材料和试剂
1. Kimtech雨刷器（Yuhan ，目录号：47201；KimWipes ，目录号：470224-038）
2.微型汤匙铲刀（Scilab ，目录号：SL.Spa 7011，L150，Bowl-3x5，Blade-5x50，Stem-Ø2.5mm）
3.移液器
4. 60毫米培养皿（SPL大号IFE š ciences，目录号：10060;托马斯小号系统求解，目录号：1213F04）
5. 48 -孔板小号（托马斯小号系统求解，目录号：1219Z64）
6.工业单刃剃须刀片（Dorco ，目录号：4649676382；Polysciences ，目录号：08410-1）
7.盖玻片（Marienfeld -Superior ，目录号：HSU-0101152-22x60、40、32；ThermoFisher ，目录号：12-545-J，C，B）
8.显微镜载玻片小号（Marienfeld的-高级，目录号：HSU-0810001;赛默飞，目录号：12-544-7）
9.鼠标眼球*
10. pH 7.4的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（Welgene ，目录号：LB 001-02； Fisher Scientific，目录号：14190250）
11. PBS，pH 7.4中的4％多聚甲醛（PFA）（Biosesang ，目录号：PC2031； Thermo Scientific，目录号：J19943K2）
12.过氧化氢（H 2 O 2 ）（30％，Sigma-Aldrich，目录号：216763）
13. Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
14.叠氮化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002）
15.牛血清白蛋白（GenDEPOT ，目录号：A0100； Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
16.标记RPE，小胶质细胞和细胞核的抗体和染色剂：
RPE65（Lif e Technologies，目录号：MA1-116578，稀释度1：500）
CD11b的（Bio-Rad公司，前身ABD Serotec公司，目录号：MCA711，稀释1：1 ，000）
Phallodin-488（Life Technologies，目录号：A12379，稀释度1：500）
的Alexa Fluor568的缀合的二级抗体（Life Technologies公司，目录号：A-11004，稀释1：1 ，000）
赫斯特33342（Life Technologies公司，目录号：H3570，稀释1：1 ，000）
17.安装缓冲液Fluoromount -G（Southern Biotech，目录号：0100-01）
笔记：
一种。该协议是在美国国家眼科研究所，国家开发Institu Ť健康的ES（美国），并已在被采纳的外来体P LU的公司（韩国）。因此，我们尝试提供在美国和韩国使用的商业目录编号。
b。*可以使用任何鼠标眼球，但是有色眼球需要黑色素漂白（Kim等人，2016）。

设备
打字钳（McPherson，直5毫米，光滑10.8 CM）
5号钳（Dumont，Swiss，目录号s ：B-0208-5-PS，B-0108-5-PS; Roboz ，目录号：RS4925）
微弹簧剪刀（BI有我nstruments，目录号：AC778 / 02; Roboz ，目录号：RS5601）
摇床（实验室伴侣，型号：SK-300）
[漂白选项]加热块
共聚焦显微镜（Carl Zeiss Meditec ，型号：Zeiss-700 ）
解剖离子体视显微镜（Kern- Shhn ，型号：OZL-45R;卡尔贼SS Meditec公司，STEMI 508分之305 ）

程序
透化/封闭/抗体稀释储备液和工作溶液的制备
PBS中的10％Triton X-100，原液：总体积50 ml；PBS中5 ml Triton X-100。
蒸馏水（DW）中的10％叠氮化钠，原液：总体积，50 ml；在DW中加入5克叠氮化钠。
PBS中的0.01％叠氮化钠用于固定眼球的储存：总计500 ml；1 ，000 X稀释（500 μ升10％氢氧化钠的）叠氮化于PBS中。
0.5％Triton X-100、0.01％叠氮化钠PBS中的1％BSA溶液，封闭和稀释的工作溶液：总体积为50ml；20 X在0.01％的钠10％的Triton X-100（2.5毫升）中，将0.5g BSA的稀释叠氮化物的PBS中。

修复眼部的通货膨胀球
用打字钳从小鼠眼球上摘除眼球，在室温下将其固定在4％PFA-PBS中1 h。
用PBS冲洗两次。
将眼球存放在4 ％的0.01％叠氮化钠PBS溶液中 ℃下直至使用。
[有色眼球的漂白方法]将有色全眼球放入10％H 2 O 2中，在4 °C的条件下漂白黑色素一周。
注意小号：

如果您发现眼球，由于内源性过氧化物酶活性过多的泡沫，确保储存固定eyeb承滴盘在4 ° C ^过一晚小时，然后将2 Ø 2漂白和/或放的眼球为1-3％H 2 Ø 2在10％H 2 O 2之前先进行10-20分钟。
代替这一步，可以使用'55 ℃下1-2小时”（小号EE程序C）。

后眼球的制备-巩膜脉络膜/ RPE /视网膜
准备ñ Ø。5个镊子，剪刀弹簧，刮水器，刮铲60个mm培养皿中，48 -孔平板，解剖显微镜，PBS和移液管（图1A）。
在解剖显微镜下，用微型弹簧剪刀和N o从PBS湿润的KIMTECH擦拭器上的眼球上取下视神经头和肌肉组织。5钳（图1 B；视频1）。
在口锯缘上切一个圆，并去除角膜和晶状体（图1C，1D；视频2）。
冲洗Sclerochor Ø ID / RPE /视网膜在PBS。
[ ø ption用于着色的眼球漂白]把Sclerochoroid / RPE /视网膜成10％H 2 ö 2为黑色素漂白在55 ℃下为1- 2小时，并在PB冲洗一下S.
注意：您可以在程序B中使用“ 4 °C一周”来代替此步骤。
染色之前，用刮刀将硬化脉络膜/ RPE /视网膜组织放入装有PBS的48孔板中（图s 1E，1F）。

图1.巩膜脉络膜/ RPE /视网膜的制备，染色和固定。一。准备硬化脉络膜/ RPE /视网膜的必要项目。乙。在解剖显微镜下，用PBS润湿的KIMTECH刮水器上的眼球去除视神经，肌肉，角膜和晶状体（视频1）。C.Ora锯齿状。D.角膜，晶状体和小号clerochoroid / RPE /视网膜。E.使用刮刀转移硬化脉络膜/ RPE /视网膜组织。F. Sclerochoroid / RPE /视网膜组织在一个48 -孔板中的染色过程中（箭头的头）。G.使用刀片将巩膜脉络膜/ RPE /视网膜的象限安装在载玻片上。RPE，视网膜色素上皮。

视频1.准备眼球

视频2.去除角膜和晶状体

染色方案
在RT摇动（85 rpm）1-2 h的封闭溶液中通透硬化脉络膜/ RPE /视网膜组织。
在室温摇动（85 rpm）下，在含有一抗（例如RPE65，CD11b）的封闭溶液中孵育脉络膜/ RPE /视网膜2小时至6天。
洗涤Sclerochoroid在PBS / RPE /视网膜三次在RT ，对于每个10-15分钟进行摇动培养（85 RPM）。
孵育Sclerochoroid / RPE /视网膜中含有荧光标记的第二抗体和其他试剂如Phallodin-488和Hoechst 33342在RT振荡（85 rpm）的2小时至6天的封闭溶液。
在RT摇动（85 rpm）下在PBS中洗涤硬化脉络膜/ RPE /视网膜3次，每次10-15分钟。
把染色的Sclerochoroid / RPE /视网膜上与针对玻璃神经节细胞（GC）层，切割玻璃载玻片成象限（图1G）和与安装一个盖玻片。
笔记：
使用染色溶液的足够体积（超过250微升），和洗涤溶液（500微升PBS）。
可以优化染色剂的孵育时间。建议孵育6天以增强标记强度。以1抗体稀释：1 ，000，在荧光标记的强度Sclerochoroid / RPE /视网膜染色不前6天饱和的（数据未显示）。长时间孵育和强大的荧光标记使我们可以在共聚焦扫描之前使用荧光显微镜轻松观察巩膜脉络膜/ RPE /视网膜支架中的RPE层。
在整个安装染色中，由于厚度和密度的不同，外围区域的标记强度要比中心强（图2）。
使用RT条件而不是4 °C可以节省时间（图3）。
请勿使用压力相关的大分子有效稳定地转移到器官（PRESTO）方法（Lee and Sun ，2016）。在这种染色中，PRESTO（600 x g）优于RT摇动。我们怀疑大脑和视网膜之间的分子渗透和扩散会有所不同（图4）。
如果要扫描视网膜内层如神经节细胞层，安装染色Sclerochoroid / RPE /视网膜上与SCLE载玻片贴在玻璃岭层。

图2.取决于整个安装位置的不同标签强度。从象限整个底座的中心（R1）和外围（R2）区域（左）扫描RPE层中的图像。Sclerochoroid / RPE /视网膜组织中通过phallodin-488（右上），RPE65抗体（左下）和Hoechst 33342（右下）在室温染色，摇动2小时。RPE，视网膜色素上皮。SCAL ë巴，20 μ米。

图3.取决于染色温度的不同标记强度。Sclerochoroid / RPE /视网膜组织中通过phallodin-488（右上），RPE65抗体（左下）和Hoechst 33342（右下）在RT振荡6天染色。从中心扫描RPE层中的图像。RPE，视网膜色素上皮。比例尺，20 μ米。

图4.没有在PRESTO的利益Scleroch oroid / RPE /视网膜染色。Sclerochoroid / RPE /视网膜组织中phallodin-488（右上），RPE65抗体（左下）和Hoechst 33342（右下）在RT，无论是摇动或使用PRESTO（600克）染色，2小时。从中心区域扫描RPE层中的图像。PRESTO，压力相关的大分子有效稳定转移到器官；RPE，视网膜色素上皮。比例尺，20μm 。

影像学
扫描Scl脉络膜/ RPE / Retina整个安装座中任何层的水平视图：可以在共焦显微镜的任何物镜下捕获单幅，z幅和平铺扫描图像。为此通常可以接受20倍物镜。

笔记：
该协议值得观察视网膜下微胶质细胞或巨噬细胞（图5），它们在一般协议中被分离成视网膜和/或脉络膜/ RPE整个支架。请参阅其他资源，以证明视网膜下小胶质细胞和扩展过程（Kim等，2016）。
建议将该协议用于视网膜下观察并查看邻近的层，但是它也可以处理从巩膜到GC层的任何视网膜层（图6）。

图5.整个脉络膜/ RPE /视网膜的视网膜下小胶质细胞。Sclerochoroid / RPE /视网膜组织进行标记的phallodin-488（绿色），CD11b抗体（红色）和Hoechst 33342（蓝色）。图像被从脉络膜/ RPE捕获至感光体层的上层，每2 μ米的z间隔。A.一个投影图像。B.图像布置在4 μ米间隔。箭头指示小胶质细胞从感光层迁移到视网膜下的过程。Ph，感光器；RPE，视网膜色素上皮。比例尺，50 μ米。

图6.从巩膜到神经节细胞层的视网膜层中的细胞核，被Hoechst 33342染色。Ch，脉络膜；RPE，视网膜色素上皮；ONL，外核层；INL，内核层；GC，神经节细胞。比例尺，20μm 。

致谢
我们感谢Robert N. Fariss ，Mercedes Campos和Gail Seabold （NI H），Bo - Hyun Moon（乔治敦大学）。该协议以先前的工作为基础，并在各个部分中进行了引用。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献
Kim，SY和Assawachananont ，J.（2016）。一种可视化从色素沉着的整个眼睛的视网膜色素上皮到视网膜组织的完整视网膜下的新方法。Transl Vis科学技术5（1）：6。
Lee E.和Sun W.（2016）。ACT-PRESTO：用于体积成像的生物组织清除和免疫标记方法。Ĵ显示精通（118）：54904。
Renier ，N.，Wu，Z.，Simon DJ，Yang，J.，Ariel，P.和Tessier-Lavigne，M.（2014）。iDISCO：一种简单，快速的免疫标记大组织样本以进行体积成像的方法。细胞159（4）：896 -910 。
Ye，Y.，Dinh Duong，TA，Saito，K.，Shinmyo ，Y.，Ichikawa，Y.，Higashide，T.，Kagami ，K.，Fujiwara，H.，Sugiyama，K.和Kawasaki，H. 2020）。使用组织清除方法在小鼠和雪貂完整眼中观察视网膜。Transl Vis科学技术9（3）：1。