材料和试剂

透气密封膜（Breathe- Easy TM密封膜，Diversified Biotech，目录号：Z380059）
15 ml离心管（Sarstedt ，目录号：62.554.502）
50 ml离心管（Sarstedt ，目录号：62.547.254）
透明96孔板（品牌，目录号：781662）
96孔深板，2.2 ml孔（品牌，目录号：701354）
1.5 ml微量离心管（VWR，目录号：20170-038）
Parafilm M（Bemis，目录号：HS234526A）
培养皿（Sarstedt ，目录号：82.1472.001）
噬菌蛭弧菌HD100（来源：Sockett RE，皇后医疗中心诺丁汉）
大肠杆菌BW25113（来源：实验室收藏）
琼脂（AppliChem，目录号：A0949）
无水乙酸钠（Roth，目录号：6773）
CaCl 2 ·2H 2 O（Emsure ，Merk ，目录号：102382）
HEPES游离酸（Roth，目录号：9105）
MgSO 4 ·7H 2 O（Roth，目录号：P027）
蛋白ept （BD，Bacto TM ，目录号211830）
胰蛋白（（BD，Bacto TM ，目录号：211699）
酵母菌（BD，Bacto TM ，目录号212720）
NaCl （Applichem ，目录号：A4661.5000）
CaCl 2储备溶液（请参阅配方）
MgSO 4储备溶液（请参阅配方）
YT汤（请参阅食谱）
YPSC肉汤（请参阅食谱）
Ca / Mg / HEPES缓冲液（请参阅食谱）
底部琼脂（请参见食谱）
顶级琼脂（请参阅食谱）
LB琼脂（参见食谱）
设备

台式离心机（来自任何合格的供应商）
250毫升瓶（VWR，目录号：215-1593）
500毫升瓶（VWR，目录号：215-1595）
本生灯（来自任何合格的供应商）
Cuvettes （Sarstedt ，目录号：67.742）
250毫升烧瓶（VWR，货号：214-0423）
冷冻室，-80°C（来自任何合格的供应商）
平板培养箱（来自任何合格的供应商）
层流罩（来自任何合格的供应商）
接种环（来自任何合格的供应商）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，目录号：75002471）
多道移液器（8倍速）100 - 1200微升（吉尔森，目录号：FA10039）
多道移液器（8倍速）30 - 300微升（赛多利斯，目录号：LH-729140）
相衬显微镜，放大倍率等于或大于1,000倍（来自任何合格的供应商）
移液管0.5 - 10微升仪（Eppendorf，目录号：3120000020）
移液管10 - 100微升仪（Eppendorf，目录号：3120000046）
吸移管100 - 1000微升仪（Eppendorf，目录号：3120000062）
酶标仪（TECAN，型号：Infinite M200 PRO）
斑块可视化室（Marine et al 。，2020：图S9）
冰箱，4°C（来自任何合格的供应商）
摇床（Infors HT，Multitron标准）
分光光度计（Eppendorf，基本生物光谱仪，目录号：6135000017）
水浴（来自任何合格的供应商）
微波（来自任何合格的供应商）

软件

棱镜5（GraphPad，https ://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）
但是，可以通过设置修改的Gompertz方程来使用任何其他统计软件（Lambert和Pearson，2000）。
WPS Office（金山词霸，https://www.wps.com/）

程序

该协议详细介绍了从培养细胞到建立MIC实验并确定MIC点的细菌芽孢杆菌抗菌测试的每个步骤。工作流程的概述如下：
从甘油储备中复兴细菌性芽孢杆菌
液体培养中细菌杆菌的生长
抗菌药敏试验
在双层琼脂板上枚举
捕食细菌的抗菌药敏试验

注意：所有需要在无菌条件下进行层流操作的步骤均用符号“ *”表示。

从甘油储备中复兴细菌性芽孢杆菌
第一天：
打开装有大肠杆菌的甘油储备管，并用无菌接种环*刮擦冷冻培养物的顶部。
条纹的大肠杆菌细胞在上的LB 1％琼脂板上的边界部，通过轻触LB琼脂与含有接种环的大肠杆菌细胞和条纹环路来回。要产生单个菌落，请对环进行灭菌，然后通过在第一部分上划线，将细菌从琼脂表面轻轻地拖曳穿过琼脂的表面，从第一部分移至平板的另一部分。重复此步骤一两次，以将细菌从第二或第三部分传播到平板的新部分*（Slonczewski等人，2020：图4.11，第131页）。
将培养板颠倒放置在37°C的培养箱中过夜。这些板可在4°C下保存2周。
第二天
将5 ml YT肉汤倒入50 ml管中。使用接种环*用4个单独挑选的大肠杆菌菌落对肉汤进行接种，并在37°C下以约170 rpm的振动孵育培养物过夜。该步骤必须在下午晚些时候完成，这样大肠杆菌细胞才不会过度生长。
第三天
拧开装有底部和顶部琼脂的瓶子的盖子，并在微波炉中将琼脂融化（500毫升底部琼脂可浇铸20至25个平板； 25平板所需的顶部琼脂的量为125毫升）。融化琼脂可能需要几分钟，具体取决于功率设置和要融化的琼脂数量。确保旋开瓶盖的一部分，以使沸腾的蒸汽逸出。我们建议使用最小功率设置，并在液化琼脂开始煮沸后立即停止微波。取出瓶子，轻轻旋转使其混合（小心，搅动时液体琼脂会沸腾）。重复在微波中加热并混合，直到所有琼脂融化且没有可见团块。然后，最后一次以较高的功率设置短暂加热琼脂，以融化所有肉眼看不到的残留块。
随后，将瓶子放在55°C的水浴中直至达到该温度（注1）。
用CaCl 2和MgSO 4分别补充底部和顶部琼脂，使其最终浓度分别为2 mM和1 mM * 。
倾的层（20 -在培养皿中（10厘米直径）底部琼脂并通过轻轻摇动培养皿均等地分配它25ml）中的* 。
离心5 ml的大肠杆菌过夜培养物，然后将其重悬在用尽的培养液中（用于培养细胞），最终OD 600为〜10 * 。
注意：OD之间的关系600和细胞生物质仅在低吸光度值近似于线性（通常至多0.3 - 0.4，这取决于仪器和比色皿）。因此，应准备大肠杆菌过夜培养物的系列稀释液（例如1：2）以测量OD 600 。通过建立吸光度与稀释因子的关系图，可以确定值的线性范围。线性回归可用于计算未稀释的过夜培养物的OD 600值。
加入500微升的浓过夜的大肠杆菌培养物和5ml的顶部琼脂在10ml的试管* 。
用无菌盖盖好管子后，通过颠倒2次（避免形成气泡）*轻轻混合。
将琼脂快速倒入装有凝固的底部琼脂的皮氏培养皿中，然后轻轻旋转皮氏培养皿*将其均匀分布。将培养皿留在层流罩下面，以便琼脂在半开盖的情况下凝固。
在双层琼脂平板（即由底部和顶部琼脂组成的2层平板）的中心，用大肠杆菌吸取50μl解冻的B.细菌B.甘油原液（含有20％（v / v）甘油）顶部琼脂中的细胞* 。
将此板放在层流罩下面，将盖子半开，以干燥B. bacteriovorus悬浮液* 。
后B.弧菌悬浮液干燥（后约30分钟），密封该板，盖和板用封口膜，以防止其干燥。
在29°C下将平板孵育2至3天，直到在平板中央已经观察到琼脂上清晰的区域（噬菌斑）（由于大肠杆菌裂解），其中已应用了B.细菌菌悬液（图1）。）。
注意：Ca / Mg / HEPES双层琼脂平板可在室温下保存2周，而不会显着影响B.细菌的活力（Lambert等，2008）。
图1.双层琼脂板上的B.细菌噬菌斑。在应用时，从甘油原液中回收的B.细菌杆菌在双层平板（顶部琼脂中含有大肠杆菌）上形成一个大噬斑。用移液管从菌斑中心（琼脂上的孔）取一些琼脂。

在液体培养中生长细菌杆菌
注意：在慢速生长或固定相细菌猎物的存在下，B。细菌的捕食效率更高。DNB（稀释的营养肉汤），YT（酵母提取物，胰蛋白try）和YPSC（酵母提取物，蛋白ept，钠，钙）等培养液的营养素含量低，导致细菌生长速度缓慢，最初用于伴生细菌芽孢杆菌及其猎物的培养（同时用捕食性和猎物性细菌接种新鲜肉汤）。尽管大多数研究小组在过夜培养的固定相猎物细菌上生长了细菌芽孢杆菌，但他们仍使用DNB或YT肉汤（YPSC主要用于双层琼脂平板上的伴随生长）。影响捕食效率（进而影响捕食性细菌生长）的关键点是缓冲液/培养液的Ca 2+和Mg 2+浓度以及pH值。通常，细菌芽孢杆菌在7.2至7.6的pH值和2-3 mM Ca 2+ （CaCl 2 ）和1-3 mM Mg 2+ （MgSO 4或MgCl 2 ）的浓度下培养。其他肉汤成分，例如蛋白ept和酵母提取物，似乎可以增加细菌噬菌芽孢杆菌的活力和耐用性。
第一天：
在LB 1％琼脂平板上划线大肠杆菌猎物细胞，获得单个菌落*并在37°C下孵育过夜。
第二天：
将2 ml YT肉汤倒入15 ml管中。使用接种环*用4个单独选择的大肠杆菌菌落将此肉汤接种，并在37°C的摇动条件下（〜170 rpm）孵育过夜。
第3天：
琼脂从切除顶部层的一部分B.弧菌斑块面积（顶部琼脂具有软凝胶状稠度和能够容易地吸收使用1000微升移液管组来≥250微升）和移液器向上转移细胞和向下放入含有过夜猎物培养物的试管中*。在摇动条件（〜170 rpm）下于29°C孵育1至2天，直到培养物澄清（裂解）。
将5 ml YPSC肉汤倒入50 ml管中。使用接种环将培养液分别接种4个单独选出的大肠杆菌菌落，并在37°C下以〜170 rpm摇动孵育过夜。
第四天：
当细菌噬菌芽孢杆菌培养物清晰可见时，在相差显微镜下检查细菌芽孢杆菌的存在和猎物细胞的溶解。
注意：˚F或为此，5微升的培养物可被用于在显微镜检查。细菌性芽孢杆菌细胞可以通过其较小的尺寸和较高的运动性而与其他细菌区分开，而糊状塑料（生长在猎物中的细菌性芽孢杆菌）是圆形的。
将100μl的B.细菌菌培养物添加到大肠杆菌过夜培养物中*，并在摇动条件下（〜170 rpm）在29°C下孵育24 h。
将5 ml YPSC肉汤倒入50 ml管中。使用接种环*用4个单独挑选的大肠杆菌菌落将此肉汤接种，并在37°C下以〜170 rpm摇动孵育过夜。
第五天：
在相衬显微镜下检查B.细菌菌培养物是否存在B.细菌菌和捕食细胞裂解。
将100μl的细菌杆菌培养物（从第4天起）添加到大肠杆菌过夜培养物*中，并在摇动条件下（〜170 rpm）于29°C孵育24小时。
使用接种环*，用4个单独挑选的大肠杆菌菌落接种所需体积的YPSC，并在37°C下以〜170 rpm摇动孵育过夜。在准备此培养物时，应考虑获得大约2 ml每种待测抗微生物剂所需的体积（即，每个母板2 ml培养物）。
第六天：
在相衬显微镜下检查B.细菌菌培养物是否存在B.细菌菌和捕食细胞裂解。
向装有大肠杆菌过夜培养物的烧瓶中加入1 ml细菌杆菌培养物（从第5天开始）*，并在摇动条件下（〜170 rpm）在29°C下孵育24小时。
使用接种环*，用4个单独挑选的大肠杆菌菌落接种所需体积的YPSC肉汤，并在37°C下以〜170 rpm摇动孵育过夜。计算所需的体积，如下所示：

大肠杆菌培养物体积=主板数* 10毫升+ 10毫升
例如，对于3个板，需要的大肠杆菌培养物体积等于3 * 10 ml + 10 ml = 40 ml

抗菌药敏测试（图2，左图）
第七天：
制备抗微生物两倍沿着干净的96孔高原的行系列稀释液在100 ES微升钙/镁/ HEPES缓冲液包括对照不含抗菌（每板抗微生物剂）*。
注意：理想情况下，MIC点应落在抗菌剂浓度范围的中间。作为起点，研究人员可以将已知的MIC值用于其他细菌物种。如果特定初始PPR的MIC超出数值范围或太靠近一端，则应在调整的浓度范围内重复测试。
在相衬显微镜下检查B.细菌菌培养物是否存在B.细菌菌和捕食细胞裂解。
稀的B. bacteriovor我们培养物（从第6天），通过在25钙/镁/ HEPES缓冲液中的因子（在此稀释需要确保的0.2-0.005的范围内测定中的初始PPR）*。
将此B. bacteriovorus稀释液分成两个单独的50 ml管*。该稀释液的一部分将被灭活，并用作制备系列稀释液的稀释剂。具有活性细菌芽孢杆菌的另一部分将用于制备系列稀释液并进行计数。计算所需的体积，如下所示：

活性细菌稀释体积=母板数* 4 ml + 10 ml

灭活细菌的体积稀释度=母板数* 13 ml + 10 ml

通过在100°C的水浴中孵育5分钟，灭活一部分细菌芽孢杆菌稀释液。
在无菌的深96孔板中沿色谱柱线准备双歧杆菌双倍系列稀释液（来自S tep C3），包括对照（不存在可行的双歧杆菌）*。
从该板的每个孔（S tep C6）转移50μl到主板的相应孔（S tep C1，具有抗菌稀释系列的板）*。
加入50微升的的大肠杆菌过夜培养到每个板孔*。
在酶标仪中以600 nm的波长测量空白。
用透气膜*密封主板，并在摇动条件（300 rpm，3 mm直径轨道（或抛掷））下于29°C孵育24 h。
在分光光度计中，测量大肠杆菌过夜培养物在600 nm处的吸光度（必须在新鲜肉汤中以不同的稀释度进行测量，以使其处于数值的线性范围内）。
第八天：
在读板器中测量波长为600 nm的主板（从第7天开始）的吸光度。

在双层琼脂板上枚举
注意：由于细菌活力会随着时间的推移而降低，并且可能导致较低的估计值，因此必须在抗微生物试验的同一天进行电镀捕食细菌的计数。
在双层琼脂平板上平板接种（或噬斑测定）是枚举，分离或鉴定样品中噬菌体和掠食性细菌的最常用方法。捕食性细菌和噬菌体均溶解猎物/宿主细菌，并在琼脂平板上形成噬菌斑。双层平板分两步浇铸，即底部的厚琼脂层（即底部琼脂）和顶部的薄层琼脂（即顶部琼脂）中包含猎物和掠食性细菌。底部琼脂有助于保持顶部琼脂的湿润和柔软，缓冲pH值，并为猎物细菌提供营养。顶部琼脂的琼脂含量低（以提高噬菌斑形成的效率），并以薄层倒入，以便在琼脂表面上形成噬菌斑（从而提高可见度），并防止噬菌斑在彼此之上形成。
第七天：
拧开顶部琼脂瓶的盖子，然后将琼脂放在微波炉中融化。
在55°C的水浴中孵育瓶子，直到达到该温度（注1 ）。
分别用CaCl 2和MgSO 4补充顶部琼脂至终浓度分别为2 mM和1 mM *。
将5 ml的大肠杆菌过夜培养物以5,000 xg的速度离心6分钟，然后将其重新悬浮在用尽的培养液（用于培养细胞）中，最终OD 600为〜10 *。
在Ca / Mg / HEPES缓冲液中制备25倍稀释的B. bacillusvorus培养物的十倍系列稀释液（来自S tep C3）*。
注：P花边在机架8个1.5ml离心管中，并将其标记为-1至-8。吸取900微升钙/镁/ HEPES的各管，再加入100微升的B.弧菌的25X稀释的培养，以在第一管（10 -1稀释度）。用新的吸管尖端替换吸管的尖端，混合第一支试管的内容物，并将100μl的这种稀释液转移至第二支试管（10 -2稀释液）。重复后面的步骤，将10 -2稀释液稀释10倍，然后对其余所有试管进行稀释。
通常，细菌噬菌芽孢杆菌培养物的10 -4至10 -6稀释液会导致在平板上形成单个噬菌斑（Lambert等，2008）。不需要重复的板。
到一试管中，加入100微升的系列稀释液和500微升的浓缩的大肠杆菌过夜培养以及将5ml顶层琼脂*的。
用无菌盖盖好管子后，通过颠倒2次（避免形成气泡）*轻轻混合。
将琼脂快速倒入装有底部琼脂的培养皿中，并轻轻旋转培养皿*将其均匀分布。将培养皿留在层流罩下面，以便琼脂在半开盖的情况下凝固。
用石蜡膜密封板盖和板，以防止其变干* 。
在29°C下孵育3至4天，直到在顶部琼脂中形成透明的噬菌斑（由于大肠杆菌裂解）。
估计的数B.弧菌通过计数噬斑形成单位在初始接种培养细胞（PFU;菌落形成单位对非掠夺细菌的等效单一的生长。B.弧菌细胞产生单斑）。
可选：可以通过斑块可视化室获取斑块的图片（Marine等人，2020年：图S9）。

猎物细菌的抗菌药敏试验（图3，左图）
第一天：
使用接种环*用4个单独挑选的大肠杆菌菌落接种YPSC肉汤，并在37°C下以〜170 rpm摇动孵育过夜。
第二天：
沿深96孔板的行（包括不含抗菌剂的对照）在100μlCa / Mg / HEPES中准备两倍系列抗微生物剂稀释液（每个板可检测2种抗微生物剂，一式三份）*。
将5,000 xg的大肠杆菌过夜培养物离心6分钟，弃去上清液，然后重新悬浮在Ca / Mg / HEPES缓冲液中（洗涤步骤）*。
将其以5,000 xg离心6分钟，然后重新悬浮在Ca / Mg / HEPES缓冲液中，最终OD 600为0.024 *。
将50μl的此大肠杆菌悬浮液和50μl的新鲜YPSC肉汤添加到主板（带有抗菌稀释系列的平板）的孔中*。
在酶标仪中以600 nm的波长测量空白。
密封带有透气膜*的板，并在摇动条件下（300 rpm，3 mm投掷）在29°C下孵育24小时。
第3天：
在读板器中测量波长为600 nm的主板（从第2天开始）的吸光度。

数据分析

细菌噬菌芽孢杆菌抗菌测试结果的数据分析（图2，右图）
注意：B.细菌细菌的抗菌测试应至少重复3次。仅处理来自三个实验（板）的数据，其中细菌杆菌和大肠杆菌均在无抗生素的孔中生长（对照）。可以测试已知功效的抗生素（例如甲氧苄啶或氨曲南； Marine等人，2020年）以验证该方法的正确性。
通过将细菌孢菌数除以大肠杆菌细胞数，从细菌菌计数和大肠杆菌吸光度读数估算初始PPR 。
从相应的吸光度值中减去空白（包括对照）。
在相同的抗菌浓度下，从不含细菌杆菌的大肠杆菌的控制值中减去结果值。
将这些吸光度Δ值转换为生长百分比值。
将这些数据相对于抗菌素浓度的对数作图。
从网页上下载用于Gompertz修改方程的GraphPad文件。
打开文件，将细菌细菌的生长抑制曲线拟合到Gompertz修改方程（Lambert和Pearson，2000）。程序通过将与下渐近线相切的线与与拐点相切的线的方程式的相交点，通过程序计算出表观MIC值：MIC = 10 （M + 1 / A）；其中A是上下渐近线之间的距离，M是拐点处的对数浓度（Lambert和Pearson，2000年）。
对于每种抗菌剂，将表观MIC值与初始PPR的对数作图。
通过线性回归（在值的线性范围内）确定PMIC为0.02时的参考MIC值。

图2. MIC测定抗微生物剂为B.弧菌。抗菌素敏感性测试方案（左图）。的氨曲南的在0.024初始PPR MIC的计算被示出作为一个例子（右图）。用圆圈括起来的字母数字字符表示文本中的相应步骤。

大肠杆菌抗菌测试结果的数据分析（图3，右图）
注意：每种抗菌素应至少重复三遍大肠杆菌试验。仅处理来自三个实验（板）的数据，其中大肠杆菌在没有抗生素的情况下在孔中生长（对照）。可以测试一种已知功效的抗生素（例如氨曲南； Marine等，2020），以验证该方法的正确性。
从相应的吸光度值中减去空白（包括对照）。
将这些吸光度值转换为生长百分比值。
将这些数据相对于抗菌素浓度的对数作图。
将大肠杆菌的生长抑制曲线拟合到Gompertz修正方程（Lambert和Pearson，2000）。
为比较得到的结果B.弧菌和大肠杆菌除以B.弧菌的MIC值对于每个抗微生物为相应的大肠杆菌MIC值。大于1的比率更高指示更高的电阻B.弧菌相比于针对抗微生物大肠杆菌和反之亦然。

图3. MIC测定抗微生物剂为E.大肠杆菌。抗菌素敏感性测试方案（左图）。以氨曲南的MIC计算为例（右图）。用圆圈括起来的字母数字字符表示文本中的相应步骤。

笔记

1.为了加快熔化的琼脂的冷却，密封瓶可以是H Ë手动LD在流动的自来水下而沿着长轴线转动并温和摇动它们短时间成45°角。将瓶子放在水浴中可确保在一段合理的时间后，它们达到设定的55 °C温度（这可以通过放置在水浴中的温度计来确定）。不建议使用较高的温度，因为它会杀死细菌。另一方面，太低的温度将导致琼脂凝固并导致铸型琼脂的表面不平整。

菜谱

注意：通过高压灭菌消毒所有缓冲液和肉汤。
CaCl 2储备溶液
200毫米CaCl 2
MgSO 4储备溶液
100毫米MgSO 4
YT汤
5 g / L酵母提取物
10克/升胰蛋白p
5克/升氯化钠
2毫米CaCl 2
1毫米MgSO 4
溶解除CaCl 2和MgSO 4以外的成分，并用NaOH调节培养基的pH值至7.6。高压灭菌后，从200 mM和100 mM无菌储备溶液中添加CaCl 2和MgSO 4
YPSC肉汤
1克/升酵母提取物
1 g / L蛋白ept
0.5 g / L无水乙酸钠
2毫米CaCl 2
1毫米MgSO 4
溶解除CaCl 2和MgSO 4以外的成分，并用NaOH调节培养基的pH值至7.6。高压灭菌后，从200 mM和100 mM无菌储备溶液中添加CaCl 2和MgSO 4
Ca / Mg / HEPES缓冲液
25 mM HEPES pH 7.6
2毫米CaCl 2
1毫米MgSO 4
底部琼脂
25 mM HEPES pH 7.6
1％琼脂
顶级琼脂
25 mM HEPES pH 7.6
0.6％琼脂
LB琼脂
5 g / L酵母提取物
10克/升胰蛋白p
5克/升氯化钠
1％琼脂

致谢

这项工作得到了DFG-EXC115（法兰克福歌德大学卓越高分子复合群）的资助。EM由德国美因河畔法兰克福的FAZIT基金会提供了一笔津贴。该协议改编自以前的工作（Marine等，2020）。我们感谢Sockett RE教授，Lambert C教授，Milner D教授和他们的研究小组在细菌芽孢杆菌培养方法方面的知识转移。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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