材料和试剂

BD TM结核菌素注射器，1毫升（Becton Dickinson，目录号：309659）
Kimwipes 1层（Fisher，目录号：06-666）
1.5 ml微量离心管（Sarstedt ，目录号：72.690.300）
一次性试管，13 x 100 mm（VWR，目录号：47729-572）
GC样品瓶，2毫升（Thermo Scientific，目录号：C4000-1）
螺帽（安捷伦;目录号：5182-0717）
巴斯德吸管（Fisher，目录号：13-678-20A和13-678-20C）
微型毛细管移液器（Kimble，目录号：71900-20）
假单胞菌丁香表达avrRpt2 （芭芭拉博士昆克华盛顿的礼物在圣路易斯大学）
拟南芥生态型Col-0和突变ald1植物
液氮（美国焊接与天然气公司，22 Psi）
六水合氯化镁（Fisher，目录号：BP214-500）
乙腈（ACROS，目录号：26827-0040）
盐酸（36.5-38％w / w，约12 N，Fi sher，目录号：A144-212）
！注意：试剂具有腐蚀性和挥发性；戴上防护手套并在通风橱中操作。
L-Norvaline（ACROS，目录号：6600-40-4）
L-哌康酸（TCI，目录号：P1404）
氢氧化钠（Fisher，目录号：BP359-500）
甲醇（Fisher，目录号：A452-4）
吡啶（EMD Millipore，PX2020-6）
氯甲酸丙酯（Beantown Chemical，目录号：133200-100G）
注意：该试剂剧毒，易挥发，易燃且具有腐蚀性，应在通风橱中处理。存放在4℃下在含有一些硫酸钙干燥剂（DRIERITE）一个封闭的罐中。
无水硫酸钙干燥剂（WA Hammond DRIERITE Company LTD，目录号：13005），用于存储氯甲酸丙酯
氯仿（EMD密理博，目录号：CX1058-1）
注意：该试剂有毒，易挥发，应在通风橱中处理。
碳酸氢钠（Fisher，目录号：BP328-1）
无水硫酸钠（Fisher，目录号：S-421）
10mM氯化镁（小号EE配方小号）
提取缓冲液（见配方小号）
内部标准（见配方小号）
1M氢氧化钠（见配方小号）
50碳酸氢钠毫钠（见配方小号）

设备

塑料杵（Axygen Scientific，目录号：PES15BSI）
Milli-Q Advantage A10净水系统（EMD Millipore，型号：Z00Q0V0WW）
高压灭菌器（综合蒸馏器和消毒器，型号：SSR3APB）
剪刀（港口货运工具，货号：62458）
天平（梅特勒-托利多，型号：AT261）
台式杜瓦瓶（Thermo Scientific，目录号：10-194-100B）
带Styroform平台的Vortexer （Labnet ，型号：S0100）
台式离心机（Eppendorf，型号：5417C），用于离心微量离心管
派克Source TriGas Generator（派克汉尼ni （Parker Hannifin），型号：LCMS-5000NA，压缩机型号：SF120872PH）
顶板摇臂离心机（粘土亚当斯，米Odel等：DYNAC 0101），用于离心的一次性试管
胶乳灯泡，将2ml（VWR，目录号：82024-554）
气相色谱质谱仪（GC-MS）（Agilent，型号：7890A-5977）
GC色谱柱，HP-5MS（Agilent，目录号：19091J-413）
用于GC-MS的计算机（Dell，型号：3430）
手动GC进样针，5 µl（汉密尔顿，目录号：87993）

软件

MassHunter工作站，用于定性和定量分析（安捷伦，软件版本：10.0）
增强的MassHunter工作站，用于数据采集（安捷伦，软件版本：10.0）
MS光谱库（NIST）

程序

设备设置
气相色谱仪（GC）的设置
色谱：使用30米毛细管HP-5MS色谱柱进行色谱。在14 psi的恒定压力下使用氦气作为载气。将进样口温度设置为240°C，并将传输线温度设置为280°C。样品以不分流模式运行。使用以下温度程序进行色谱分析，如表1所示。
表1.用于分析正缬氨酸和胡椒酸的GC温度
时间间隔
温度梯度
0-1分钟
70 °摄氏度
1-19分钟
70-260 °C （10 °C / min斜坡）
19-21分钟
260 °摄氏度

质谱仪（MS）设置
根据制造商的说明自动调整仪器。

样品制备和分析
用于病原体检测中，最大的三片叶子约4周小号旧植物渗透有任一的10mM的MgCl 2或病原体假单胞菌丁香avrRpt2使用无针注射器从叶的远轴侧。叶片浸润后，用Kimwipes除去过量的10 mM MgCl 2液滴或病原体悬浮液。图2显示了病原体刚刚浸入后的一株拟南芥生态型Columbia-0植物（图2）。

图2 。的一种图象拟南芥与渗透之后生态型Col-0植物Pseudomonos丁香表达avrRpt2 。浸润的叶子用白色标记标记。（请标记白色标记）

大约24小时后，收集〜100 mg浸润的叶子组织。用一把剪刀将整片叶子取样。
用精确到1 mg位数的天平称重组织。记录每个样品的重量。关键步骤
将组织放入微量离心管中，盖上管，然后将其放入液氮桶中。冷冻的组织可以无限期保存在-80°C。•暂停点
用塑料杵研磨组织。
在融化组织之前，继续进行下一步。关键步骤
加入400 µl提取缓冲液。
加入20 µl内标。
在室温下在涡旋仪上剧烈摇动15分钟。
以18,000 x g离心5分钟。
将上清液转移到13 x 100 mm玻璃试管中。提取物可以无限期储存在-80°C。•暂停点
用氮气流干燥上清液。干燥的提取物可以无限期保存在-80°C下。•暂停点
加入200 µl 1 M氢氧化钠。
加入167 µl甲醇和34 µl吡啶。
剧烈涡旋并用巴斯德吸管将所有颗粒破碎。
加入20 µl氯甲酸丙酯，剧烈涡旋30 s。使用玻璃微毛细管移液器代替塑料移液器吸头，以免污染增塑剂。关键步骤
再加入20微升氯甲酸丙酯，剧烈涡旋30秒钟。
加入400 µl氯仿并剧烈涡旋10秒钟。
加入400 µl碳酸氢钠（50 mM ）并剧烈涡旋10 s。
在约80％的速度离心分离2分钟，用台式摇臂离心机（约1 ，2 50 X克）。
用巴斯德吸管将下层转移到新的13 x 100 mm玻璃试管中。转移后得到的下层相约为0.375ml。
通过将约40微升无水硫酸钠干燥氯仿萃取物硫酸盐和涡旋直至澄清。
在约80％的速度离心1分钟用台式摇臂离心机（约1 ，250 X克）。
用巴斯德吸管将氯仿提取物转移到GC样品瓶中。
将0.5-1 µl进样到GC / MS中，以使用选择性离子监测模式（SIM）使用定量离子158和170以及定量离子72和128进行分析。

来自标准化合物分析的GC-MS数据
图3显示了在扫描模式下运行的总离子流色谱图（图3A）和正缬氨酸的相应质谱图（图3B左图）和Pip（图3B右图）。

图3.使用扫描模式对正缬氨酸（NV）和胡椒酸（Pip）进行GC-MS分析。（A ）按B所述，使用扫描模式，用氯甲酸丙酯衍生化的等重量（各2 µg）L-正缬氨酸（NV）和L-哌酸（Pip）混合物的GC-MS总离子色谱图。L-正缬氨酸，N-丙氧羰基，丙酯（8.2分钟）和L-哌酸，N-丙氧羰基，丙酯（9.9分钟）是两个主要峰。底部面板（B ）显示了NV-和Pip-N-丙氧基羰基丙基酯的质谱。的损失丙组产生主要离子小号从匹衍生物从NV 158和170。

图4显示了使用选择性离子监测（SIM）模式从标准化合物分析得到的GC-MS数据。根据图1所示的质谱图，每种化合物的两个主要离子用于在SIM模式下监测NV（158和72）和Pip（170、128）。

图4 。用选择性离子监测（SIM ）模式进行正缬氨酸（NV ）和胡椒酸（Pip ）的GC-MS分析。（A ）使用SIM模式，按B中所述，用氯甲酸丙酯衍生化的等重量的NV和Pip混合物的等重量（各2 µg）混合物的GC-MS总离子色谱图。NV-（在8.2分钟时）和Pip-N-丙氧羰基丙基酯（在9.9分钟时）是两个主要峰。底部（B ）显示了在SIM模式下为主要离子158.2和72.2（NV）以及172.2和128.0（Pip）选择的NV-和Pip-N-丙氧基羰基丙基酯的质谱图。每个离子的停留时间设置为25 ms 。SIM模式设置为在7.4-9.1分钟的时间间隔内监视离子158和72，从9.1-10.5分钟开始监视离子170和128。SIM和扫描模式下监测的主要离子和定性离子的相对丰度相似。

拟南芥叶片组织中的点水平
对于GC-MS数据pipecoli Ç从酸分析拟南芥使用扫描（图5）和SIM（图6）模式的叶组织样品。

图5 。使用扫描模式分析从Col-0和ald1植物制备的提取物的GC-MS分析。（甲）总离子chromatogra米模拟的S（10毫摩尔MgCl 2 ） -和病原体（假单胞菌丁香表达avrRpt2 ）接种野生型Col-0中和突变ALD1植物。在处理后24小时对叶片组织进行采样，并按照步骤B中所述将NV（2 µg）用作内标。病原体感染后ald1植物没有积累Pip。底部（B ）显示了NV-和Pip-N-丙氧羰基丙基酯的MS光谱。

图6.使用SIM模式分析从Col-0和ald1植物制备的提取物的GC-MS分析。（A）章romatogra米小号模拟的（10毫摩尔MgCl 2 ） -和病原体（假单胞菌丁香表达avrRpt2 ）接种野生型Col-0中和突变ALD1植物。在处理后24小时对叶片组织进行采样，并按照步骤B中所述将NV（2 µg）用作内标。病原体感染后ald1植物没有积累Pip。底部（B ）显示了在SIM模式下为主要离子158.2和72.2（NV）以及172.2和128.0（Pip）选择的NV-和Pip-N-丙氧基羰基丙基酯的MS光谱。

Col-0和ald1植物中的相对点水平。
图7显示了用模拟物或病原体接种的Col-0和ald1植物中的相对Pi p水平。与模拟接种的植物相比，接种病原体的野生型植物积累的Pip水平高约18倍。与野生型植物相比，ald1积累的病原体感染后基础蛋白水平降低，并且未显示出任何蛋白水平的提高。

图7.在匹水平拟南芥野生型Col-0中和匹缺陷ALD1植物后用模拟（10毫摩尔MgCl接种的24小时2 ）或病原体（P.丁香表达avrRpt2 ）。在10 mM MgCl 2中用10 5 CFU ml -1接种植物。误差线表示标准偏差（n = 3），斜线表示统计显着性（P > 0.001）。

数据分析

MassHunter工作站10.0用于定性和定量数据分析。定量和定性离子之间的离子比率瓦特ERE用作额外的措施，以使用SIM模式下的分析物的访问适当的标识。胡椒酸水平是根据使用不同浓度的NV和P ip标样生成的标准曲线计算得出的。
使用Student t检验进行统计分析。对于病原体测定，在单个实验中分析了约16种植物/基因型/处理。接种至少4个技术重复/基因型/处理。为了进行代谢物定量，每个实验中分析了约12种植物/基因型/处理。用一组不同的植物重复实验至少2-3次。除非另有说明，否则误差条表示SD。

笔记

该协议具有节目ñ良好的重现性和被用于分析在我们最近的研究报告了许多拔牙（王等，2018;廉等人，2020年）。

菜谱

1. 10毫米氯化镁
称重20.33 g六水合氯化镁，将其溶于Milli-Q水中至最终体积100 ml，以获得1 M MgCl 2
高压釜的1M的MgCl 2连同1升的纯水，在121 -Q水℃下30分钟使用液体循环
该解决方案已经冷却至室温后，取1毫升的1M氯化镁的2和添加它到99毫升高压灭菌的Milli-Q水，搅拌均匀，得到10毫摩尔MgCl 2
2.提取缓冲液
将8.33 ml浓盐酸添加到91.67 ml Milli-Q水中，并充分混合以获得1 N HCl
取1 ml的1 N HCl，将其添加到99 ml的Milli-Q水中，充分混合以获得0.01 N HCl
将25 ml乙腈与75 ml 0.01 N HCl混合，并使用该溶液作为提取缓冲液
3.内部标准
在Milli -Q水中制备100 ng / µl正缬氨酸（wt / vol ）
4. 1 N氢氧化钠
称取40克NaOH颗粒和溶解它在Milli-Q水中至100ml的最终体积，以获得10 Ñ的NaOH，然后稀释用Milli-Q水10倍
5. 50 mM碳酸氢钠
称量420 mg NaHCO 3并将其溶于Milli-Q水中至最终体积为100 ml

致谢

这项工作得到了美国国家科学基金会（MCB＃0421914和IOS＃051909），肯塔基州科学与工程基金会（＃1244）和肯塔基州大豆局（3084113467）的资助。感谢John Johnson的技术帮助。该协议改编自先前的工作（Villas-boas等，2003； Kugler等，2006）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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