材料和试剂

22 G针
15 ml锥形管（Sarstedt ，目录号：62.554.502）
50 ml锥形管（Sarstedt ，目录号：62.548.004）
血清移液管10 ml（Sarstedt ，目录号：86.1254.001）
25 ml血清移液管（Sarstedt ，目录号：86.1685.001）
组织培养瓶，150 cm 2过滤器（TPP，目录号：90151）
组织培养瓶，75 cm 2过滤器（TPP，目录号：90076）
0.22微米无菌注射器过滤器（Sarstedt的，目录号：831.826.001）
0.1微米无菌注射器过滤器（帕尔生命科学，目录号：4668 ）
20 ml无菌注射器（BD Plastipak，货号：10569215）
玻璃巴斯德移液器（Deltalab ，目录号：702）
伯爵夫人细胞计数室载玻片（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号：C10228）
38.5 ml容量的敞口薄壁超透明管（Beckman Coulter，目录号：344058）
刘易斯和费舍尔大鼠（200克）
台盼蓝（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，货号：C10228）
Alpha MEM（Lonza Bioscience，目录号：BE02-002F ）
带有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基（Lonza Bioscience，目录号：BE12-702F）
胎牛血清（FBS）（EuroClone ，目录号：ECS0180L ）
青霉素-链霉素（10 ，000 U / ml）的（赛默飞世尔科技，Invitrogen公司，目录号：15140122）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号：25200072）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x，不含Ca ++和Mg ++（Cultek ，目录号：BE17-517Q）
灌溉用无菌水，Serrasol溶液（Serra Pamies ，目录号：374561）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：276855）
L-谷氨酰胺溶液（S Sigma -Aldrich，目录号：G7513）
完整的alpha-MEM培养基（请参阅食谱）
冷冻介质（请参见食谱）

设备

-80°C冷冻室
水浴温度设置为37°C（Thermo Fisher Scientific，型号：JP Selecta TM Precisterm 6000141）
冷冻台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Multifuge TM X1）
Countess自动细胞计数仪（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen，目录号：C10281）
DHD空气夹套自动CO 2培养箱（NuAire ，目录号：NU-5510E）
倒置调制对比度显微镜（Leica，型号：DMIRB）
C2200 CBC完整余额（Cobos ，200-20018）
制备型超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima L100XP）
SW32 Ti摆桶式转子套件（Beckman Coulter，目录号：369694）
NanoDrop微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：ND1000）
配备638 nm激光和CCD摄像头的NanoSight仪器（型号F-033）（马尔文，型号LM10）
冷冻电子显微镜（Jeol，型号：JEM 2011）
EMR碳支撑膜在400平方铜的铜板上（EMR，目录号：22-1MC040-100）
流式细胞仪（Becton Dickinson ，生物科学，型号：FACS Canto II）

软件

FlowJo v10软件（BD Bioscience，https： //www.flowjo.com/solutions/flowjo/downloads ）。
Nanosight NTA软件版本3.1（内部版本3.1.46 ）（Malvern Panalytical ，https: //www.malvernpanalytical.com/en/learn/events-and-training/webinars/W150326NanoSightSoftwareRelease ）

程序

间充质干细胞修复
从Lewis和Fisher大鼠的股骨中分离出骨髓MSC（BM-MSC）（200 g）。简而言之，插入一根22 G的针头抽出骨干，并用补充有10％FBS和2 mM EDTA的alpha-MEM冲洗掉，并分离细胞团。将细胞悬浮液在400离心X克为在室温下20分钟。将大鼠BM-MSC接种并在补充有10％FBS的alpha-MEM中扩增（Ramírez-Bajo等人，2020a）。因此，BM-MSC的根据由国际学会细胞治疗（ISCT）（定义标准化的标准进行了表征小号;图1 EE注1）。
使用7 ml完全alpha-MEM培养基在T75 cm 2烧瓶中培养MSC 。胰蛋白酶消化在约80％融合时进行。
用预热的PBS洗涤细胞培养物，添加3 ml胰蛋白酶，并在37°C下孵育4分钟。
用9 ml完全培养基终止反应，并在室温下以600 xg的转速离心5分钟以计数细胞并检查培养的活力。
伯爵MSC的NUM BER以及它们与自动细胞计数制造商的说明书（活力小号EE注2）。
板中的细胞在T150 cm 2的烧瓶中以5 x 10 5个细胞的密度接种，其中装有15 ml完整的alpha-MEM培养基。
在5％CO 2环境中于37°C孵育。
此后每两天更换一次新鲜的完全alpha-MEM培养基（预热至37 °C ）。

图1.通过流式细胞仪和多谱系分化潜能表征MSC的代表性图像。A. MSC的流式细胞仪分析。细胞表面干细胞标记物（CD44，CD29和CD90）呈阳性，内皮细胞（CD31）和造血（CD45）标记呈阴性。B.成脂分化（放大200倍）显示为油红色染色呈阳性。C.成骨分化（放大100倍）表明对碱性磷酸酶活性呈阳性，并通过SigmaFast BCIP / NBT色原染色显示。

电动汽车超速离心分离
当细胞汇合约80％时，吸出上清液并加入6 ml PBS（预热至37 °C）洗涤残留的FBS。再重复一次洗涤步骤。
用15 ml不含FBS的RPMI1640（预热至37°C）代替PBS，并孵育16小时。
收获MSC条件无血清培养基，转移至50 ml锥形管中，并保持在4°C。
胰蛋白酶化MSC和确定下列制造商的说明在自动细胞计数器细胞数和存活力（ř EPEAT步骤A1-A3）。
我们在收集时的估计值为±1 。5 x 10 6个MSC和± 95％的活细胞。
离心机MSC条件无血清培养基中以3,000 ×g离心20分钟，在4℃和微滤液用0.22微米孔径的滤膜以除去细胞碎片和凋亡小体。
将无细胞的上清液转移到容量为38.5 ml的敞顶薄壁超透明管中。10毫克彼此（内平衡相对管小号EE注3-4）。
使用SW32 Ti转子在100,000 xg下超速离心4°C，持续1 h 。
小心地从转子上拆下管子。
用巴斯德吸管小心吸出上清液。
重悬电动汽车粒料用200μl的在-80℃下用于以后使用（冷冻介质和冻结他们的小号EE注5-6）。

电动汽车表征
见注7。
电动汽车量化：
Nanosight跟踪分析（NTA）
粒度分布和浓度测量：
取1 ml EVs溶液（在0.1 µm PBS中稀释系数为1:40过滤）并涡旋。
使用没有针头的注射器，将EVs溶液缓慢注入（避免气泡）到粒度分析仪的腔室中以进行可视化。为了获得准确的浓度和尺寸值（视频1），在视场中大约有20至60个颗粒非常重要。

视频1 。N TA记录的在布朗运动下运动的电动汽车。该视频可视化了电动汽车在被激光光源照射的液体悬浮液中的预期布朗运动。EV的尺寸分布和浓度是通过将光散射特性与布朗运动相结合来测量的。实时监测有助于确定囊泡种群特征的变化。

在60 s内以每秒30帧（fps）的速度获取三次读数，以16的相机水平取景并手动监视温度。图2A显示了NanoSight从MSC生产的电动汽车获得的代表性结果。
蛋白质定量：
按照制造商的说明，使用2 µl EVs溶液，通过NanoDrop检查蛋白浓度（A 280nm ）的确定。
阿通过电子显微镜不存在污染物的ssessment
在400目铜网格上使用多孔碳支撑膜。放光网格，将3 µl EV样品（来自步骤B10）放在柱塞（Leica EM GP）上，并用Whatman No. 1滤纸吸干。
通过快速浸入液态乙烷（-179°C）对悬浮液进行玻璃化，然后将栅格安装在Gatan 626低温转移系统上，然后将其插入显微镜。
使用在200 kV下运行的低温电子显微镜拍摄图像，在GatanUltrascan US1000 CCD相机上记录并使用Digital Micrograph 1.8（每组n = 3）进行分析（图2B-2C）。

图2.通过电子显微镜和纳米粒子跟踪分析（NTA）表征电动汽车。A. NTA测量显示浓度和尺寸分布。EV的平均大小为201.9±101.4 nm。公元前。电动汽车的代表性低温电子显微镜图像（比例尺分别为0.5和0.2 µm）。低温电子显微镜可以观察到具有不规则分布的孔尺寸和形状的栅格，并且在其中具有脂质双层的各种尺寸的电动汽车。白色箭头指向带有双膜的囊泡（白色箭头）。大多数囊泡具有完整的膜和圆形。一些囊泡是单囊，双囊和多层囊，如果囊泡中包含另一个较小或两个或多个囊泡（分别是黑色，蓝色和红色箭头）。

数据分析

通过流式细胞术表征MSC：根据Ramírez-Bajo等人的门控策略，我们使用FlowJo软件对从BD FACS Canto II细胞仪获得的流式细胞数据进行了分析。2020年b 。
Nanosight跟踪分析：使用Nanosight NTA软件版本3.1（内部版本3.1.46）分析数据，将检测阈值设置为5，并将模糊，最小轨道长度和最大跳跃距离设置为自动。
笔记

度Acc奥尔丁至标准化的标准由ISCT的准则定义的MSC必须a）在保持是塑料贴壁标准培养条件下; b）阳性表达的MSC标记物（CD29，CD44和CD90），以及阴性内皮标记物（CD31）和血液造血谱系（CD45）标记物；c）保留多能表型，并具有在标准分化条件下在成脂和成骨谱系中分化的能力（图1B-1C）。
2018年，国际细胞外囊泡协会（ISEV）发布并更新了MISEV2014指南，并提出了不同的建议，以提高已发表的EVs结果的可重复性。ISEV清单总结了电动汽车科学应遵循的主要方面（Lotvall等，2014）。
ISEV检查表的强制要求是在收集时（或在播种时加上收集时的估计）估算每毫升或/表面积的细胞数和活/死细胞的百分比。
为了保持电动汽车的无菌性：首先，必须用乙醇清洁水桶，并在引擎盖中晾干。其次，还必须在机罩中将水管从水桶中插入或取出。
平衡桶内的重量。薄壁管需要装满，以便在铲斗中提供管壁支撑。如果音量太低，则可能会崩溃。由于这个原因，重要的是要用上清液填充试管或添加0.1 µm无菌过滤的PBS 。
根据贝克曼的建议，使用SW32 Ti要求平衡水管的重量和铲斗的重量：https : //www.beckman.com/resources/fundamentals/principles-of-centrifugation/balancing-your-rotor。
为了重悬EV颗粒，您必须使用200μl移液管上下吸移，但不要太粗，因为最好避免产生气泡。
电动汽车可在4°C下保存2天。建议将样品长时间保存在-80°C下。
根据ISEV的建议，它需要至少使用2种方法进行定量。在我们的案例中，我们通过Nanosight确定了颗粒数，并通过NanoDrop分光光度计确定了蛋白质计数。这些结果必须表示为单位体积的初始液体或产生细胞的数量。

菜谱

完整的alpha-MEM培养基
阿尔法-MEM
10％FBS
1x L-谷氨酰胺
1x P / S
过滤器将溶液消毒并储存在4°C
冷冻介质
RPMI 1640
1％二甲基亚砜
过滤器将溶液消毒并储存在4°C
注意：过滤器使用20毫升的所有溶液注射器和0.22 μ米过滤到一个新的无菌管中。

致谢

这项研究由来自研究经费被部分资助皇家社会埃斯帕诺拉德Nefrología （2014年，JC），Redes公司Temáticas德Investigación COOPERATIVA恩每期，REDINREN（RD12 / 0021/0028和RD16 / 0009/0023）通过共同出资ISCIIISubdirección一般德Evaluación和丰多欧洲人德DESARROLLO区域（FEDER）“尤娜MANERA德hacer欧罗巴”和Secretaria D'Universitats我Recerca和CERCA计划德尔Departament D'Economia我Coneixement德拉Generalitat德加泰罗尼亚（2017年-SGR-1331）。这项工作已开发的背景下AdvanceCat的支持飞来的;（加泰罗尼亚贸易和投资Generalitat德加泰罗尼亚加泰罗尼亚ERDF操作程序（欧洲区域发展基金）2014-2020下）。这项工作已在该中心德开发Recerca生物医药左旋，巴塞罗那，西班牙。我们的协议基于Herrera等人先前描述的协议。（2010年）

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

伦理

从Lewis和Fisher大鼠的股骨（200g）中分离出骨髓-MSC （Ramírez-Bajo等人，2020b ）。钍é研究是根据当地动物伦理委员会（指导原则批准，并进行科米特客位D'Experimentació动物，CEEA，Decret 97分之214，加泰罗尼亚，西班牙）。

参考文献

Azmi，AS，Bao，B.和Sarkar，FH（2013）。外来体在癌症发展，转移和耐药中的作用：全面综述。癌症转移Rev 32（3-4）：623-642。
Balaj ，L.，Lessard，R.，Dai，L.，Cho，YJ，Pomeroy，SL，Breakefield ，XO和Skog，J.（2011）。肿瘤微泡包含反转录转座子元件和扩增的癌基因序列。Nat Commun 2：180。
缪，A.，鲟鱼，C.，Siatskas ，M.，费雷尔，K.，McIntosh的，K.，帕蒂尔，S.，哈迪，W.，迪瓦恩，S.，Ucker ，D.，院长，R.， Moseley，A.和Hoffman，R.（2002）。间充质干细胞在体外抑制淋巴细胞增殖，并延长体内皮肤移植存活率。Exp Hematol 30（1）：42-48。
Ben-Ami，E.，Miller，A. and Berrih-Aknin ，S.（2014年）。自身免疫患者的T细胞显示间充质干细胞对免疫调节的敏感性降低：IL-2的作用。自身免疫Rev 13（2）：187-196。
Bruno，S.，Grange，C.，Deregibus，MC，Calogero，RA，Saviozzi，S.，Collino，F.，Morando，L.，Busca，A.，Falda，M.，Bussolati，B.，Tetta， C.和Camussi，G.（2009）。间充质干细胞来源的微泡可防止急性肾小管损伤。J Am Soc Nephrol 20（5）：1053-1067。
Camussi ，G.，Deregibus ，MC，布鲁诺，S.，Cantaluppi ，V。和Biancone ，L。（2010一）。外泌体/微泡作为细胞间通讯的机制。肾脏国际杂志78（9）：838-848。
Camussi ，G.，Deregibus ，MC和哲太，C。（2010 b ）。干细胞的旁分泌/内分泌机制对肾脏的修复：微囊泡介导的遗传信息传递的作用。Curr Opin Nephrol Hypertens 19（1）：7-12。
Ebrahimi，B.，Eirin ，A.，Li，Z.，Zhu，XY，Zhang，X.，Lerman ，A.，Textor ，SC和Lerman ，LO（2013）。猪动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的血运重建后，间充质干细胞改善了髓质炎症和纤维化。PLoS One 8（7）：e67474。
Fevrier ，B。和Raposo ，G。（2004）。外泌体：内体来源的囊泡传递细胞外信息。Curr Opin Cell Biol 16（4）：415-421。
Grange，C.，Bellucci，L.，Bussolati ，B.和Ranghino ，A.（2020年）。细胞外囊泡在固体器官移植中的潜在应用。单元格9（2）。
Gregorini，M.，Corradetti ，V.，Pattonieri ，EF，Rocca，C.，Milanesi ，S.，Peloso ，A.，Canevari ，S.，De Cecco ，L.，Dugo ，M.，Avanzini ，MA，Mantelli ，M.，Maestri ，M.，Esposito，P.，Bruno，S.，Libetta ，C.，Dal Canton，A. and Rampino ，T.（2017年）。间充质基质细胞/细胞外小泡灌注离体大鼠肾脏可预防缺血性损伤。细胞生物学杂志21（12）：3381-3393。
Guescini ，M.，Guidolin ，D.，Vallorani ，L.，Casadei ，L.，Gioacchini ，AM，Tibollo ，P.，Battistelli ，M.，Falcieri ，E.，Battistin ，L.，Agnati ，LF和Stocchi ，五（2010）。C2C12成肌细胞释放微囊泡，其中包含与信号转导有关的mtDNA和蛋白质。Exp Cell Res 316（12）：1977-1984。
Harding，C.，Heuser，J。和Stahl，P。（1984）。大鼠网织细胞中转铁蛋白和胶体金转铁蛋白的胞吞作用和胞内加工：受体脱落途径的证明。Eur J Cell Biol 35（2）：256-263。
Herrera的，MB，Fonsato ，V.，加蒂，S.，Deregibus ，MC，索尔迪，A.，坎塔雷拉，D.，卡洛杰罗，R.，Bussolati ，B.，哲太，C。和Camussi ，G.（2010）。人肝干细胞来源的微泡可促进肝切除大鼠的肝再生。J Cell Mol Med 14（6B）：1605-1618。
Koch，M.，Lemke，A.和Lange，C.（2015年）。在MHC不同的大鼠模型中，来自MSC的细胞外囊泡调节对同种异体肾的免疫反应。干细胞诠释2015：486141。
Konoshenko ，MY，Lekchnov ，EA，Vlassov ，AV和Laktionov ，PP（2018）。细胞外囊泡的分离：一般方法和最新趋势。生物医学研究报2018：8545347。
Kunter ，U.，荣，S.，莽汉，P.，Eitner ，F.，Muller-尼文，G.，Djuric的，Z.，面包车Roeyen ，CR，Konieczny，A.，Ostendorf，T.，别墅，L ，Milovanceva-Popovska ，M.，Kerjaschki ，D。和Floege ，J。（2007）。间充质干细胞可预防进行性实验性肾衰竭，但会分化为肾小球脂肪细胞。J Am Soc Nephrol 18（6）：1754-1764。
Lotvall ，J.，Hill，AF，Hochberg，F.，Buzas ，EI，Di Vizio ，D.，Gardiner，C.，Gho ，YS，Kurochkin ，IV，Mathivanan ，S.，Quesenberry ，P.，Sahoo，S 。，Tahara ，H.，Wauben ，MH，Witwer，KW and Thery ，C.（2014年）。定义细胞外囊泡及其功能的最低实验要求：国际细胞外囊泡学会的立场声明。J Extracell囊泡3：26913。
Mittelbrunn ，M.，Gutierrez-Vazquez，C.，Villarroya-Beltri ，C.，Gonzalez，S.，Sanchez-Cabo，F.，Gonzalez，MA，Bernad ，A.和Sanchez-Madrid，F.（2011）。载有microRNA的外来体从T细胞单向转移至抗原呈递细胞。Nat Commun 2：282。
魔门-Heravi ，F.，巴拉伊，L.，阿莲，S.，曼特尔，PY，哈勒克，AE，特拉亨伯格，AJ，索里亚，CE，Oquin ，S.，Bonebreak ，CM，拉科格鲁，E.，斯科格，J以及郭，WP（2013年）。当前用于分离细胞外囊泡的方法。生物化学394（10）：1253-1262。
拉米雷斯-巴霍，MJ，马丁Ramírez的，J.，布鲁诺，S.，帕斯魁诺，C.，巴侬-Maneus ，E.，罗维拉，J.，Moya-鲁尔房屋，D.，拉索-Rodriguez，M.，Campistol ，JM，Camussi ，G.和狄克曼，F。（2020一）。间充质基质细胞及其胞外囊泡在慢性环孢菌素肾毒性小鼠模型中的肾保护潜力。前沿细胞生物学杂志8：296。
Ramírez-Bajo ，MJ，Rovira ，J.，Lazo -Rodriguez，M.，Banon-Maneus ，E.，Tubita ，V.，Moya- Rull ，D.，Hierro- Garcia，N.，Ventura-Aguiar，P. ，奥本海默，F.，Campistol ，JM和狄克曼，F。（2020 b ）。间充质基质细胞及其细胞外囊泡在肾脏排斥反应大鼠模型中的影响。前细胞发育生物学8：10 。
Ratajczak ，J.，Wysoczynski ，M.，Hayek，F.，Janowska-Wieczorek ，A。和Ratajczak ，MZ（2006）。膜来源的微囊泡：细胞间通讯的重要和未被充分认识的介体。白血病20（9）：1487-1495。
Rigo ，F.，De Stefano，N.，Navarro- Tableros ，V.，David，E.，Rizza，G.，Catalano，G.，Gilbo ，N.，Maione ，F.，Gonella ，F.，Roggio， D.，Martini，S.，Patrono ，D.，Salizzoni ，M.，Camussi ，G. and Romagnoli ，R.（2018年）。来自人肝干细胞的细胞外囊泡可降低体内常温低氧大鼠肝灌注模型的损伤。移植102（5）：e205-e210。
Stone，ML，Zhao，Y.，Robert Smith，J.，Weiss，ML，Kron，IL，Laubach，VE和Sharma，AK（2017）。间充质基质细胞衍生的细胞外囊泡减轻了肺缺血-再灌注损伤，并增强了循环死亡后供体肺的修复。呼吸研究18（1）：212。
Thery ，C.，Witwer，KW，Aikawa ，E.，Alcaraz，MJ，Anderson，JD，Andriantsitohaina ，R.，Antoniou，A.，阿拉伯，T.，Archer，F.，Atkin-Smith，GK等。（2018）。研究细胞外囊泡2018（MISEV2018）的最少信息：国际细胞外囊泡学会的立场声明和MISEV2014指南的更新。J Extracell囊泡7（1）：1535750。
Thery ，C.，Zitvogel ，L。和Amigorena，S。（2002）。外泌体：组成，生物发生和功能。Nat Rev Immunol 2（8）：569-579。
Togel ，F.，Hu，Z.，Weiss，K.，Isaac，J.，Lange，C。和Westenfelder ，C。（2005）。使用间充质干细胞可通过独立于分化的机制预防缺血性急性肾衰竭。Am J生理学肾脏生理学289（1）：F31-42。
Valadi ，H.，Ekstrom ，K.，Bossios ，A.，Sjostrand ，M.，Lee，JJ和Lotvall ，JO（2007）。外来体介导的mRNA和microRNA的转移是细胞之间遗传交换的新机制。Nat Cell Biol 9（6）：654-659。
Wang，Y.，Han，ZB，Song，YP and Han，ZC（2012）。间充质干细胞在临床上的安全性。干细胞国际2012：652034。