材料和试剂
生物材料
大麻（Finola，X59 ，和蓝莓品种）种子
所有种子均在我们的实验室收获。在实验中使用的蓝莓种子不超过6个月。Finola和X59种子已有5年以上的历史了。

化学制品
过氧化氢30％（默克® ，目录号：1072091000）
的Murashige ＆Skoog基础培养基维生素（植物技术实验室® ，目录号：M519）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M3671）
E型琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A4675 ）
MS固体介质（1 L）（请参阅食谱）
塑胶制品
空的100 x 15毫米无菌培养皿（VWR International，目录号：25384-342）
无菌的一次性15或50 ml螺旋盖离心管（BD，Falcon TM ，目录号： 352070）

设备
层流通风橱（Microzone Bio Klone 2，目录号：30193-086）
pH计（Corning 430型，目录号：475303）
无菌镊子和手术刀（通过使用本生灯的热处理进行灭菌）
生长室（Sanyo MLR-350，目录号：859-600-06）：24°C，18 h光照/ 6 h暗循环，光照强度200μmol ·m -2 ·sec -1
Pro-Mix HP菌根生长培养基（Pro-Mix，目录号：20381RG）

程序
种子发芽测定
浸泡在不同浓度的过氧化氢溶液过夜种子（液体萌发培养基或萌发溶液）以及在无菌水中控制（H 2 O，1％H 2 ö 2 ，3％H 2 ö 2 ，5％H 2 ö 2 ，或10％H 2 ö 2 ）在15或50毫升螺旋帽（Falcon管）。各种发芽溶液中浸有种子的猎鹰管在室温下保持黑暗。
第二天，记录发芽溶液中发芽种子的百分比（胚根的出现被视为发芽事件），并通过倒出去除旧溶液后分别添加新鲜的各自发芽溶液。
将种子在室温下黑暗中于同一溶液中浸泡3天以上，每天记录发芽种子的百分比。
此后，将有或没有种皮的发芽的种子/幼苗从H 2 O 2溶液转移到MS培养基平板上，以观察H 2 O 2溶液发芽的种子/幼苗在MS培养基上的生长。为了转移，首先将发芽的种子/幼苗与H 2 O 2溶液一起从Falcon管倒入空的培养皿中。然后通过使用镊子将幼苗转移到无菌纸上，以去除过量的H 2 O 2溶液。最后，用镊子将发芽的种子/幼苗转移到MS培养基平板上。整个转移过程已在层流罩中进行。
然后将具有发芽的种子/幼苗的Parafilm密封MS培养基板转移至生长室（24°C，18 h光照/ 6 h暗循环，光照强度200μmol·m -2 ·sec -1 ）持续3天，观察MS培养基上H 2 O 2溶液发芽的种子/幼苗的生长和存活。
在土壤中也观察到H 2 O 2溶液发芽的种子/幼苗的生长。Pro-Mix HP菌根生长培养基，用于土壤实验。将大麻种子浸入H 2 O 2溶液（发芽溶液）中四天，然后将发芽的种子/幼苗从H 2 O 2溶液转移到土壤罐（Pro-Mix HP Mycorrhizae生长培养基）中观察生长和H 2 O 2溶液在土壤中发芽的种子/幼苗的存活率。将土壤盆转移至生长室（24℃，18h光照/ 6h黑暗周期和200μmol·m -2 ·sec -1的光照强度）。这些照片是在第12天拍摄的。

数据分析
在excel表格中计算在各种浓度的H 2 O 2溶液以及水控制下的平均种子发芽率。数据显示为平均值±SE 。

结果
在这项研究中，我们描述了一种针对大麻的快速有效种子萌发方案。Sorokin等人已经报道了该方案的简要描述。（2020）。在当前的研究中，我们已经标准化了过氧化氢（H 2 O 2 ）溶液介质的最佳浓度，以进行有效的灭菌和快速发芽。我们已经测试h的不同浓度的2 ö 2溶液以及无菌水控制（H 2 O，1％H 2 ö 2 ，3％H 2 ö 2 ，5％H 2 Ò 2 ，或10％H 2 ö 2 ）以提高杀菌和发芽效率。所有发芽（种子灭菌，发芽的三个步骤，和幼苗发育）在各种浓度为h进行2 ö 2溶液和种子保持在液体介质四天。过氧化氢具有优于氯化汞或漂白剂杀菌剂的几个显着优势，后者需要额外的种子洗涤，并且需要在Murashige和Skoog（MS）琼脂培养基中进行单独的萌发/幼苗发育步骤（Sorokin et al。，2020）。的1％H 2 ö 2溶液表现出快速且更高发芽高于ħ 2 ö 2浓度溶液，并在第1天（图水控制URE 1）。在第1天，1％H 2 ö 2相比，22.5％发芽为3％H溶液表现出82.5％发芽2 ö 2组，17.5％发芽为5％H 2 ö 2在水对照组组和47.5％发芽（图URE 1B）。有趣的是，10％H 2 ö 2没有显示出在第1天的任何发芽由于它的毒性作用（图URE 1）。在1％H 2 ö 2溶液，胚根外观（发芽）发生24小时和幼苗发育（两个完全开发子叶和两个未成熟片真叶阶段）内发生在72-96 H（图URE 1A）。与以前的发芽方法相比，发芽的外观需要4-7天，幼苗发育需要5-15天（Wielgus等，2008和其中的参考文献），我们的发芽方法导致发芽的外观在1天之内，使我们能够获得大麻苗一个很短的时间（3-7天）以最小的努力（图URES 1 - 2）。考虑H的可能的毒性作用2 ö 2 （因为发芽籽/苗H中连续逗留2 ö 2溶液4天）中，我们已经检查的进一步生存发芽种子/ MS培养基上的幼苗和土壤（图URES 2 - 3 ）。在MS培养基，1％H 2 ö 2溶液幼苗存活比其他处理（图更好URE 2）。水发芽的种子表现出污染和在MS介质（图没有生存URE 2）。类似地，由于在h的更高浓度的毒性作用2 Ó 2 ，10％H 2 ö 2发芽的种子没有在MS介质（图生存URE 2）。1％H 2 O 2溶液幼苗在土壤中也能很好地存活（图3）。除此之外，我们还测试了我们的方法对于超过5岁的大麻的种子具有较低的可行性，这表明1％H 2 ö 2溶液介质表现出一个比水控制非常高的发芽率（〜50％）（〜10％）（图4）。总之，我们已经开发了一种快速有效的方法，用于在无菌条件下用于组织培养和其他敏感应用的紫花苜蓿种子萌发。

图1.在不同浓度的过氧化氢溶液和水控制下，六个月大的蓝莓品种的种子发芽。A.第1天到第4天，在各种浓度或水质控制的H 2 O 2溶液中发芽的种子/幼苗的代表性照片。B.在各种浓度的H 2 O 2溶液或水质控制之间的发芽率比较。数据显示为平均值±SE（n = 4）。在每个重复中，使用了30粒种子。

图2. H 2 O 2溶液在MS培养基上发芽的蓝莓品种种子/幼苗的生长和存活的代表性照片。将蓝莓品种的种子在H 2 O 2溶液（发芽溶液）中浸泡4天，然后将发芽的种子/幼苗从H 2 O 2溶液转移到MS培养基平板上，观察H 2 O 2的生长和存活溶液在MS培养基上发芽的种子/幼苗。这些照片在第0天（取刚转移到MS培养基平板上后，日）1（后24转移到MS培养基平板h的），和第3天（72后的MS培养基上转移至MS培养基平板上的H）。

图3.在土壤中生长的蓝莓品种幼株的代表性照片（Pro-Mix HP菌根生长培养基）。将蓝莓品种的种子在H 2 O 2溶液（发芽溶液）中浸泡4天，然后将发芽的种子/种苗从H 2 O 2溶液转移到土壤罐（Pro-Mix HP菌根生长培养基）中观察H 2 O 2溶液在土壤上发芽的种子/幼苗的生长和存活。这些照片是在第12天拍摄的。

图4. Finola和X59品种的5岁种子在1％过氧化氢溶液和水控制中的萌发。1％H 2 O 2溶液介质和水控剂之间的发芽率比较。数据显示为平均值±SE（n = 5）。在每个重复中，使用了约30个种子。

菜谱
MS固体培养基（1升）
4.43 g含维生素的Murashige和Skoog基础培养基
500毫克MES
30克蔗糖
8克琼脂
用KOH将pH调节至5.7，并在121°C高压灭菌40分钟进行灭菌。25毫升MS的媒体上每个培养皿。

致谢
该协议源自Sorokin等人。（2020）。我们感谢在自然科学和加拿大（NSERC）工程研究理事会和MITACS资助我们的工作

利益争夺
作者宣称他们没有竞争利益。

参考文献
Chandra，S.，Lata，H.和ElSohly ，MA（2017）。大麻植物学和生物技术。钱德拉，S.，拉塔，H。和ElSohly ，MA （编。）。施普林格国际出版社：瑞士湛。书号：9783319545639 。
D.Gaudet ，NS的Yadav，A。的Sorokin，A。的Bilichak和I.的Kovalchuk（2020年）。大麻花粉发芽试验和长期保存的开发和优化。植物9：665。
A.Sorokin，A.Yadav，D.Gaudet和I.Kovalchuk（2020）。β-葡萄糖醛酸苷酶基因在大麻品种中的瞬时表达。植物小号ignal乙ehav 15（8）：1780037。
维尔古斯，K.，Luwanska ，A.，Lassocinski ，W和卡兹玛瑞克，Z.（2008）。估计对愈伤组织诱导和植物再生必不可少的大麻组织培养条件。Ĵ纳特纤维5：199-207。