材料和试剂

1.试管（抗生医学玻璃厂，抗生，Ç atalog号：GT-16125），d iameter X升ength：16毫米×125毫米; 容量：18毫升
2.锥形瓶（蜀玻璃厂，富海，Ç atalog号：ZXP-250 ）中，v olume：250毫升
3.土壤基质（山东Luhao农业科技有限公司。ITD ，Luhao ），v olume：50升
4.幼苗锅小号，直径：13厘米（从当地超市购买）
5.毛细管（德拉蒙德，目录号：3-000-203-G / X）
6.离心管小号50毫升（KIRGEN，目录号：KG2821）; 1.5 ml（Axygen ，目录号：MCT-150-C）
7.无菌培养皿ES （Biofound ，目录号： FM-90-G）
8. 48孔细胞培养板小号（康宁，Costar公司，目录号：3548）
9.经组织培养处理的圆形盖玻片（直径8毫米）（Solarbio ，目录号：YA0353-100）
10.蚕豆（蚕豆蚕豆），种子（从当地农贸市场购买）
11. A.蚜株（最初是从云南，中国收集和保存在教授的实验室志强卢在西北农林科技大学）
12.革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌（PAO1，来自西北农林科技大学的沉喜辉博士）；革兰氏阳性菌微球菌（在不停教授的实验室志强卢在西北农林科技大学）
13.氯化钠（广东光华科技Ç O，。大号TD，华达，Ç atalog号：1.01307.040）
14.酵母提取物（Oxoid公司，Ç atalog号：LP0021）
15.胰蛋白胨（Oxoid公司，Ç atalog号：LP0042）
16.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（赛默飞世，Ç atalog号：10010023）
17.琼脂粉（Solarbio ，目录号：9002-18-0）
18. Grace的介质（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：S0146）
19.苯基硫脲（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号：P7629）
20.热灭活的胎牛血清（生物工业Ç atalog号：04-011-1A）
21.大肠杆菌大肠杆菌（K-12）和金黄色葡萄球菌Alexa氟594生物颗粒（Invitrogen公司，ç atalog数小号：E23370和S23372）
22. 4％多聚甲醛（Solarbio ，Ç atalog号：P1110）
23. SF488鬼笔环肽（Solarbio ，Ç atalog号：CA1646）
24.抗褪色试剂（Solarbio ，Ç atalog号：S2100）
25.的Triton X-100（Sigma-Aldrich公司，Ç atalog号码：T8787）
26. Luria-Bertani液体培养基（请参阅食谱）
27. Luria-Bertani琼脂培养基（请参见食谱）
28. 0.85％NaCl溶液（请参阅食谱）
29.血淋巴收集培养基（请参阅食谱）

设备

d issecting钳子（ideal- TEK ，目录号：5.SA）
生长室（宁波江南仪器厂，型号：GXZ-500B）
超冷存储冷冻柜（惠而浦公司，S anyo ，型号：09S338）
制冰机（苏格兰斯科特斯曼制冰系统有限公司，型号：MF36）
层流柜（石横仪器Ë quipment Ç O，LTD，。Dinco ，型号：SW-CJ-2F）
我ncubator（太仓实验设备厂，培英，型号：HZQ-F100）
Eppendorf 生物光度计（Eppendorf，目录号：6133000044）
激光扫描共聚焦显微镜（奥林巴斯，模式l ：FV3000）

软件

ImageJ （NIH，美国马里兰州贝塞斯达）
GraphPad Prism 5.0 （GraphPad，Inc.，拉霍亚，CA，美国）

程序

豌豆蚜重新aring （图1）
将蚕豆种子放入水中吸收2天的水分。
轻轻地除去种子皮。
在装有土壤基质的育苗盆中播种一粒约1厘米深的去皮种子。
种植的种子在生长室在21±1 °C和70±5％相对湿度下在16小时光照（L）：8小时黑暗（D）光周期下。
小号eedlings超过六个叶可以使用。
通过用镊子夹住触角，在每个幼苗上放置十只成年蚜虫，并在生长室中产生后代。
两天后从幼苗中除去成年蚜虫。
如果幼虫在幼苗上饲养了9天，直到它们到达没有翅膀的成虫。
使用这些新近出现的蚜虫成虫进行以下实验。

图1.豌豆蚜虫饲养。将蚕豆种子放入水中以充分吸收水2天（A和B）。植物ø约1cm深度成幼苗锅填满土基质，然后将种子发芽NE去皮种子小号（C）。通过用镊子（D和E）夹住触角，将成年蚜虫放在每棵幼苗上，并使其产生后代s （F）。两天后从幼苗中除去成年蚜虫，九天后若虫长成无翅成虫（G）。

细菌感染
准备Luria-Bertani液体培养基，Luria-Bertani琼脂培养基，0.85％NaCl，并在高压釜中对这些试剂进行灭菌。
划线培养的绿脓杆菌和藤黄微球菌（保持在一个超低温冰箱，在-80 ℃下分别）在Luria-Bertani琼脂糖板在培养箱中在37 ℃下过夜。
将铜绿假单胞菌细菌菌落挑入装有5毫升Luria-Bertani液体培养基，在层流柜中将一个黄褐菌细菌菌落放入装有100毫升Luria-Bertani液体培养基的锥形瓶中。
在37 °C的床温培养箱中以220 r / min的转速培养细菌。
测量在600nm在Eppendorf培养物的吸光度BioPhotometer生物分光光度计直到光密度达到ES approxima tely 1 （图2A）。
通过以8,000 xg离心10分钟收获细胞，然后将沉淀重悬在灭菌的0.85％NaCl溶液中，并通过离心和重悬用0.85％NaCl溶液洗涤细菌3次。
使P. aruginosa悬浮液以2×10 9集落形成单位（CFU）/ ml的（图2B）和藤黄微球菌细胞悬浮液以2×10 10 CFU / ml的。
在冰上或十分钟内麻醉成年蚜虫，并用蘸有细菌悬液或灭菌的0.85％NaCl溶液的毛细管将腹壁刺入约0.5毫米深的蚜虫的血小管中（图s 2C和2D）。

图2.细菌感染。在装有5 ml Luria-Bertani液体培养基的试管中培养铜绿假单胞菌，直到600 nm处的光密度达到大约1（A）。通过离心收获铜绿假单胞菌细胞，并将细胞重悬至2 x 10 9 （CFU）/ ml（B）。用浸入铜绿假单胞菌悬液的毛细管（C和D）穿过腹壁刺入约0.5毫米深的蚜虫的血小管。

血细胞吞噬作用测定
麻醉成年蚜虫在无菌P ETRI二SH在冰上10分钟。
与解剖镊子轻轻取出一个蚜虫腿和与混合血淋巴的液滴5微升含1个Grace的介质降μM苯基硫脲和10％（体积/体积）热灭活的胎牛血清（FBS）。
收集来自20只血淋巴每测试组蚜虫如上述并用2混合收集血淋巴以及微升1mg / ml的的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌Alexa氟594生物颗粒。
执行在5-14步骤操作的黑暗。
将准备好的样品转移到48孔细胞培养板中经组织培养处理的圆形盖玻片（直径8 mm）上。
通过在室温下孵育1小时，使血细胞沉降并粘附。
用200μl血液淋巴收集培养基清洗盖玻片两次。
固定血细胞洗涤10分钟，用200 μl的PBS中的4％多聚甲醛。
洗盖玻片三次（每次10分钟）用200微升PBS 。
透的血细胞用200微升0.1％TRIT上X -100的PBS 10分钟并洗涤TWIC e为200微升PBS（每次10分钟）。
孵育透血细胞用200微升稀释SF488鬼笔环肽按1：200在PBS中1 ħ 。
用200个洗盖玻片微升PBS三次（每次10分钟）。
使用抗褪色试剂（每个盖玻片3μl ）将盖玻片安装在幻灯片上。
观察并采取激光扫描共聚焦microsco下照片PE （图3）。细菌的激发和捕获波长分别为590 nm和617 nm。激发和习得的波长鬼笔环肽分别为495纳米和519纳米。

图3.用SF-488鬼笔环肽（A），大肠杆菌AlexaFluo 594生物颗粒（B）染色的F-肌动蛋白对血细胞的共聚焦图像，以及血细胞和大肠杆菌的覆盖物。比例尺：5μm 。

计算吞噬血细胞中细菌的荧光强度使用ImageJ软件（计算过程如图4所示）。
根据先前的描述（Melcarne et al。，2019b），将吞噬指数（PI）作为血细胞的吞噬能力。

图4.用ImageJ软件计算吞噬血细胞中细菌荧光强度的过程。图像（图像来自图3 B）已加载到ImageJ软件（A）中。圈住吞噬细菌（B），清除血细胞外的细菌（C）。图像类型设置为8位并反转（D）。调整阈值并选择“默认”选项作为“黑白”（黑白）（E）。设置测量值后得到分析结果，IntDen （积分密度）值表示荧光强度（F）。

数据分析

血细胞ph值细胞增生测定的数据分析参考我们最近的文章（Ma等，2020）。在所有观察过程中，激发光的强度和放大倍数均相同。从每盖玻片约二十个不同的视图拍摄的照片被用来计算细菌在吞噬血细胞的荧光强度（计算过程被示出为图4 ）。
PI计算：吞噬的血细胞分数（f ）=荧光阳性门数中的血细胞数/血细胞总数。吞噬指数（PI）= [荧光阳性门中血细胞的平均荧光强度] x f 。每个实验被执行主编三个独立的生物学重复。所有PI数据W¯¯如用GraphPad 5.0绘制。学生牛逼-测试被用来确定其他统计值，分别表示为平均值±SEM。

笔记

轻轻移开豌豆蚜虫的腿，以防止其他组织的连接。
将盖玻片放在细胞培养板的中心。确保收集的所有淋巴液和细菌混合样品都盖上盖玻片，但不要流到细胞培养板壁附近的空隙。

菜谱

Luria-Bertani液体培养基
d issolve 5克的NaCl ，5g的酵母提取物和10g胰蛋白胨1大号的DDH 2 O和混合以及
在高压灭菌器中灭菌培养基
Luria-Bertani琼脂培养基
d issolve 5克的NaCl ，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，15g的琼脂的功率在1大号的DDH 2 O和混合以及
在高压灭菌器中灭菌培养基
0.85％NaCl溶液
D将0.85 g NaCl溶解在100 ml ddH 2 O中，并充分混合并在高压釜中灭菌
血淋巴收集培养基
Grace的培养基含有1μM苯硫脲和10％（vol / vol）热灭活的胎牛血清（FBS）

致谢

该协议改编自Ma等的出版物。（2020）。资金，用于研究W¯¯作为由国家提供中国的赠款自然科学基金（31970467和31772530）和基础研究基金中央高校（Z1090219001）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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