材料和试剂
1. 2 x 96孔板，透明聚苯乙烯，平底，未处理（JETbiofil ，中国，目录号：TCP001096）
2. 1.5毫升塑料管
3. LB琼脂平板，300μg / ml羧苄青霉素
4.八通道移液器水库
5.带有pMRP9-1质粒（抗羧苄青霉素，组成型GFP mut2 ）的铜绿假单胞菌PAO1
6. d È离子水
7.魅力红AC粉末（Sigma，目录号：458848）
8.结晶紫粉末（Sigma ，目录号：C6158-100G）
9.乙酸（西格玛，目录号：27225-500ML-R）
10.魅力红AC溶液（请参阅食谱）
11. NaCl溶液（请参阅食谱）
12. M9中号（请参阅食谱）
13.结晶紫（请参阅食谱）
14.乙酸30％v / v（请参阅食谱）

设备

摇床培养箱
微量离心机
多通道移液器
多模式读板仪（Synergy HT ，美国Biotek ）

软件

Gen5（读板器软件）

程序

细菌培养
接种FR澳升股票培养的细菌（例如GFP标记的PA01）到LB-羧苄青霉素板上，并培育24小时，在37℃。
挑从一个菌落的板和接种的锥形烧瓶中，将含有50ml M9培养基中，0.4％葡萄糖，200微克/毫升羧苄青霉素。
我在37°C，120 RPM，1 6 h下孵育。

细菌粘附动力学和动力学测量的准备
P根据使用下表repare板（第一6列）的NaCl溶液，脱-离子水，8通道移液器和水库，50微升体积每孔。当添加细菌培养物时，这些浓度将减半。
注意：不建议使用大于500 mM的最终盐浓度，因为这会导致染料聚集。

表1 。P在各种盐浓度实验细菌粘附晚计划

氯化钠[ mM ]

800

400

200

100

50

0

＃

1个

2

3

4

5

6

一种

乙

C

d

Ë

F

G

H（空白）

到984微升d的ë -离子水，添加16微升的诱惑红AC溶液。P IPET 50微升每孔到孔排H 1-6，这些以及将作为空白。
转移的PAO1培养成12 X 1.5毫升microcentrifuges （每管1.5毫升），一旦离心机来分离培养物（5000 ×g离心，1分钟，25 ℃下）。每个重悬在颗粒的去500ul的-离子水。将重悬的细菌转移到18毫米玻璃试管中。
注意：细菌粘附行为是由实现长潜伏期小号在d ë -离子水，从而最大限度地减少细菌是在水中的时间量是重要的。

打开读板器，输入以下协议：温度，25 °C，启动动力学（60分钟，每30 s读取一次），读取参数：荧光（激发485 / 20nm，发射528 / 20nm，底部，增益60）。验证方案并开始阅读，以使灯加热（180 s），但尚未启动动力学。
注意：如果要同时观察培养密度和粘附力，可以测量OD 650nm，以避免染料在600nm处吸收。该读数值对应于OD 600nm测量值的80％。培养密度数据很有趣（在该实验中，粘附培养密度之间存在反相关关系，因为附着的细菌对OD 650nm处的光密度贡献较小）。乙UT这些测量应谨慎地解释，因为细菌聚集，例如，将显着提高的光密度。如果选择合并OD 650nm读数，则将读数频率设置为每1分钟1次测量。

使用新板，通过向多滴定板的A1孔中添加100μl培养物，并用空白读数读取OD 600nm ，确定培养物密度。
添加所需的量d ë -离子化水和染料，以制备6毫升细菌培养物OD 600nm处= 0.1，1.6染料浓度毫克/毫升（见表2进行计算的例子）

表2.计算示例。

外径600nm

0.5

空白

0.04

OD 600nm –空白

0.46

稀释因子=（OD 600nm的-空白）/0.1

4.6

总体积（m l ）= n ×稀释倍数，使总体积> 6 mL

9.2（n = 2）

培养体积= n （ml ）

2

染料+水量=总体积（mL）-n （ml ）

7.2

染料溶液（Allura红AC，100 mg / ml）每毫升总体积16 µL

147 .2

水体积（米升）= +染料水的体积（米升） -染料体积（米升）

7.1

使用多通道移液器将50μl细菌悬液（用染料稀释）添加到AG行1-6孔中。
注：附着力动力学快，尽量以完成移液尽可能快，在30秒左右，否则你将失去大量的数据。

将板装载到板读取器上并开始动力学。

注意：B缺乏板通常用于荧光，以防止孔之间的串扰。在该方法的情况下呈现的这里，读取荧光是从相邻的底部的浅层发射阱，消除串扰它源于光行进斜Ť ħ粗糙壁进入相邻井，类似于由黑色侧消除串扰的盘子。

动力学后准备和动力学后
而在板读取器运行的动力学程序，在多通道混合将12ml 0.8毫克/毫升的染料溶液移液器贮存器。该溶液将用于在没有未附着细菌的情况下读取附着细菌的荧光，作为动力学测量的对照。
当该动态测量结束时，使用移液器轻轻从所有孔中除去液体。
向每个孔中添加100μl的0.8 mg / ml染料溶液，并使用相同的参数（不是动力学）再次读取荧光。
注意：确保在最短的时间内保持空孔，GFP在高氧气浓度下会成熟，如果放置太久会导致荧光急剧增加。

任选的步骤：P根据对同一样品erform结晶紫染色2011奥图尔。
将动力学和动力学后的读取结果导出到Excel，根据处理进行分类和平均，计算标准偏差，图形。

数据分析

图1.在几种盐浓度下的铜绿假单胞菌黏附动力学（改编自Shteindel等人，201 9 ），每条虚线表示在不同盐浓度下的黏附，符号代表测量时间，侧面曲线代表± 1SD，n = 7每次治疗。

注意：此数据集的适当统计检验是重复测量单向方差分析。六种治疗方法中的六十个测量点由于在多个测试中重复使用数据而导致严重的重大损失，从而使其无法使用。允许使用参数测试的此数据集的规范化也并非无关紧要。在大多数动力学过程中，代表不同处理的曲线被几个标准偏差隔开，即，组之间的差异大于组内差异，因此具有统计上的显着性。

细菌粘附通常由DELVO模型描述，预测在低盐和高盐浓度下的粘附力较低，而在中值浓度下则具有高粘附力（Hermansson ，1999）。在不同盐浓度下最后一个时间点的粘附力与该描述一致，但是动力学数据揭示了在单个测量中未捕获的细节。虽然100和200 mM的盐浓度在一小时后会产生相似的粘附效果，但100 mM的粘附动力学高于200 mM的粘附动力学。类似地，在实验结束时，400和0 mM的盐浓度会产生可比的附着力，但是在400 mM的处理中会看到更高的动力学。

为了验证该测试可以测量粘附细菌，而不是平板底部附近的未附着细菌或沉积细菌，我们引入了动力学后测量。在此测量中，我们除去每个孔中的液体，并用无菌缓冲液代替，除去绝大多数未附着的细菌，并稀释所有剩余的未附着的细胞。预形成第二个底部荧光读数，使我们能够评估在最后一个动力学时间点源自附着细菌的荧光分数。后动力学值实际上是相同的，这表明在最后一个时间点读取的所有荧光均源自附着的细菌（图2）。唯一使用的统计数据是使用Excel自动功能计算的Pearson相关性。

图2.每个数据点的最后一个动力学时间点荧光VS后动力学荧光（改编自Shteindel等人，201 9 ）n = 7，误差线代表± 1SD。

为了将这种方法与更传统的方法进行比较，在进行动态动力学读数后，对同一样品进行了结晶紫染色（图3）。结晶紫的结果显示出相同的基本效果，但由于该方法的灵敏度较低，因此误差较高。

图3.动态荧光对比结晶紫染色（改编自Shteindel等人，201 9 ），每个数据点的n = 7，误差线代表± 1SD。

菜谱

诱惑红AC解决方案
在1.5毫升塑料管中计量约100毫克粉末
每毫克粉末添加10μl用于附着力实验的培养基
不要通过移液混合，使用涡流，混合直至完全溶解
氯化钠溶液
添加2.338克的氯化钠到50ml d的ë -离子水，混合直至溶解

M9中号
根据thelabrat.com制备，在100毫升锥形瓶中加入0.4％葡萄糖，200微克/毫升羧苄青霉素50毫升

水晶紫
将50毫克的结晶紫粉末添加到50毫升的塑料试管中
密封试管，涡旋直至溶解
醋酸30％v / v（用于结晶紫染色）
在化学通风橱量度在50ml塑料试管15ml乙酸并加入35毫升d的ë -离子水

致谢

Ť他协议适于从Shteindel等。，2019 。

利益争夺

此协议没有任何利益冲突，无论是财务利益还是其他利益。

参考文献

Abadian ，PN和Goluch ，ED（2015）。表面等离振子共振成像（SPRi）用于细菌附着在表面涂层上的多重评估。分析方法7（1）：115-122。
Fletcher，M。（1977）。培养物浓度，年龄，时间和温度对细菌附着在聚苯乙烯上的影响。可微生物学杂志23（1）：1-6。
乔治亚州奥图尔（2011）。微量滴定盘生物膜形成测定。J Vis Exp （47）：e2437 。
Shteindel ，N.，Yankelev ，D.和Gerchman ，Y.（2019）。高通量定量测量细菌附着动力学的时间单位为秒。微型B ECOL 77（3）：726-735。
Vadillo -Rodríguez ，五，Busscher ，HJ，Norde ，W.，德弗里斯，J.和van der梅，HC（2004年）。微生物链球菌菌株在表面上的宏观和微观粘附之间的关系。微生物学150（Pt 4）：1015-1022。
Funari ，R.，Bhalla ，N.，Chu，KY，Soderstrom ，B.和Shen，AQ（2018）。纳米等离子体用于实时和无标签监测微生物生物膜的形成。ACS传感器3（8）：1499-1509。
Hermansson ，M。（1999）。微生物黏附的DLVO理论。胶体小号URF乙生物界面14（1-4）：105-119。