材料和试剂
蛋白质纯化

Poly-Prep色谱柱（Bio-Rad，目录号：7311550）
Zeba TM旋转脱盐柱40k MWCO 10 ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：87772）
BL21（DE3）感受态大肠杆菌（NEB，目录号：C2527I）
Rosetta TM （DE3）感受态大肠杆菌（Millipore Sigma，目录号：70954）
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，Millipore Sigma，目录号：I6758-10G）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，Lonza，目录号：17-516F）
咪唑（Millipore Sigma，目录号：I5513）
鸡蛋白的溶菌酶（Millipore Sigma，目录号：62971-10G-F）
Triton TM X-100（Millipore Sigma，目录号：T8787-250ml）
Triton TM X-114（Millipore Sigma，目录号：93422-250ml）
苯甲基磺酰氟（PMSF，Millipore Sigma，目录号：P7626-5G）
cOmplete TM Mini，无EDTA（罗氏，目录号：11836170001）
牛血清白蛋白（BSA，Millipore Sigma，目录号：A3608）
HisPur TM钴树脂（Thermo Fisher Scientific，目录号：89964）
1,4-二硫苏糖醇（DTT，Millipore Sigma，目录号：10197777001）
钠P hosphate一元（Millipore公司Sigma，目录号：S3139）
磷酸氢二钠（Millipore Sigma，目录号：S3264）
氯化钠（Millipore Sigma，目录号：S9888）
HEPES （Millipore Sigma，目录号：H3375）
甘油（Millipore Sigma，目录号：G5516）
蛋白乙inding乙uffer（见食谱）
蛋白质è lution乙uffer（见食谱）
蛋白质小号torage乙uffer（见食谱）

细胞和细胞培养基

HEK293T和RAW264.7细胞获自美国典型培养物保藏中心（ATCC）
DC2.4细胞获自美国马萨诸塞州大学医学院岩石实验室
RAW-Blue ISG细胞获自Invivogen
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Corning，目录号：10-041-CV）
罗斯威尔公园纪念学院（RPMI）介质（Corning，目录号：10-013-CV）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25200-056）
胎牛血清（FBS，Gibco，目录号：10437-028）
青霉素-链霉素溶液，100x（Corning，目录号：30-002-CI）

干扰素荧光素酶测定

96孔透明底部白色板（Millipore Sigma，目录号：CLS3610）
pGL4.45 [luc2p / ISRE / Hygro]载体（Promega）
萤火虫荧光素酶检测试剂盒（生物素，目录号：30075-2）
的TransIT-X2 ®转染试剂（Mirus公司，目录号：MIR 6004）

RNA提取，逆转录和qPCR

LightCycler TM 480多孔板96透明，带密封箔（Roche，目录号：05102413001）
RNeasy TM微型试剂盒（Qiagen，目录号：74004）
β-巯基乙醇（βME，Millipore Sigma，目录号：M6250-10ML）
逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：4374966）
SYBR TM Green PCR预混液（Thermo Fisher Scientific，目录号：4309155）
用于检测的qPCR引物：mIFN-β-F：5'-GCCTTTGCCATCCAAGAGATGC-3'，mIFN-β-R：5'-ACACTGTCTGCTGGTGTGGAGTTC-3'，mActin-F：5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG-3'和mActin-R ：5'-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3'（从IDT订购为定制的寡核苷酸DNA）
mCXCL10酶联免疫吸附测定

Greiner Bio-One MICROLON TM 600高结合96孔ELISA分析微孔板（Fisher Scientific，目录号：07-000-627）
小鼠CXCL10 ELISA试剂盒（R＆D，目录号：DY466）
TMB底物组（BioLegend，目录号：421101）
TWEEN 20（Millipore Sigma，目录号：P9416-100ml）

SEAP-IFN测定

QUANTI-Blue TM解决方案（Invivogen，目录代码：rep-qbs）

设备

Misonix超声波仪3000
ř EAL-时间PCR体系（Roche公司，型号：的LightCycler 480）
Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher，型号：ND-1000 ）
牛逼有源冰箱，循环仪（Bio-Rad公司，型号：T100）
P晚读者（Tecan公司，型号：M200无限）

软洁具

GraphPad棱镜

程序

STING ΔTM蛋白纯化
的DNA sequenc ES（来源：Tmem173 NM_028261小鼠标记ORF克隆，Origene公司目录号：MR227544，STING TMEM173 NM_198282人力标记ORF克隆，Origene公司目录号：RC208418）O ˚F STING ΔTM蛋白（138至378个氨基酸的小鼠斯汀，139合成了379个氨基酸（用于人类STING的氨基酸）作为gBlock DNA片段（Integrated DNA Technologies），并克隆到了pSH200表达载体（通过Nco I和Not I限制酶线性化）的N端带有一个六组氨酸标签（图1）。PL asmids为STING ΔTM突变体如S365A然后通过位点特异性诱变产生。DE3大肠杆菌（E. coli）用于表达蛋白质（BL21 DE3中的小鼠STINGΔTM，Rosetta DE3中的人STINGΔTM）。含有抗生素氨苄西林（100 mg / L）的溶菌汤（LB）用于细菌培养，摇床条件是37°C 220 rpm进行生长和18°C 220 rpm进行诱导。

图1. （A）pSH200_His6_TEV_human STING （139-379aa）和（B）pSH200_His6_TEV_mouse STING （138-378aa）的质粒图

第一天：细菌培养

从甘油储备液中提取DE3大肠杆菌，并在50 ml LB和氨苄西林中于37°C过夜培养。

第2天：入职

将50 ml过夜培养物转移到装有1 L LB和氨苄青霉素的烧瓶中，并在37°C下培养2 h，直到培养物的OD 600达到0.4。该OD值对于在Rose tta DE3中表达人STINGΔTM至关重要，因为我们发现较高的浓度会损害蛋白质的纯度。对于小鼠STINGΔTM在BL21 DE3中的表达，OD600可以在0.4-0.8的范围内，而不会影响产量和纯度。
在冰上冷却1 L培养物，加入0.5 ml 1 M IPTG，然后在18°C摇动大约20 h。

第三天：蛋白质纯化

诱导后，离心细菌以6,000 × g培养20分钟。
收集沉淀并用30 ml PBS洗涤一次，然后在含有20 mg溶菌酶，200μlTriton X-100、1 mM PMSF （每30分钟补充一次，直至与钴结合）的20 ml蛋白结合缓冲液（配方1 ）中裂解，并溶解一片ø ˚F完全蛋白酶抑制剂混合物片剂在室温下以20rpm 20分钟，轻轻旋转。裂解细胞后，应在整个纯化过程中将蛋白质保持冰冷状态，以最大程度地减少降解（使用冷蛋白质结合缓冲液，蛋白质洗脱缓冲液和蛋白质储存缓冲液）。
在冰水上冷却细胞裂解物，并在18 W下与Misonix超声波仪3000进行超声处理（间隔3秒打开和5秒关闭以防止蛋白质热失活），总共5分钟。
超声处理后，在4°C下以14,000 × g离心细胞裂解液30分钟。
用5 ml蛋白质结合缓冲液洗涤0.5 ml HisPur钴树脂，然后将离心分离的细菌上清液与20μlTriton X-114（以消除内毒素）一起加入钴-HisTag结合液（4°C，持续1 h）。以20 rpm缓慢旋转）。
结合后，小心吸出上清液，并用含5μlTriton X-114的5 ml蛋白结合缓冲液洗涤钴树脂两次（每次4°C，每次20分钟，以20 rpm缓慢旋转）。
将洗涤过的钴树脂转移到含有5 ml蛋白结合缓冲液的Poly-Prep色谱柱中。在重力作用下将所有蛋白质结合缓冲液排干后，添加1.5 ml蛋白质洗脱缓冲液（配方2 ）并收集洗脱液。
用Zeba TM旋转脱盐柱（40k MWCO 10 ml）对蛋白质洗脱液进行脱盐。在色谱柱中添加10 ml的蛋白质存储缓冲液（配方3 ），并使其在重力作用下完全排干（直到在树脂表面上方没有液体残留）。滴加1.5 ml蛋白质洗脱液到树脂中间，使其完全流干。最后，用蛋白质存储缓冲液收集5个1 ml的馏分（添加1 ml的存储缓冲液，然后将流通液收集为“ Fraction 1”，然后再添加1 ml的存储缓冲液并收集“ Fraction 2” ...一直到“分数5”）。结合小数部分s 3和d 4（包含大部分脱盐蛋白）进行SDS-PAGE表征和BCA定量蛋白质浓度。馏分1、2可能包含极少量的蛋白质，馏分5可能包含具有咪唑的蛋白质。每个级分的浓度也可以通过BCA分析进行定量。
为了储存，加入1 mM DTT，将蛋白质溶液等分，然后储存在-80°C。在这种储存条件下，蛋白质功能可以维持数年，但会因多次冻融循环而受损。

用于体外STING激活的细胞系
人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞缺乏cGAMP合酶（cGAS）和STING蛋白，但在下游STING信号传导中表达其他必需蛋白，包括TANK结合激酶1（TBK1 ）和干扰素调节因子3（IRF3）。因此，它为研究cGAMP-STINGΔTM的功能而与内源性cGAMP或STING蛋白没有相互作用提供了一个很好的模型（图2）。广告ditionally，它可被转染以过表达全长突变STING蛋白（例如HAQ STING）。为了检测STING的激活，我们通过整合一个IFN刺激的响应元件（ISRE）来产生干扰素（IFN）报告细胞系，该元件通过稳定转染潮霉素中选择的pGL4.45 [luc2p / ISRE / Hygro]质粒来驱动荧光素酶表达。 200微克/毫升）。HEK293T细胞不能直接摄取cGAMP-STINGΔTM复合物，因此需要商业转染试剂（我们主要使用TransIT-X2，尽管其他类似Lipofectamine也起作用）才能将cGAMP-STINGΔTM复合物递送到细胞中。HEK293T细胞在含10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。

小鼠巨噬细胞RAW264.7和树突状细胞DC2.4均表达cGAS和STING以及TBK1和IRF3（图2）。它们还能够在不借助转染试剂的情况下内化cGAMP-STINGΔTM复合物。为了检测STING激活，我们可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量培养基中细胞分泌的CXCL10浓度，或者通过qPCR定量测定干扰素-βmRNA的水平。上述介质不包含任何单元格-包含单元格的介质简称为“单元格”。在此外，从RAW264.7衍生的报告细胞系：RAW-蓝TM ISG细胞可用于研究STING激活的动力学在体外，并且由于分泌的胚胎碱性磷酸酶（SEAP）- IFN测定只需要20微升的媒体，可以在治疗后的多个时间点执行。RAW264.7细胞在含10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。对于SEAP-IFN分析，将RAW-Blue TM ISG细胞在DMEM中用10％热灭活（56°C，30分钟）FBS和1％青霉素/链霉素进行培养。DC2.4细胞在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的罗斯威尔公园纪念学院（RPMI）培养基中培养。

所有细胞均在37°C，5％CO 2的培养箱中培养，以低传代次数使用，并测试支原体污染呈阴性。

图2.来自HEK293T，RAW264.7和DC2.4细胞的cGAS，STING，TBK1和IRF3蛋白内源性表达的免疫印迹

用HEK293T-luc2p / ISRE / Hygro进行的IFN-萤光素酶测定
第一天：准备细胞

将HEK293T-luc2p / ISRE / Hygro细胞以每孔100μl培养基中3 × 10 5细胞/ ml的密度接种到96孔板（用于荧光素酶测定的透明底部平白板）中。

第二天：细胞治疗

对于每个孔，将1μgSTINGΔTM蛋白与0.025μgcGAMP混合，然后在OptiMEM培养基中加入1μlTransIT-X2至20μl的总体积，并在室温下孵育15分钟。
将混合物添加到细胞培养基中，而无需上下吹打。每种治疗至少应重复3次。
孵育处理的细胞24小时。

第三天：发光测量

ř从培养箱中，吸介质EMOVE板，并添加25μl的裂解缓冲液（5倍与FR DI水稀释奥姆所提供的5 ×萤火虫荧光素酶裂解缓冲液）到每个孔中，然后在室温下孵育15分钟，伴随轨道摇动。
向每个孔中添加50μl萤光素酶测定缓冲液（新鲜添加D-萤光素，终浓度为0.2 mg / ml），在Tecan微孔板读数器上读数板进行生物发光。

含RAW264.7和DC2.4的mCXCL10 ELISA
第一天：准备细胞

将RAW264.7或DC2.4细胞以2 × 10 5细胞/ ml的密度接种到96孔板中，每孔100μl培养基中。

第二天：细胞治疗

对于每个孔，在20μlOptiMEM培养基中混合1μgSTINGΔTM蛋白与0.025μgcGAMP和1μlT ransIT-X2 ，然后在室温下孵育15分钟。或者，对于免费车辆处理，混合5微克的STINGΔTM蛋白0.125在20μlOptiMEM培养基微克cGAMP在室温下孵育15分钟。
将混合物添加到细胞培养基中，而无需上下吹打。每种治疗至少应重复3次。
孵育处理的细胞48小时。

第三天：制备ELISA板

ELISA根据制造商的协议进行：小鼠CXCL10 ELISA试剂盒（R＆D，DY466）

将PBS中的CXCL-10捕获抗体稀释至2μg/ ml 。
将100μl捕获抗体溶液添加到ELISA分析板的每个孔中。在4°C下孵育过夜。

第四天：ELISA

吸出ELISA分析板的每个孔，用洗涤缓冲液（含0.05％Tween 20的PBS）洗涤3次。
向每个孔中加入300μl试剂稀释剂（含1％BSA的PBS）封闭板。在室温下以220 rpm的频率振荡孵育1 h。
吸板并用洗涤缓冲液洗涤3次。
处理后48小时，不稀释地添加100μlRAW264.7或DC2.4细胞培养基。在220 rpm的轨道摇动下，在室温下孵育2小时。
吸板并用洗涤缓冲液洗涤3次。
向每个孔中加入100μl100 ng / ml的检测抗体（在试剂稀释剂中稀释）。在220 rpm的轨道摇动下，在室温下孵育2小时。
吸板并用洗涤缓冲液洗涤3次。
向每个孔中加入100μl用试剂稀释液稀释40倍的链霉亲和素-HRP储备液。在室温下孵育20分钟，避开光照，并以220 rpm的速度进行轨道摇动。
吸板并用洗涤缓冲液洗涤3次。
添加100μlTMB底物溶液，该溶液是通过将等体积的TMB底物A与TMB底物B混合而新鲜制备的。在室温下孵育20分钟，在220 rpm的轨道振动下避光。
向每个孔中添加50μl终止溶液（2 N H 2 SO 4 ）。轻轻拍打板进行混合。用分光光度计/酶标仪测量450 nm处的吸光度。

使用RAW264.7和DC2.4的qPCR定量检测mIFN-β的表达
第一天：准备细胞

将RAW264.7或DC2.4细胞以3 × 10 5细胞/ ml的密度接种到24孔板中，每孔400μl培养基。

第二天：细胞治疗

对于每个孔，在50μlOptiMEM培养基中混合5μgSTINGΔTM蛋白与0.125μgcGAMP和5μlT ransIT-X2 。在室温下孵育15分钟。或者，对于免费车辆处理，混合25微克的STINGΔTM蛋白0.625在50μlOptiMEM培养基微克cGAMP在室温下孵育15分钟。
将混合物添加到细胞培养基中，而无需上下吹打。
孵育处理的细胞24小时。

第3天：RNA提取，逆转录和qPCR

按照RNeasy Micro Kit提供的协议进行RNA提取：

通过将10μlβ-巯基乙醇添加到1 ml RLT缓冲液中来制备新鲜的裂解缓冲液。
吸出培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后每孔添加350μl裂解缓冲液。在室温下孵育5分钟。
将细胞裂解液转移到Eppendorf管中，涡旋振荡20 s，然后加入350μl70％乙醇，上下吸管，转移至试剂盒中提供的旋转柱中，并在8,000 × g下离心15 s 。
丢弃流通液，添加350μlRW1缓冲液，并以8,000 × g离心15 s 。
在玻璃瓶中从冻干形式提供的DNase制备DNase缓冲液。使用注射器将500μl水注入玻璃瓶中以溶解粉末。然后打开小瓶，并向柱中添加10μlDNase溶液+ 70μlRDD缓冲液。在室温下孵育15分钟。然后将350μlRW1缓冲液添加到离心柱中，以8,000 × g离心15 s，并丢弃收集管。
将离心柱置于随附的新的2 ml收集管中。加入500μlRPE缓冲液，以8,000 × g离心15 s ，并丢弃流经的溶液。
向旋转柱中加入500μl80％乙醇，以8,000 × g离心2分钟，并丢弃收集管。
将离心柱放入提供的另一个新的2 ml收集桶e中。以8,000 × g离心5分钟，弃去收集管。
将离心管放入随附的新的1.5 ml收集管中，向离心柱中心添加14μl无RNase的水，并以8,000 × g离心1分钟以洗脱RNA。
用Nanodrop分光光度计测量每个细胞样品的RNA浓度。

反转录

用水将1μg提取的RNA稀释至总体积为10μl。
对于每个RNA样品，在PCR管中准备以下混合物：
稀释的RNA 10μl
10 × RT缓冲液2μl
dNTP 0.8微升
随机引物2μl
RNase抑制剂1μl
酶1微升
水3.2微升
总体积20μl

使用以下程序用热循环仪处理样品：
25°C 10分钟
37°C 2小时
85°C 5分钟
4°C无限保持

定量PCR

将qPCR引物稀释至10μM工作浓度。
将80μl水加至上一步骤的20μl逆转录产物中（此5倍稀释液在下一步骤中称为“模板”）
对于每个反应，在qPCR 96孔板上添加以下物质（先添加引物，然后添加预混液）：
模板 1微升
2 x SYBR混合物 10μl
正向引物 0.5μl
反向引物 0.5μl
水8微升
总体积20μl

RAW-Blue ISG细胞的IFN-SEAP测定
第一天：准备细胞

将RAW264.7或DC2.4细胞以2 × 10 5细胞/ ml的密度接种到96孔板中，每孔100μl培养基。

第二天：细胞治疗

处理前2小时，移出培养基，并用100μlDMEM补充培养基，其中含有10％热灭活的FBS和1％青霉素/链霉素预热至37°C，以降低随后的QUANTI-Blue测定的噪音水平。
对于每个孔，混合在20 1微克STINGΔTM蛋白质与0.025微克cGAMP然后将1μl的TransIT-X2的微升OptiMEM中我dium ，在室温下温育15分钟。或者，对于免费车辆处理，混合5微克的STINGΔTM蛋白0.125在20μlOptiMEM培养基微克cGAMP在室温下孵育15分钟。
将混合物添加到细胞培养基中，而无需上下吹打。每种治疗至少应重复3次。
将处理过的细胞在37°C的培养箱中培养。

d AY小号3 -4：IFN-SEAP测定法

从处理过的细胞孔中取出20μl培养基，并在单独的96孔板中与180μlQUANTI-Blue分析缓冲液混合。（可以在12到48小时之间使用多个时间点来研究动力学。）
将板在37°C下孵育6至10 h，直到观察到可见的色差（图3）。
通过使用分光光度计/酶标仪在635 nm处测量吸光度来确定IFN-SEAP活性。

图3.经处理的RAW-Blue ISG细胞与QUANTI-Blue分析缓冲液混合培养基的IFN-SEAP分析示例，显示由于STING信号转导引起的颜色差异

数据一nalysis

数据可以用GraphPad棱镜进行分析和统计分析与（ANOVA）单因子变异数分析进行其次是学生的牛逼-检验统计学意义。

[R ecipes

蛋白乙inding乙uffer
50 mM磷酸钠

0.5 M氯化钠

10毫米咪唑

pH值7.4

蛋白质è lution乙uffer
50 mM磷酸钠

0.5 M氯化钠

150 mM咪唑

pH值7.4

蛋白质小号torage乙uffer
20毫米HEPES

150毫米氯化钠

10％甘油

pH值7.4

致谢

这项工作得到了美国国防部国会指导医学研究计划（CDMRP）的卵巢癌研究计划，麻省理工学院David H. Koch综合癌症研究所，士兵纳米技术研究所癌症中心支持补助金（CCSG）试点奖的支持。麻省理工学院（ISN），大理石纳米癌症医学中心，东北大学学院启动资金以及国防部国会指导性医学研究计划（W81XWH18PRMRPDA）的同行评审医学研究计划。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

参考文献

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