏以启动分析（图4）。

图4 。斐济RUSH-囊泡分析宏窗口的屏幕截图

选择要分析的细胞数量（图5）。

图5 。小号从高峰分析宏步骤1的creenshot

选择要分析的感兴趣区域（ROI）：通过在每个单元周围绘制多边形来标识每个单元（图6）。所选区域将自动保存为ROI。单击确定以选择下一个单元格。

图6 。RUSH-analysis宏的第2步的屏幕截图

生成二进制图像和阈值调整：选择最后一个单元并单击ok之后，您将看到2个窗口自动出现在屏幕上（图7，之前）：一个显示二进制生成的图像（左窗口，标题：MAX_Bin_Image），另一个显示一个显示原始最大投影（右窗口，标题：MAX_Image）。另外，将出现两个控制窗口：一个名为“ Threshold”的阈值，用于手动调整MAX_Bin_Image的黑白平衡，另一个名为“需要采取的措施”。为了避免在计数过程中丢失低强度囊泡，与原始图像相比，您需要在视觉上调整生成的二进制图像的阈值（图7）。为此，请在“阈值”窗口中滑动这些条，直到MAX_Bin_Image类似于MAX_Image（后图7）。一旦两个图像相同，请在阈值窗口中单击“应用”。重要的是，一旦单击“应用”，就无法撤消阈值修改。单击“应用”后，在“需要执行的操作”窗口上单击“确定”以确认所做的更改，并继续执行宏（后图7）。

图7 。RUSH-analysis宏中第3步的屏幕截图。图“之前”显示生成的二进制图像（MAX_Bin_Image，左窗口），原始最大投影（MAX_Image），阈值控制窗口和“需要操作”窗口。为了避免丢失低强度囊泡，您必须手动调整以荧光最大投影为参考的MAX_Bin_Image的黑白平衡。正确的调整在名为“ After”的图中显示。

分析颗粒：在“需要采取的措施”窗口上单击“确定”后，宏将开始自动计算每个选定ROI上囊泡的数量。因此，将出现3个新窗口：一个带有图形的窗口（蓝色正方形，图8，此处命名为Cell1_Example_eGFP_45min_Quanti.tif），一个日志窗口，指示每个单元格计数的囊泡数量（洋红色正方形，图8），以及ROI管理器该窗口显示了为单元格选择的ROI（绿色正方形，图8）。可以将这些数字复制到E xcel文件或类似的电子表格文件中以进行进一步分析。

图8 。定量分析最后一步的屏幕截图。在步骤编号中单击“确定”后，将自动出现三个窗口。7：绘制每个细胞计数的囊泡（为每个分析的细胞生成，蓝色正方形），描述每个细胞计数的囊泡数目的日志窗口（洋红色正方形）和包含所选ROI信息的ROI窗口（选定的单元格，绿色正方形）。日志窗口值可以复制到excel文件或统计分析软件中以进行进一步评估。

宏运行完毕后，所有结果将自动保存在原始文件目录中的新结果文件夹中（图9）。保存的文件是原始文件（Orig_filename），原始图像的最大投影（MAX_filename），生成的二进制图像（Binary_filename），一个图形文件，其中显示了每个选定单元格的计数囊泡数（CellNumber_filename）和日志文件包含每个细胞计数的囊泡总数（log_filename）。

图9 。运行宏后生成的文件的屏幕截图

可以进一步比较囊泡的数量以进行统计测试，例如t-检验，ANOVA或它们相应的非参数测试，以评估时间点和治疗之间的差异。图10显示了HeLa细胞中MMP2eGFP阳性囊泡的囊泡定量示例。

图10 。MMP2 RUSH囊泡分析的最终结果。小图（A）描绘了在不同时间点表达RUSH MMP2eGFP构建体的HeLa细胞的免疫荧光图像。刻度条小号：10微米。图（B）显示了来自至少25个分析细胞的MMP2阳性小泡的累积数量。使用Kruskall-Wallis检验评估时间点之间的差异。* *** P值<0.0001。

当使用分泌途径标记物时，可以使用其他统计测试来评估共定位，例如Pearson或Manders系数。有关此类分析的更详细说明，请参阅Pacheco-Fernandez等。（2020年）。图11显示了MMP2与高尔基标记TGN 46共定位的示例，通过共聚焦显微镜观察。

图11 。用MMP2-RUSH转染并与TGN46共染色的HeLa细胞的免疫荧光图像。将细胞固定在指定的时间点，进行透化，并与GFP和抗TGN46抗体（TGN-46为反式-高尔基体标记）一起孵育。绿色：MMP2-SBP-eGFP，洋红色：反-高尔基体网络。比例尺：10 µm。

笔记

时间点是根据所评估的货物定义的。如果您使用的是未表征的货物，则应执行先前对已知货物及其描述的时间点的实验，并将其用作阳性对照。根据我们的经验，我们在实验室中评估的可溶性分泌货物（例如溶菌酶C和组织蛋白酶D）在60到75分钟的时间内通过分泌途径运输。未知的货物必须先LY在不同的时间间隔评估，以确定其贩卖的动力学。例如，当我们首次评估MMP2的运输动态时，我们评估了5分钟的间隔以确定运输的关键点（从ER到高尔基体，从高尔基体到细胞外空间）。但是，评估的时间点将始终取决于所需的分析类型。
这个协议是指最新孵育时间为在实验中进行评估（最后时间点即，在本协议45分钟）和更早的温育时间为这样的时间点（下文任何时候即，0，15和30分钟）。
请记住，对于经验丰富的人员，将板从培养箱中取出，除去培养基并添加含生物素的培养基至少需要2分钟。首次建议在两个时间点之间使用5分钟的工作时间窗口。因此，在下一个时间点开始前2或5分钟（根据操作经验）将板从培养箱中取出。例如，使用此处描述的MMP2构建体，将DMEM +生物素添加到45分钟的时间点后，孵育13分钟后将板从培养箱中取出，以便您有足够的时间将板放置在通风橱中，取出培养基从30分钟的孔中移出，替换为新的DMEM +生物素，然后在开始45分钟的孵育后恰好15分钟，将板放回到37 °C的孵育器中（图3）。
蛋白质运输是一个对温度敏感的过程。因此，建议调整实验条件，以免在37 °C下细胞孵育时间少于5分钟。
共聚焦显微镜的设置也可以在35毫米培养皿中进行。我们建议至少计数15个单元格，以进行有效的统计分析。
对照对于验证该测定是必需的。在这种情况下，没有一个蛋白货物匆忙构建体（即，含有海峡，保持钩，SBP和所述荧光团待分析）可被用作用于任何构建体的验证的控制。重要的是，该对照适合评估测定的功效，但对于进一步的动力学动力学比较，建议使用编码具有良好描述的运输动力学的蛋白质货物的构建体作为对照。
此处用于分析的宏使用7个功能（按以下顺序）：
背景减除：Ü是基于在一个滚球算法SES ImageJ的减背景功能（https://imagej.net/Rolling_Ball_Background_Subtraction）。此算法将像素大小调整为图像中不属于背景的最大对象的半径。对于本分析，此半径已调整为高尔基体大小。
增强对比度：牛逼他的功能方便的小囊泡颗粒的知名度。它通过拉伸图像直方图而不改变像素值（https://imagej.net/docs/guide/146-29.html#sub:Enhance-Contrast）来增强对比度。
ž项目：ģ enerates与2D图像扁平的z堆系列的最大强度（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-28.html#sub:Z-Project ... ）。
图像处理滤波器“中值”：Ť他滤波器减少了在选择的噪声。在此宏中，用于使囊泡变平滑并在阈值化后生成更少的噪点对象（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-29.html#sub:Median ...）。
阈值：小号egments灰度图像（在此分析二值图像）进入的兴趣和背景的特征。选择阈值会生成一个二进制图像，该图像定义了哪些对象不应该算作背景，并且是后续粒子定量所必需的（https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-28.html#sub:Threshold ... [T ] ）。
：分析颗粒d给定的像素大小（内etects并量化颗粒https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html#toc-Subsection-30.2）。

菜谱

PEI解决方案
溶解50毫克聚乙烯亚胺在40米升的蒸馏水
用电磁搅拌器在稍微加热的板上将溶液充分混合
调节pH至7.4
完整体积可达50米升。分装成500 µl，并储存在-20 °C
DMEM完全培养基
通过添加FCS和P / S分别至终浓度分别为10％和1％来制备500 ml的DMEM培养基

增透溶液
混入1 × PBS：0.2％Triton X-100和0.5％十二烷基硫酸钠（SDS;用20％或10％SDS溶液稀释）。
使5米升等分并存储长期在-20 ℃下。解冻后，储存在4 °C并在室温下预热以进行工作。如果形成沉淀，则在37 °C短暂加热直至溶液变澄清。
阻塞解决方案
将20 g牛血清白蛋白（BSA，分子生物学级）溶解在500 ml的1 × PBS中。等分试样在50米升和存储长期在-20 ℃下。解冻后，储存在4 °C并在室温下工作时保持在冰上。

致谢

该协议先前已在出版物（Deng等人，2018）和（Pacheco-Fernandez等人，2020）中记录过。这项工作得到了Deutscher Akademischer Austauschdienst（DAAD），Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG），美国国立卫生研究院（NIH），透视计划（Boehringer Ingelheim Fonds）和马克斯·普朗克生物化学研究所的资助。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

参考

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