材料和试剂
锥形管
Combitips先进1.0毫升仪（Eppendorf，Ç atalog编号：0030089430）
芝士布
培养皿（100毫米 × 15毫米）（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
封口膜（PM-996）
Nunc公司平方标准高度生物测定皿（赛默飞世尔科技TM ，Ç atalog号：240835）
重型纸巾（Uline，目录号：S-13631BLU）
撒布机（Universal Medical ，目录号：HS86655）
P. infestans分离株，US-23
无菌水
70％乙醇
马铃薯基因型，获自美国马铃薯基因库（威斯康星州斯特金湾）
肥料（彼得斯的专业20-10-20泥炭精简版）
不断增长的媒体
对于致病疫霉黑麦A培养基（Caten和Jinks ，1968年）（60克黑麦谷物，15克琼脂和20克蔗糖与1升蒸馏水的混合情况，请参见参考资料）
用于植物土壤混合物（通用混合物BM1，Berger）

设备

Eppendorf Repeater E3（Eppendorf，目录号：4987000398）
生物安全柜
光学显微镜
扫描仪（Epson ，型号：Perfection V700 Photo）
解剖刀
血细胞计数器
灯
4 °C的冷藏室或冰箱
孵化器（Fisher Scientific，目录号：97-990E）
10 × 10厘米的花盆
15 × 15厘米的花盆

小号的吨洁具

图像

程序

植物的生长条件和叶片的收集
在10 × 10厘米盆中的无土盆栽混合物（BM1，Berger）中，将温室中的马铃薯种子或块茎，插条或组织培养苗发芽。
两周后将幼苗移植到15 × 15厘米的盆中。
在温室中，白天应保持22 °C （17.5小时的光照周期）的温度，而在夜晚（黑暗）则保持20°C的温度。
为了保持植物的健康，应定期灌溉，但要避免过多的水分，每周施肥一次，并在必要时喷洒杀虫剂和叶面疾病。但是，接种前一周应避免喷洒杀菌剂。

致病疫霉的生长条件
生长致病疫霉分离物US-23上一个黑麦的介质板（图1）18 ℃下。该板可在接下来的3个月用作进一步的继代培养的母板。

图1. 12天后黑麦A板中的疫霉菌生长

从黑麦A培养基上切下3株美国疫病菌隔离株US-23的3个塞子（5毫米）。
将这三个插头以三角形方式放置在新的Rye A介质板上（图1）。
用石蜡膜正确密封板，并在黑暗中于18°C孵育。
保持板朝下，以免插头上产生水分。

接种制剂
通过用5 ml冰冷的灭菌水（以加速游动孢子的释放）注入10到14天的黑麦A培养板（图1）来收获孢子囊。
保持板在4°C 2至4小时以释放游动孢子。
通过用两层粗棉布过滤每块板中的液体（去除菌丝体）并在20 ml冰冷的无菌水中稀释来收集游动孢子。
使用血细胞计数器在显微镜下计数运动的游动孢子，并将浓度调整为每毫升水中50,000个游动孢子。通常，我们用10-14天的黑麦培养板制成的50 ml游动孢子制成100 ml最终溶液（游动孢子和水）。

感染测定
如果可以的话，从5-8周龄的植物中收集至少有三张小叶的健康，成熟的复合叶子。注意不要收集旧的（开始显示出泛黄的迹象）或非常幼小的叶子（未完全发育）。
设置一个内衬湿Uline重型纸巾的生物测定板（图2）。

图2.在衬有湿纸巾的生物测定板上进行的晚疫病感染测定。取下顶盖拍照。

滴剂用Eppendorf重复器接种10μl接种物（每毫升50,000个游动孢子）的10μl液滴（每片小册子4至6滴）接种每个小叶的背面。
将生物测定板放置在温度为21°C的自然光室内。

症状监测
接种后3天可以观察到最初的症状，如黑色/棕色病变，孢子形成和病原体接种点的水浸区域。
随后，在高度敏感的基因型5天后，症状会扩大并覆盖整个叶片。
接种后5天，使用1-9量表（Karki等人，2020）（图3）或使用ImageJ软件（Rueden等人，2017）对叶片外观进行症状评估。

图3.用于评估晚疫病感染的1-9量表。使用ImageJ计算覆盖有黑色/棕色病斑，孢子形成和浸水的平均叶面积，并根据该面积指定一个值。1 =≥90％，2 = 81-90％，3 = 71-80％，4 = 61-70％，5 = 41-60％，6 = 21-40％，7 = 10-20％在接种时，8 =≤10％，在接种时死亡，9 = 0％，无明显症状，干净。

Q病变区域的uantification
使用平板扫描仪或照相机获取树叶的数字图像（图像类型：24位彩色，分辨率：300 dpi）。
启动ImageJ并打开图像（文件>打开…）。
选择“直线”工具。
在已知大小的物体（例如硬币或直尺）上画一条线。
转到“分析>设置比例，然后输入首选的长度单位（例如，厘米，毫米或英寸）和距步骤4的已知线距。单击确定。
使用“画笔工具”突出显示叶子的患病区域。双击画笔图标以设置画笔选项，包括画笔宽度。应注意仅选择患病区域，而不选择其他伤害。
转到“图像>类型> 8位”。
转到“图像>调整>阈值（以获取红色叶子图像）” 。
选中深色背景复选框，然后将两个条向右滑动（255个值）。所选感染区域应为红色，叶子照片的其余部分应为灰度。
关闭阈值设置窗口。
使用“徒手选择”工具并跟踪整个叶子区域的轮廓。
转到“分析>设置度量”，然后仅选择“面积”和“面积分数”复选框，取消选择任何其他复选框，然后单击“确定”。
转到“分析>测量”或按Ctrl + M来测量患病的叶子面积。将会弹出一个单独的“结果窗口”，显示整个面积和％面积，分别代表步骤5中定义的正方形单位的轮廓叶子的表面积和叶子的受感染面积百分比。
关闭“结果窗口”时，您可以选择保存结果。

致谢

该协议描述了由Karki等人先前发表的实验中使用的晚疫病感染检测的详细信息。（2020年）。该工作得到了美国农业部NIFA / NSF植物生物相互作用计划的资助，编号为：2018-67014-28488。

参考

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