材料和试剂

笔记：
除非另有说明，否则所有材料和试剂均应保持在室温下。对于试剂的保存期限和存储温度，我们直接参考制造商的说明。
其他公司的等效材料和试剂也可能适用。

1.移液器技巧
P10技巧（Sarstedt，目录号：70.1130.20）

P200技巧（萨尔特，目录号：70.760.102）

P1000提示（VWR，目录号：613-0738）

2.过滤移液器吸头
P10过滤嘴（润滑脂，目录号：771288）

P200过滤嘴（润滑脂，目录号：739288）

P1000过滤嘴（润滑脂，目录号：740288）

3. Eppendorf管（Greiner，目录号：616201）
4. Falcon管（格雷纳，catalo克数小号：188271 [ 15毫升] ，227261 [ 50毫升] ）
5.丁腈手套（VWR，目录号：112-2371）
6.杜兰玻璃瓶（VWR，目录号小号：215-15 16 [ 500毫升] ，215-1517 [ 1 ，000毫升] ）
7.培养瓶（DWK生命科学，目录号：217715407）
8.注射器驱动的过滤器单元（Merck，Millex ，目录号：SLGS033SB）
9.培养皿（60毫米）（ThermoFisher ，目录号：123-17）
10.瓶顶真空过滤系统（VWR，孔径为0.2 µm的完整过滤单元，目录号：514-0334）
11.酸洗玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G8772）
12.试管苏打玻璃（VWR，目录号：212-0013）
13.膜过滤器，0.45微米孔径（Millipore公司，目录号：HAWP02500）
14.酿酒酵母菌株W303-1B / Gal4-∆Pep4（leu2-3，his3-11,15，trp1-1 :: TRP1-GAL10-GAL4，ura3-1，ade2-1，canr ，cir +，∆Pep4 MATα）
注意：S火车可应要求由相应的作者提供。

15.质粒DNA
w ^ e，利用一个pYeDP60矢量（与2- μ米圆复制起点，URA3和ADE2选择性标记，和半乳糖诱导型启动子）含有人ATP13A2变体2的酵母密码子优化的cDNA版本随后是凝血酶切割位点和C -末端BAD标签（Jidenko等，2006； Azouaoui等，2014）（图2）。在我们的实验中，我们使用催化失活的ATP13A2变体，即E343A突变体（van Veen等，2020）作为阴性转运对照。E343位于去磷酸化的催化位点，在P型ATP酶（人ATP13A2同工型2中的341个TGES基序）中高度保守。

注：P lasmids请直接从相应的作者。

图2. ATP13A2表达质粒图的示意图。ATP13A2的表达质粒是修饰的pYeDP60质粒。所述pYeDP60载体含有2- μ米环复制起源，URA3和ADE2选择性标记，半乳糖诱导型GAL10 / CYC1启动子，多克隆位点，和PGK1终止子。将人ATP13A2基因克隆到具有凝血酶可裂解的BAD（生物素受体结构域）标签的质粒中（Jidenko等，2006 ；Azouaoui等，2014）。

16.粒状酵母提取物（默克，目录号：1.03753.0500）
17.来自酪蛋白的蛋白ept （Tr yptone ）（Merck，目录号：1.07213.2500）
18. D-（+）-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
19. Cuvettes（VWR，目录号：634-0676）
20. Tris基座（Sigma-Aldrich，Trizma基座，目录号：T1503）
21.乙二胺四乙酸（EDTA）（BDH实验室耗材，目录号：280214S）
22.盐酸（盐酸）发烟37％（Merck公司，目录号：1.00317.2501）
23. HCl 0.5 N（Reagecon ，目录号：H20501）
24.二水醋酸锂（LiAc ）（Sigma-Aldrich，目录号：L6883）
25.乙酸（西格玛奥德里奇，目录号：27225）
26.鲱鱼精子的DNA（Sigma-Aldrich，目录号：D7290）
27.聚乙二醇（PEG）（Sigma-Aldrich，目录号：P4338）
28.二甲基亚砜（DMSO）（西格玛奥德里奇，目录号：276855）
29.细菌用琼脂（BD，目录号：214010）
30.不含尿嘧啶的酵母脱菌剂（Sigma-Aldrich，目录号：Y1501）
31.不含氨基酸的酵母氮碱基（西格玛奥德里奇，目录号：Y0626）
32.绝对乙醇（VWR，目录号：20821.296）
33. D-（+）-半乳糖（Sigma-Aldrich，目录号：G0625）
34. KCl （西格玛奥德里奇，目录号：P9541）
35.山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
36. NaOH （Merck，目录号：649.1000）
37. P henylmethylsulfonyl氟（PMSF）（Sigma-Aldrich公司，目录号：93482）
38.蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，SIGMAFAST蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂，目录号：S8830）
39. HEPES （西格玛奥德里奇，目录号：H3375）
40.蔗糖（西格玛奥德里奇，目录号：S7903）
41. CaCl 2 （西格玛奥德里奇，目录号：C3881）
42.正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM）（Inalco ，目录号：1758-1350）
43. Bradford试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
44. E gg磷脂酰胆碱（Avanti极性脂质，L-α-磷脂酰胆碱[鸡蛋，鸡肉] ，目录号：840051C）
45. 18：1磷脂酸（Avanti极性脂质，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯（钠盐），目录号：840875C）
46. Bio-Beads SM-2吸附剂（BioRad ，目录号：1523920）
47. ATP二钠盐（Roche Diagnostics，目录号：10127531001）
48. MgCl 2六水合物（西格玛奥德里奇，目录号：M2670）
49.磷酸肌酸二钠盐水合物（西格玛奥德里奇，目录号：P7936）
50.肌酸磷酸激酶（Sigma-Aldrich，目录号：C3755）
51.抗ATP13A2抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A3361）
52.抗兔IgG，HRP相连的抗体（Bioké ，目录号：7074S）
53. γ-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）（VWR，目录号：A1076.1000）
54. KOH（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
55.二硫苏糖醇（DTT）（VWR，目录号：A2948.0025）
56. SPM（Sigma-Aldrich，目录号：85590）
57. [ 3 H] -SPM，1 mCi / ml，20 µM （美国放射性标记化学公司；目录号：ART0471）
58.液体闪烁鸡尾酒（MP生物医学，Ecolite （+）TM液体闪烁液，目录号：882475）
59.三氯甲烷库存（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
60. 20％葡萄糖（请参阅食谱1）
61. YPD琼脂平板（请参见配方2）
62. YPD介质（请参见配方3）
63. 10x TE股票（请参阅第4条）
64. 10x LiAc库存（请参阅第5条）
65. 1x TE / LiAc解决方案（请参阅第6条）
66.单链鲱鱼精子DNA（请参见食谱7 ）
67. 50％PEG w / v（请参阅第8章）
68. PEG溶液（请参见配方9）
69. SD-尿嘧啶琼脂平板（参见第10条）
70. SD尿嘧啶培养基（请参见第11条）
71. YPGE2x介质（请参见配方12）
72. 20％半乳糖（请参阅食谱13）
73. TEKS缓冲区（请参见配方14）
74.缓冲区中的TES （请参见第15条）
75. HS缓冲区（请参见配方16）
76.缓冲区T（请参见第17条）
77.缓冲区T / DDM（请参见配方18）
78.缓冲液T /脂质混合物（请参见配方19）
79. 0.1 M ATP（请参阅第20条）
80. 0.1 M MgCl 2 （参见配方21）
81. 0.2 M磷酸肌酸（见配方22）
82. ATP再生系统（请参见第23条）
83. 500 mM DTT（请参见配方24）
84. 4x反应缓冲液（请参见配方25）
85. 1x反应缓冲液（请参见配方26）
86. 0.1 M MOPS（pH 7 .0 ）（请参见配方27）
87. 10 mM SPM（请参见配方28）
88. 100 µl [ 3 H] -SPM /未标记的SPM混合物（请参见第29条）

设备

移液器
P2移液器（Gilson，目录号：FA10001M）

P10移液器（Gilson，目录号：FA10002M）

P100移液器（Gilson，目录号：FA10004M）

P200移液器（Gilson，目录号：FA10005M）

P1000移液器（Gilson，目录号：FA10006M）

血清学吸移管（Sigma公司，BRAND ® ACCU -jet ®亲吸管控制器，目录号：Z637637）
血清移液器
5毫升（Sarstedt ，目录号：86.1253.001）

10毫升（Sarstedt ，目录号：86.1254.001）

25毫升（Sarstedt ，目录号：86.1685.001）

用于Ti45转子的超速离心管（Beckman Coulter，目录号：355655）
用于Ti70转子的超速离心管（Beckman Coulter，目录号：355630）
玻璃布氏过滤漏斗（Millipore公司，目录号：XX1014700）
磁力搅拌器（He idolph Instruments，MR Hei -Standard，目录号：505-20000-00）
带有摇床的冷藏培养箱（New Brunswick Scientific，型号：Innova 4230）
冰桶（例如，保丽龙箱）
高压灭菌器（LTE Scientific Ltd，100系列高压灭菌器）
M illiQ （M Q）水系统（Sartorius，Arium Pro）
分光光度计（贝克曼库尔特，型号：DU-640B）
带转子的离心机（Eppendorf，型号：5804 R ）（Eppendorf，型号：A-4-44）
微量仪（Eppendorf，离心机5417 R）与转子（的Eppendorf，型号：F45-30-11）
涡流（VWR，型号：涡流-精灵® 2，目录号：444-5900）
Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer C omfort）
水浴（Memmert ）
均质器（BioSpec产品，BeadBeater ，目录号：1107900EUR ）
压力真空泵（Gelman Sciences，Gelman Little Giant，型号：13156）
汉密尔顿注射器（1毫升）（VWR，1001 LTN，货号：613-1300）
氮气排污系统（内部制造）
超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima XPN-90）
超速离心机转子（贝克曼库尔特公司，型号：45 Ti ）
超速离心机转子（贝克曼库尔特，型号：90 Ti ）
头顶旋转器（Labinco BV，L28 Test-Tube Rotator，货号：28000）
真空过滤歧管（Millipore，目录号：XX2702550）
液体闪烁分析仪（Perkin Elmer，TRI-CARB 2900TR）

程序

酵母转化
我们转化牛逼他酵母ST雨W303-1B / GAL4-ΔPep4（leu2-3，his3-11,15，trp1-1 :: TRP1-GAL10-GAL4，ura3-1，ade2-1，canr ，CIR +， ΔPep4MATα），其中含有hATP13A2 WT或催化死亡的E343A突变体的pYeDP60载体，根据乙酸锂/单链载体DNA /聚乙二醇方法进行了较小的改动（Gietz和Woods，2002）。

压板从甘油原液对酵母一个YPD琼脂平板培养48小时，在30℃。
从新鲜培养板上接种20 ml YPD培养基，并在30°C，230 rpm的振荡培养箱中孵育过夜。
在600 nm（OD 600 ）下测量过夜培养物的OD 。
注意：1 OD 600大约等于10 7细胞/ ml。

在10 ml YPD中将培养物稀释至0.1 OD 600 ，并在30°C，230 rpm的振荡培养箱中孵育4-6小时，直到培养物的OD 600在0.4至0.8之间。
在摆动的水桶（700 xg ； 5分钟）中，将相当于2 OD 600 （=±2 x 10 7个细胞）的细胞量降低。
用1 ml无菌M Q洗涤沉淀，并用移液器吸头重悬。转移到Eppendorf管中。
使用微量离心机旋转细胞（2,500 xg ； 2分钟）。
将沉淀重悬于1 ml 1x TE / LiAc中。
使用微量离心机旋转细胞（2,500 xg ； 2分钟）。
将沉淀重悬于100 µl 1x TE / LiAc中。
加入10微升单链鲱鱼精子DNA。
加入1-5 µg质粒DNA。
涡流。
加入600 µl PEG溶液。
涡流。
在30°C下孵育45分钟（体积=约730 µl）。
加入DMSO至终浓度为10％（约73 µl）。
在42°C下热震15分钟。
在冰上冷却1-2分钟。
使用微量离心机旋转细胞（2,500 xg ； 2分钟）。
将沉淀重悬于200 µl YPD中，并在30°C下孵育2小时。
使用微量离心机旋转细胞（2,500 xg ； 2分钟）。
将细胞沉淀重悬于无菌M Q中，然后平板接种至SD-尿嘧啶琼脂平板上。
在30℃至recove孵育48小时将板- [R转化体。

酵母菌
在这里，我们遵循了之前描述的类似策略（Jidenko等人，2006；Azouaoui等人，2014），但做了一些小的修改。

从新鲜培养皿中接种20 ml SD-尿嘧啶培养基（步骤A24），以进一步选择携带带有URA3选择标记的质粒的酵母细胞，并在振荡培养箱中于28°C和200 rpm孵育24 h。
测量培养物的OD 600 。
将100 ml SD-尿嘧啶培养基接种至最终OD 600为0.2，并在振荡培养箱中于28°C和200 rpm孵育12 h。
测量培养物的OD 600 。
将3.6 L的YPGE2X培养基接种至最终OD 600为0.05，并在振荡培养箱中于28°C和175 rpm孵育36 h。
注意：九1 ，装有400 ml酵母培养物000毫升培养瓶中。

用2％半乳糖（每500 ml培养物中加入50 ml 20％半乳糖溶液50 ml）诱导ATP13A2-BAD表达，并在振荡培养箱中于18°C和175 rpm孵育12 h。
注意：Ť他温度降档从28℃至18℃下会降低蛋白质合成速率，因此，有利于适当的蛋白折叠，增加正确折叠和功能的过量表达的蛋白质的产率。另外，较低的温度将减少蛋白质降解。

重复半乳糖诱导，以确保高水平的ATP13A2-BAD过表达，并在振荡培养箱中于18°C和175 rpm孵育另外12 h。
旋转酵母细胞（1,000 xg ； 10分钟； 4°C）。
称量沉淀。
注意：产量通常为20-30 g / L酵母培养物。细胞沉淀可以直接处理或在-20°C下保存最多2周。

酵母膜制备
如果将酵母细胞沉淀物冷冻，则在冰上解冻。
将细胞沉淀重悬于TEKS缓冲液中（体积（ml）=步骤2中确定的细胞沉淀重量（g）的2倍），并在4°C下孵育15分钟，同时与磁力搅拌器混合。
旋转细胞（1,000 xg ； 10分钟； 4°C）。
将沉淀重悬于TES缓冲液中（体积（ml）=大约1倍于细胞沉淀的重量（g），如S b步B9中所确定）。
使用BeadBeater破坏酵母细胞。
用200 ml酵母悬浮液填充室（如果不够，则在缓冲液中添加TES ）并添加200 ml冷玻璃珠。分庭应尽可能满。
将碎冰和水装满冰水套。
在冷室中搅拌5分钟。每隔一分钟暂停3分钟，以减少样品和BeadBeater的加热。
使用布氏漏斗和真空泵回收粗提物。
使用pH纸测试裂解物的pH，必要时用饱和NaOH溶液将粗提液的pH调节至7.5 。
将粗提取物以2,000 xg离心20分钟（4°C）。
使用45 Ti型超速离心转子（4°C）将得到的上清液以20,000 xg离心20分钟。
使用45 Ti型超速离心转子（4°C）以200,000 xg离心所得上清液1 h 。
将所得沉淀物（即，轻膜级分P3）重悬于HS缓冲液中。
注意：重悬液的体积应由肉眼确定，应为均匀溶解沉淀物所需的最小量。

使用经典的Bradford测定法（以已知的BSA浓度作为蛋白质标准品）确定P3馏分的蛋白质浓度。
注意：测得的蛋白质浓度通常在35-50 mg / ml之间。为了进行下游重组，每个实验要求的最低总产量为70 mg。

分装每2 ml P3膜，并在液体N 2中冷冻。
储存在-80°C。
注意：膜可以在-80°C下保存最多6个月。

酵母膜的重构
Ť ø重新构建酵母膜，我们遵循类似的策略如前描述（帕帕多普洛斯等人，2007）有一些修改。

在缓冲液T / DDM中将2 ml P3膜（在冰上融化）稀释至10 µg / µl。
注意：总蛋白质量应至少为70毫克。

在头顶旋转器中于4°C孵育45分钟。
使用90 Ti型超速离心转子（4°C）以200,000 xg离心30分钟，使不溶性部分沉淀。
补充2毫升上清液，即，德TERGENT提取物，用等体积的缓冲液的T /脂质混合和条件“内部ATP”，也ATP再生系统的等体积的（表1）：

表1.重组样品的准备

健康）状况

“没有ATP”

“ ATP内部”

洗涤剂提取物

2毫升

2米升

缓冲液T /脂质混合

2毫升

2毫升

ATP再生系统

--

2毫升

在室温下，将样品与100 mg / ml Bio-Beads在头顶旋转器中孵育3小时，以去除DDM并重组蛋白脂质体。
加入200 mg / ml Bio-Beads，在头顶旋转器中于4°C孵育过夜。
使用90 Ti型超速离心转子（4°C）以200,000 xg离心1 h 。
通过将沉淀重悬于2 ml缓冲液T中来回收囊泡。
注意：测得的蛋白质浓度通常在1-5 mg / ml之间。

使用经典的Bradford测定法确定蛋白质浓度。
通过蛋白质印迹检查重构的蛋白质水平（图3）。

图3.酵母膜和重组囊泡的免疫印迹。含有ATP13A2-BAD的P3膜被去污剂DDM溶解。去污剂提取物补充有脂质磷脂酰胆碱和磷脂酸，然后用Bio-Beads处理以去除DDM并重组蛋白脂质体（“无ATP”）。为了产生包含腔内ATP（“ ATP内部”）的蛋白脂质体，我们在与Bio-Beads一起孵育之前添加了ATP和ATP再生系统。使用一抗ATP13A2一抗（1 / 1,000）和缀合HRP的二抗（1 / 2,000）通过Western印迹分析检查重构的ATP13A2-BAD蛋白水平。每个泳道上样12 µl样品。

多胺转运分析
注意：多胺运输测定应由授权人员在指定的放射性区域内进行，并且必须采取放射性物质处理预防措施。应始终佩戴手套，实验室护目镜，实验室外套和用于监测个人暴露的剂量计。该工作应在有机玻璃滤网后面进行，并且只能使用带有过滤器的移液器吸头。放射性物质的存储以及固体和液体放射性废物的处置均应遵守机构的规定。
注意：在60分钟内测量[ 3 H] -SPM对新鲜制备的囊泡的吸收。

在缓冲液T中将新鲜制备的囊泡（“无ATP”或“ ATP内部”）稀释至1 µg / µl。
注意：我们通常使用1毫升的囊泡。至少需要300 µg（“ ATP内在”囊泡）– 600 µg（“无ATP”内囊泡）才能进行下一步。

将四个0.45 µm Millipore过滤器放在过滤歧管上（图4）。
注意：过滤器在M Q中是预湿的。使用镊子固定住它们。

用4 ml 1x反应缓冲液洗涤每个过滤器。
在不同条件下（在duplo中）将以下物质移入反应管中（表2）：

表2.用于运输测定的样品制备

健康）状况

“没有ATP”

“ ATP不在一边”

“ ATP在身边”

4x反应缓冲液

250微升

250微升

250微升

“无ATP”囊泡

150微升

150微升

--

“ ATP内在”囊泡

--

--

150微升

ATP再生系统

--

--

200微升

质量Q

500微升

500微升

300微升

轻轻涡旋以彻底混合（避免形成气泡）。
将反应管置于37°C水浴中5分钟。
加入100 µl [ 3 H] -SPM /未标记的SPM混合物（最终总SPM浓度：1 mM ）开始反应。
在选定的时间点（0分钟，10分钟）取出300微升（45微克囊泡），然后将每个等分试样吸移到不同的过滤器上，以除去液相。
清洗每个滤波器用4ml 1X REA ction缓冲器。
将过滤器放入装有7毫升闪烁液的闪烁瓶中。
对其余的反应管重复步骤。
用液体闪烁计数器测量样品。

图4.用于多胺转运测定的实验装置。过滤歧管（1）连接到带有用于放射性废物（3）的收集器的真空泵（2 ）。水浴（4）。

数据分析

所述的多胺转运测定法测量了孵育10分钟后[ 3 H] -SPM在含有由内而外ATP13A2和管腔内ATP（“ ATP内在”状态）的重构小泡中的积累。在不同的控制条件下并行进行实验。脂蛋白体与过表达的ATP13A2仅包含腔外ATP（“ATP外”状态），或在所有（“无ATP”条件）不具有ATP作为阴性对照，因为这些小泡不占用[ 3 H] -SPM由于缺乏ATP结合在由内而外重构的ATP13A2蛋白的腔核苷酸结合域上（图1）。此外，包含过表达的无催化活性的ATP13A2变体（E343A）的重构囊泡作为阴性转运对照。通过闪烁计数定量[ 3 H] -SPM摄取，并将每种情况的值归一化为0分钟。对于每个摄取时间，进行重复测定。代表性图如图5所示。

图5.多胺转运分析。相对于催化死亡的突变体E343A（阴性对照），在ATP13A2 WT过表达的酵母膜来源的囊泡中摄取[ 3 H] -SPM 。条件“无ATP”代表没有ATP的重组囊泡，而条件“外部ATP”和“内部ATP”分别代表包含脂质外或腔内ATP和ATP再生系统的蛋白脂质体（van Veen等人，2020）。

笔记

可以将此处描述的协议扩展为执行以下类型的测量：
1.时间依赖性应该是线性的，它可以在不同时间点在0的范围内进行验证- 30分钟。吸收率可以从斜率计算。
2.通过测试一系列总SPM浓度（感冒和[ 3 H] -SPM在一起标记的浓度）在0的生理范围内，可以生成剂量/反应曲线。0 1 µM - 10 mM。浓度依赖性允许确定对SPM的表观亲和力（K m ）和转运蛋白的最大周转率（V max ）。动力学参数是通过Hill方程通过非线性回归分析计算得出的，如Holemans等人所述。（2014年）。

菜谱

20％葡萄糖
将500 ml M Q放入带搅拌棒的大烧杯中
加200克葡萄糖
搅拌几分钟
最终化体积为1 ，000毫升与中号Q
过滤消毒溶液
YPD琼脂平板
注：P酸酯应储存在4℃下在黑暗中。

将3 g酵母提取物，6 g蛋白p和6 g琼脂放在Duran玻璃瓶中
添加M Q至270毫升
在121 °C高压灭菌至少30分钟
加入30毫升20％葡萄糖
倒入培养皿
YPD培养基
将10克酵母提取物和20克蛋白ept放入杜兰玻璃瓶中
添加M Q至900毫升
高压釜 121 °C至少30分钟
加入100毫升20％葡萄糖
10x TE储备液（0.1 M Tris - HCl ，pH 7.5，0.01 M EDTA）
0.606克Tris

0.146克EDTA

添加M Q至50毫升

用HCl调节pH值至7.5

过滤消毒溶液

10x LiAc库存（1 M LiAc ，pH 7.5）
5.101克醋酸锂

添加M Q至50毫升

用稀乙酸调节pH至7.5

过滤消毒溶液

1x TE / LiAc解决方案
将120 µl 10x TE储备液，120 µl 10x LiAc储备液和900 µl无菌M Q混合在一起

单链鲱鱼精子DNA
DNA在水浴中煮沸20分钟，然后立即在冰上冷却

50％聚乙二醇w / v
称出25 g PEG
加入无菌的M Q至50毫升
过滤消毒溶液
PEG溶液（40％PEG，1x TE，1x LiAc ）
将800 µl 50％PEG，100 µl 10x TE储备液和100 µl 10x LiAc储备液混合在一起

SD-尿嘧啶琼脂平板
注：P酸酯应储存在4℃下在黑暗中。

将5克琼脂，0.475克不含尿嘧啶的酵母菌落混合物和1.675克不含氨基酸的酵母氮碱基放入杜兰玻璃瓶中
添加M Q至200毫升
在121 °C高压灭菌至少30分钟
加50毫升20％葡萄糖
倒入培养皿
SD尿嘧啶培养基
注：中号edium应避光保存。

将0.95 g不含尿嘧啶的酵母菌落混合物和3.35 g不含氨基酸的酵母氮碱基放入Duran玻璃瓶中
添加M Q至450毫升
在121 °C高压灭菌至少30分钟
加50毫升20％葡萄糖
YPGE 2x中
将20克酵母提取物和20克蛋白ept放入杜兰玻璃瓶中
添加M Q至725毫升
在121 °C高压灭菌至少30分钟
加50毫升20％葡萄糖
加入27毫升乙醇
20％半乳糖
将500 ml M Q放入带搅拌棒的大烧杯中
加入200克半乳糖
混合时加热，使其溶解
最终化体积为1 ，000毫升与中号Q
过滤消毒溶液
TEKS缓冲液（50 mM Tris-HCl ，pH 7.5、1 mM EDTA，0.1 M KCl，0.6 M山梨糖醇）
注意：乙uffer应保存在4℃。

6.057克Tris

0.292克EDTA

7.456克KCl

109.302 g s轨道醇

添加M Q至1000毫升

用HCl调节pH值至7.5

TES在缓冲液中（50 mM Tris-HCl ，pH 7.5、1 mM EDTA，0.6 M山梨糖醇，1 mM PMSF，蛋白酶抑制剂混合物）
注意：乙uffer应保存在4℃。

6.057克Tris

0.292克EDTA

109.302克山梨糖醇

添加中号Q上为1 ，000毫升

用HCl调节pH值至7.5

在实验当天添加Sigma Fast蛋白酶抑制剂混合物。对于50毫升缓冲液，加1片

PMSF是在使用前添加的。对于50 ml的缓冲液，添加500 µl 100 mM PMSF

HS缓冲液（20 mM HEPES - Tris ，pH 7.4，0.3 M蔗糖，0.1 mM CaCl 2 ）
注意：乙uffer应保存在4℃。

0.477克HEPES

10.269克蔗糖

0.0015克CaCl 2

添加M Q至100毫升

用Tris将pH调节至7.4

缓冲液T（10 mM Tris-HCl ，pH 7.4和1 mM EDTA）
注意：乙uffer应保存在4℃。

0.121克Tris

0.029克EDTA

添加M Q至100毫升

用HCl调节pH值至7.4

缓冲液T / DDM（缓冲液T补充有1.4％DDM w / v）
20 ml缓冲液T

280毫克DDM

缓冲液T /脂质混合物（缓冲液T含有0.7％DDM w / v，4.5 mM卵磷脂酰胆碱和0.5 mM 18：1磷脂酸（PA）
将173 mg卵磷脂酰胆碱（6.92 ml的25 mg / ml氯仿原液）加入玻璃管中，并在氮气流下干燥以制成脂质膜
将18 mg 18：1 PA（1.8 ml的10 mg / ml氯仿原液）添加到脂质膜中并在氮气流下干燥
在补充了0.35 g DDM的50 ml缓冲液T中溶解脂膜
ATP 0.1 M
ATP 0.551克

添加M Q至10毫升

分装并储存在-20 °C

0.1 M氯化镁2
0.203克氯化镁2

添加M Q至10毫升

0.2 M磷酸肌酸
1克磷酸肌酸

添加M Q至19.6 ml

分装并储存在-20 °C

ATP再生系统
200微升0.1 M ATP

200微升0.1 M MgCl 2

200 µl 0.2 M磷酸肌酸

200 µl肌酸磷酸激酶（1 U / µl）

1.2毫升M Q

500毫米DTT
0.771克DTT

添加M Q至10毫升

分装并储存在-20°C

4x反应缓冲液（200 mM MOPS，400 mM KCl ，44 mM MgCl 2和4 mM DTT）
注意：乙uffer应保存在4℃。

4.184克MOPS

2.982克氯化钾

0.894克MgCl 2

添加M Q至100毫升

用KOH调节pH到7.0

在使用前添加DTT。对于5 ml缓冲液，添加40 µl 500 mM储备液

1x反应缓冲液（50 mM MOPS，100 mM KCl ，11 mM MgCl 2和1 mM DTT）
100 ml 4x反应缓冲液

300毫升M Q

0.1 M MOPS（pH 7 .0 ）
2.093克MOPS

添加M Q至100毫升

用KOH调节pH到7.0

10 mM SPM
0.020克SPM

加入0.1 M MOPS（pH 7 .0 ）至10 ml

分装并储存在-80 °C的氮气下。解冻后的等分试样将不再使用

[ 3 H] -SPM /未标记SPM混合物（10 µCi，0.2 µM [ 3 H] -SPM，10 mM SPM，总SPM浓度：9.9 mM ）
10 µl [ 3 H] -SPM

990微升10 mM SPM

致谢

所描述的协议最初是在van Veen等人的方法中发布的。，2020年。这项工作由Fonds Wetenschappelijk Onderzoek （FWO，法兰德斯研究基金会）（G094219N，SBO Neuro-TRAFFIC S006617N和1503117N），KU鲁汶大学（LysoCaN C16 / 15/073 ）和伊丽莎白女王医学科学基金会资助。，Valine de Spoelberch奖。SVV 。是一位有抱负的FWO研究员（11Y7518N）。我们感谢奥尔胡斯大学的J. Lyons博士在生成ATP13A2 BAD标签融合构建体方面的帮助。

利益争夺

作者声明没有任何金融或非金融竞争利益。

参考文献

Axelsen，KB和Palmgren，MG（1998）。P型ATPase超家族中底物特异性的演变。分子进化杂志46（1）：84-101。
Azouaoui，H.，Montigny，C.，Ash，MR，Fijalkowski，F.，Jacquot，A.，Gronberg，C.，Lopez-Marques，RL，Palmgren，MG，Garrigos，M.，le Maire，M.， Decottignies，P.，Gourdon，P.，Nissen，P.，Champeil，P.和Lenoir，G.（2014年）。一种高产量的共表达系统，用于纯化完整的Drs2p-Cdc50p脂质翻转酶复合物，该复合物严重依赖于磷脂酰肌醇4-磷酸酯并由其稳定。PLoS One 9（11）：e112176。
Di Fonzo，A.，Chien，HF，Socal，M.，Giraudo，S.，Tassorelli，C.，Iliceto，G.，Fabbrini，G.，Marconi，R.，Fincati，E.，Abbruzzese，G.， Marini，P.，Squitieri，F.，Horstink，MW，Montagna，P.，Libera，AD，Stocchi，F.，Goldwurm，S.，Ferreira，JJ，Meco，G.，Martignoni，E.，Lopiano，L ，Jardim，LB，Oostra，BA，Barbosa，ER，Italian Parkinson Genetics，N。和Bonifati，V。（2007）。少年帕金森病和年轻的帕金森病发病中的ATP13A2错义突变。神经病学68（19）：1557-1562。
Gietz，RD和Woods，RA（2002）。通过乙酸锂/单链载体DNA /聚乙二醇法转化酵母。方法酶350：87-96。
霍尔曼斯（Tholes），索伦森（DM），范·文（Van Veen），S。，马丁·S。，赫曼斯（M.D.），凯默（Kemmer），GC，范登豪特（C.）。，Wuytack，F.，Palmgren，M.，Eggermont，J.和Vangheluwe，P.（2015）。脂质开关可解除与帕金森氏病相关的ATP13A2。美国国家科学院院刊112（29）：9040-9045。
Holemans，T.，Vandecaetsbeek，I.，Wuytack，F.和Vangheluwe，P.（2014）。测量小鼠心脏中Ca 2+依赖性Ca 2+摄取活性。Cold Spring Harb Protoc 2014（8）：876-886。
Jidenko，M.，Lenoir，G.，Fuentes，JM，Le Maire，M.和Jaxel，C.（2006）。使用生物素化的受体域在酵母中表达和纯化膜蛋白SERCA1a。Protein Expr Purif 48（1）：32-42。
Kuhlbrandt，W.（2004）。P型ATP酶的生物学，结构和机制。Nat Rev Mol Cell Biol 5（4）：282-295。
Lin CH，Tan，EK，Chen，ML，Tan，LC，Lim，HQ，Chen，GS and Wu，RM（2008）。台湾和新加坡与帕金森病有关的新型ATP13A2变异体。神经病学71（21）：1727-1732。
Papadopulos，A.，Vehring，S.，Lopez-Montero，I.，Kutschenko，L.，Stockl，M.，Devaux，PF，Kozlov，M.，Pomorski，T. and Herrmann，A.（2007年）。通过巨大的单层囊泡形状变化，未标记脂质检测到的脂酶活性。生物化学杂志282（21）：15559-15568。
Park，JS，Mehta，P.，Cooper，AA，Veivers，D.，Heimbach，A.，Stiller，B.，Kubisch，C.，Fung，VS，Krainc，D.，Mackay-Sim，A.和Sue ，CM（2011）。P型ATPase ATP13A2（PARK9）中新突变的致病作用，导致Kufor-Rakeb综合征，这是一种早期发作的帕金森病。嗡嗡声突变体32（8）：956-964。
拉米雷斯，A。，海姆巴赫，A。格伦德曼，J。，斯蒂勒，B。汉普郡，D。，西德，LP，戈贝尔，I。，穆拜丁，AF，Wriekat，AL，罗珀，J。，艾丁，A.，Hillmer，AM，Karsak，M.，Liss，B.，Woods，CG，Behrens，MI和Kubisch，C。（2006）。遗传性帕金森氏症和痴呆症是由ATP13A2突变引起的，该突变编码溶酶体5 P型ATP酶。Nat Genet 38（10）：1184-1191。
Uemura，T.和Gerner，EW（2011）。哺乳动物细胞和组织中的多胺转运系统。方法分子生物学720：339-348。
范·范·南（Van Veen，S.），马丁·南（Martin，S.），范登·豪特（Van den Haute，C.），贝诺伊（Benoy，V.），里昂（Lyons），J.，范豪特（Vanhoutte），R. ，Zielich，J.，Swinnen，JV，Annaert，W.，Agostinis，P.，Ghesquiere，B.，Verhelst，S.，Baekelandt，V.，Eggermont，J。和Vangheluwe，P。（2020）。ATP13A2缺乏会干扰溶酶体多胺输出。自然578（7795）：419-424。