材料和试剂
1. 1.5或5毫升升管
2.涂有APS的玻璃片（松浪，目录号：SAPS）
3.盖玻片（松浪硝子，目录号：C025601）
4.剃须刀
5.铝箔
6.手套
7.拟南芥种子
8. J. prismatocarpus种子
9. 10 x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（Nacalai Tesque ，目录号：27575-31）（室温保存）
10. 1 x PBS（pH 7.4）中的0.5％（v / v）Triton X-100 （室温保存）
11.点进智达TM的EdU细胞增殖试剂盒用于成像（赛默飞世尔科技，产品目录号： C10337）（存储在4 °从光C和保护未开封部件;存储库存和工作溶液遵循生产商的规格）
12. DAPI（Thermo Fisher Scientific ，目录号：D1306）（存储在4 °C并避光）
13.赫斯特（Höechst）33342（G组成的11部分）
14.乙醇（和光（Wako），目录号：057-00451）
15.乙醇系列（30％，50％，70％，90％和100％）（在室温下存储）
16.二甲苯（和光，商品目录号：244-00081）（室温保存，最好在通风橱中保存）
17. （可选）HISTO -清除（国家诊断，目录号：HS-200）
18.石蜡（McCormick Scientific ，目录号：39502004）（在室温下保存，避免潮湿）
19.蒸馏水（dH 2 O ）
20.蔗糖（Nacalai Tesque ，目录号：30403-55）
21.维生素B5（和光ASB-00022727-001）
22.琼脂（Wako ，目录号016-11875）
23. 1百万KOH
24. Formald e hyde（和光，目录号：064-00406）
25.冰醋酸（和光，目录号：017-00251）
26. Murashige和Skoog（MS）植物盐混合物（Wako ，目录号：392-00591 ）
27. MS板和液态MS介质（请参见食谱）（储存在4°C ）
28. EdU检测鸡尾酒（请参阅食谱）
29. FAA（请参阅食谱）（在室温下存储）

设备
钳子
摇床（AS ONE ，型号：SRR-2）
共焦激光扫描显微镜（Zeiss ，型号：LSM 780）
保温箱（Taitec ，型号：HB-80）
石蜡模具（多个）
旋转切片机（Leica ，型号：Microm HM 355S）
滑动加热器（Tissue Tek ，型号：PS-52S）
幻灯片夹
玻璃罐（多个）

软件
Zen 2012蓝色版

程序
拟南芥叶原基
在MS平板上发芽经过表面灭菌的拟南芥种子。在22 °C下在连续光照（来自白色荧光灯的70μmol·m -2 ·sec -1 ）下播种（DAS）的第6天，选择健康的幼苗，并使用剃须刀。

图1.未切割（左）和切割（右）的拟南芥样品。比例尺= 1毫米。

转移样品至1.5或5米升管的大约一半填充有含有10液体MS培养基μM的EdU 。在室温下连续光照下孵育45分钟。
将样品转移到装有不带EdU的液态MS介质的新管中。轻轻摇动[≤50转/分钟（rpm）] 5分钟，三次。
在室温下在连续光照下将样品在液体MS培养基中孵育6小时45分钟。总追时间为7小时，包括WA在SH小号TEP甲3。
将样品转移到装有FAA的新管中，将样品在4 °C下固定过夜。通过真空渗透脱气几次，直到样品下沉。或者，短暂离心（130 x g ，5 s）以增强固定。
（可选）在冰上的90％丙酮中孵育样品10分钟。
在1 x PBS（pH 7.4）中的0.5％（v / v）Triton X-100中摇动（100 rpm）样品5分钟，两次。
在1 x PBS（pH 7.4）中摇动（100 rpm）样品5分钟两次。
在新试管中准备EdU检测混合物（请参阅食谱）。将样品转移到其中，并在黑暗中孵育30分钟。
将样品转移到装有1 x PBS（pH 7.4）的新管中，并摇动（100 rpm）5分钟，三次。
转移样品到新管中填充有1 X含有1 PBS（pH 7.4）中微克/米升DAPI和孵育在d 30分钟柜。
在1 x PBS（pH 7.4）中摇动（100 rpm）样品20分钟，两次，第三次过夜。
将样品用1 x PBS（pH 7.4）固定在幻灯片上，并使用配备40 x油浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜观察第一对叶片原基。使用488nm的激光激发的Alexa 488（现在共价键合至的EdU ）和490 - 535nm的发射光谱来检测的Alexa 488使用405nm激光激发DAPI和420 - 470nm的发射光谱来检测DAPI。
将样品在1 x PBS（pH 7.4）中在黑暗中于4 °C下保存长达6个月。

灯心草prismatocarp我们叶原基
发芽表面消毒J. prismatocarpus上的MS平板种子。在22 °C的28 DAS下，在连续光照（来自白色荧光灯的70μmol·m -2 ·sec -1 ）下，选择健康的幼苗，并用剃须刀切开叶子和细长根的上部（图2）。

图2.未切割（左）和切割（右）Juncus pyramidatocarpus样品。比例尺= 5毫米。

转移样品至1.5或5米升管的大约一半填充有含有10液体MS培养基μM的EdU 。在室温下连续光照下孵育2小时。
将样品转移到装有不带EdU的液态MS介质的新管中。轻轻摇动（≤50 rpm）5分钟，三次。
在室温下，在连续光照下，将样品在液体MS培养基中孵育13小时15分钟。总追时间为13.5小时，其中包括在洗涤小号TEP乙3。
将样品转移到装有FAA的新管中，将样品在4 °C下固定过夜。通过真空渗透脱气几次，直到样品下沉。
通过增加一系列的乙醇浓度（包括50％，70％，90％和100％乙醇的三种变化）使样品脱水。在每种溶液中孵育样品1小时。
通过增加一系列的二甲苯/乙醇浓度（包括25％，50％，75％和100％二甲苯的三种变化），用二甲苯代替乙醇。将每种溶液中的样品孵育30分钟。
在60 °C下，通过增加一系列石蜡/二甲苯浓度（包括25％，50％，75％和100％的石蜡），用石蜡渗透样品。在第二天将样品在25％石蜡/二甲苯中孵育过夜，在50％和75％石蜡/二甲苯中孵育4小时，第二天孵育100％石蜡。
将样品在石蜡中于60 °C再孵育三天。每天更换3次100％石蜡，至少间隔4小时。
通过在室温下固化石蜡或将模具放在冰上，将所需方向的样品嵌入模具中。
使用旋转切片机切片样品（8μm ）。在载玻片顶部添加dH 2 O，直到dH 2 O覆盖其整个表面。将连续切片安装在dH 2 O上。将载玻片在载玻片加热器上于42 °C加热过夜。
将载玻片（现在包含切片样品）放在载玻片架上。通过使载玻片固定器通过依次包含以下物质的玻璃罐，以清除石蜡：100％二甲苯10分钟，两次；50％二甲苯/乙醇5分钟; 和100％乙醇浸泡5分钟。
通过使载玻片固定器通过依次包含以下成分的玻璃容器来重新水合样品：90％，70％，50％和30％的乙醇各1分钟；dH 2 O 5分钟，两次；和1 x PBS（pH 7.4）5分钟，两次。
简要地从载玻片移除液体和应用300 μ升新鲜制备的EdU使用移液管检测鸡尾酒每张幻灯片。用盖玻片轻轻覆盖玻片，并在黑暗中孵育30分钟。
简短地从幻灯片上移走液体，然后将幻灯片放在幻灯片支架上。通过使载玻片架通过装有1 x PBS（pH 7.4）的玻璃罐5分钟，清洗样品三遍。
简要地从载玻片移除液体和应用300 μ升1 X含有8 PBS（pH 7.4）中微克/米升HOECHST 33342到使用移液管每张幻灯片。用盖玻片轻轻覆盖玻片，并在黑暗中孵育30分钟。
简短地从幻灯片上移走液体，然后将它们放在幻灯片固定器上。通过使载玻片架穿过装有1 x PBS（pH 7.4）的玻璃槽洗涤20分钟，两次，然后第三次过夜，以洗涤样品。
应用300 μ升1 X PBS（pH 7.4）中至载玻片，轻轻盖上盖玻片每张幻灯片。使用配有40 x油浸物镜的共聚焦激光扫描显微镜观察切片样品。使用488nm的激光激发的Alexa 488（现在共价键合至的EdU ）和490 - 535nm的发射光谱来检测的Alexa 488ü瑟405nm激光激发的Hoechst 33342的d 420 - 470nm的发射光谱来检测HOECHST 33342。
将玻片在4 °C的干燥玻片盒中存放最多6个月。

数据分析

适合于细胞分裂取向细胞对分析很容易在两种拟南芥（图3A）和识别J. prismatocarpus （图3B）（阴和Tsukaya ，2016和2019）。使用这些细胞对，可以定量细胞分裂角（图4）。细胞分裂角根据其值进一步分类。在拟南芥中，细胞分裂角度分类如下：沿近端-远端轴（0 - 30°和15 0 - 180° ），垂直于所述近端-远端轴线（60 - 90°和90 - 120° ），和中间体（30 - 60°和12 0 - 150° ）。在J. prismatocarpus ，细胞分裂角度分类如下：沿厚度方向（0 - 30°和15 0 - 180° ），在垂直于厚度方向（60 - 90°和90 - 120° ），和中间（30 - 60°和12 0 - 150° ）。从拟南芥的1620个细胞对（三个样品）中，确定了lea f primordia的特征是不同局部区域的非随机细胞分裂方向（Yin and Tsukaya ，2016）。从379的细胞对（26个样品）J. prismatocarpus abaxialized叶片（山口等人，2010），发现细胞分裂是在叶片厚度方向更加频繁和朝向枝条顶端分生组织（阴和分布式Tsukaya ，2019 ）。

图3.检测到的细胞对的代表性图像。A.拟南芥叶原基的一部分。的切片式叶原基（虚线轮廓）的B.叶片灯心草prismatocarpus 。比例尺= 20μm 。

图4.细胞分裂角（θ ）。A.拟南芥叶片的示意图。绿点，虚构的检测到的细胞对。实线，拟南芥叶的近端-远端轴。B.切成的Juncus pyramidatocarpus叶片的示意图。绿点，虚构的检测到的细胞对。粉红点，射出顶端分生组织。实线，的厚度方向J. PR ismatocarpus叶片。

笔记

保留切下的根作为阳性对照，因为根尖分生组织中的细胞容易被EdU染色。
为了确保温育许多样品时的准确时间，在将所有样品转移到试管后，将EdU添加到液体MS培养基中。
如果总的EdU （Alexa的488）信号为低，可以执行以下：在切口附近的茎尖的位置上的下胚轴，除去老叶，并且增加脉冲添È在步骤A2和B2 。
如果EdU （Alexa 488）对不多，则可以执行以下操作：在步骤A4和B4中增加追赶时间。
在研究新物种时，必须凭经验确定脉冲和追赶时间；拟南芥和的时间J. prismatocarpus可以用作引用。可以通过逐渐增加步骤A2和B2中的EdU孵育时间来确定脉冲时间，直到整个EdU （Alexa 488）信号达到令人满意的水平。可以通过在步骤A4和B4中以1小时的增量逐渐增加追赶时间来确定追赶时间，直到有足够的EdU （Alexa 488）对用于定量分析为止。
所述的EdU检测鸡尾酒必须在食谱部分示出的部件的顺序进行; 每次检测之前都必须新鲜制作。
EdU检测混合物检测后，将样品和载玻片置于黑暗中（例如，包裹在铝箔中）。
二甲苯是有毒，易燃和高挥发性的。必须在通风橱中小心操作。替代品，如HISTO -清除可以用作安全的替代二甲苯。
处理二甲苯，石蜡，DAPI和Höechst33342时，必须戴手套。
在幻灯片上盖玻片时，请注意不要在切片上或切片附近产生气泡。

菜谱

MS板
MS植物盐混合物1袋（〜4.6 g）
蔗糖（2％，w / v）20克
维生素B5 1米升
琼脂（4％，w / v）40克
溶解上述在〜800米升卫生署2 O，调节pH至〜使用1M KOH 5.8，加卫生署2 O操作的1的终体积，000米升，高压釜中，并且允许在板冷却

液体MS介质
以与上述MS板相同的方式进行准备，但省略琼脂的使用

联邦航空局
Formald Ë海德50米升
冰醋酸25米升
乙醇250米升
卫生署2 ö 175米升
EdU检测混合物[由Click- iT TM EdU细胞增殖试剂盒（用于成像）制成，并且必须按以下顺序制备（为清楚起见用数字表示）]
一种。点进智达TM的EdU反应缓冲液（自Component d稀释与卫生署2 O）215 μ升
b。的CuSO 4水溶液（成分E）10 μ升
C。Alexa氟® 488 （混合组分B和组分C）0.6 μ升
d。反应缓冲液添加剂（来自成分F稀释）25 μ升

致谢

我们感谢中野明彦教授（日本东京大学）和上田隆史（日本东京大学）允许使用共聚焦显微镜。这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部（MEXT）的支持（优先领域的科学研究和创新领域的科学研究，授权号25113001、25113002和19H05672）和日本化学学会促进日本科学博士后研究奖学金（授权号：P19085）。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献

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