材料和试剂

1.普通的显微镜载玻片25毫米×75毫米（例如，Sigma，目录号：S8902）
2.塑料石蜡或实验室膜（石蜡膜® ，比米斯公司，目录号：P7543）
3.低温恒温器刀片（例如，莱卡，目录号：14035838383）
4.手术刀Ñ ° 11（例如，Sigma，目录号：S2771）
5.胶带（例如，3M，目录号：2214）
6.铝箔（例如，Sigma，目录号：Z185140）
7.染色架（例如，电子显微镜科学，目录号：70315）
8. 50 ml锥形管（例如，Fisher Scientific，目录号：14-432-22）
9针18G（例如，吉美专业医疗产品，目录号：23750）
10. 1.5毫升微管（例如，Sigma公司，的Eppendorf，目录号：Z606340;优选RNA酶免费）
11.组织冷冻介质（例如，组织-Tek的® OCT化合物，樱，目录号：4583 ）
12.乙醇100％（室温- 18 ℃，至25 ℃下;例如，Sigma，目录号：E7023）
13. 100％乙醇（4 °C ；例如，Sigma，目录号：E7023 ）
14.甲酚紫（例如，Sigma，目录号：C5042）
15.甲基丁烷（例如，Sigma，目录号：277258）–室温
16.干冰
17.酷箱
18.金属罐
19. 2种浓度为70％的乙醇溶液（4 °C ；用100％乙醇稀释；例如，Sigma，目录号：E7023；请参见食谱）
20. 50％乙醇（4 °C ；从100％乙醇中稀释；例如，Sigma，目录号：E7023；请参见食谱）
21.甲酚紫1％（请参阅食谱）

设备

低温恒温器（例如，徕卡，莫德尔：CM1950 ）
组织保持器或低温恒温器的卡盘（例如，MarketLab ，PolarChuck TM ，目录号：ML39130）
（ø ptional）卢佩（例如，ZEISS，型号：STEMI 508 ）

程序

安乐死老鼠并处理大脑
建议通过断头台斩首或颈椎脱臼来安乐死小鼠，注意不要损伤大脑。未标明安乐死的化学技术（注射和吸入），因为即使在低剂量下，它们也会引起大脑的生化变化（Leary等人，2013），例如异氟烷（Bekhbat等人，2016）。然而，要使用哪个安乐死技术是研究者“的选择，虽然上述参数必须考虑。
使用Spijker（2011）描述的技术或您选择的任何其他方法，从头骨上取下大脑。重要的是要快速去除并且对组织没有损坏。
冻结大脑，将其浸入-50 °C的甲基丁烷中（使用干冰）。
关键步骤：为此，您可以将干冰放在凉爽的盒子中，将甲基丁烷放在金属容器（例如金属罐）中。将含甲基丁烷的金属容器放在干冰上冷却。值得一提的是，在低温恒温器中切片时，在低于-50 °C的温度下发生的大脑快速冻结可能会导致组织破裂。因此，在操作过程中，应使甲基丁烷温度保持在-50 °C以上（可以使用红外温度计以提高准确性）。
冷冻大脑后，重要的是将其单独保存在-80 °C的冰箱中，并保存在能够保存器官结构的包装中。您可以将大脑储存在-80 °C的温度下长达一年（我们在实验室中进行的测试未超过此时间）。在我们的实验室中，我们使用低成本的材料来储存大脑，如图1所示，它是由一层铝箔和胶带制成的。

图1.储存大脑。一。该包装的正视图，用于将大脑储存在冰箱中（-80 °C ），由铝箔和胶带制成。乙。要在冰箱中存放大脑的包装上方视图，请注意顶部开口以将大脑放入包装内。Ç 。放置大脑后，通过紧密折叠铝箔的顶部来密封包装。

准备载玻片
裁片封口膜®适合以覆盖载玻片表面（为25mm× 75毫米）。
注：建议切割封口膜®比载玻片略小，这样更容易使用的染色架进行染色。
附加封口膜®使用粘合带的载玻片上，留下游离的在其上的脑切片将被定位在所述表面（图2 ）。
注：d O不可拉伸一块封口膜® 。

图2.按照PAM协议准备的显微镜载玻片。所述显微镜载玻片的细节（1）覆盖有未延伸小块封口膜®用胶布固定（3）（2）。

在低温恒温器中处理大脑
放置在组织保持架的脑与朝上的前部区域（˚F igure 3 ），即，在组织冷冻介质中的大脑的后侧浸渍（即，含有延髓的一侧）。这样，将更容易找到参考点以对齐半球。
关键步骤：我F你需要位于脑干microdissect结构建议在组织保持架定位大脑成反比，浸渍脑的前部区域（即，含有嗅球的一侧）在组织冷冻介质中。这是必要的，因为大脑的冷冻方式（在-50 °C下使用甲基丁烷）会使大脑的茎变得脆弱，由于低温恒温器刀片的压力而容易断裂。
注意：我吨还建议在组织保持器的保持器垂直定位大脑，这还防止从破脑干（参见图3 Ç ）。

图3.将大脑放在低温恒温器中。A.在俯视图中（以厘米为单位）的鼠标大脑的解剖学方向。B.将大脑放置在组织固定器（或低温恒温器卡盘）中，注意前部区域向上（C）。
注意：我们建议如何将大脑放置在组织支架的支架中：垂直放置，以防止由于低温恒温器刀片的压力而引起的脑干破裂。

对齐半球，这样低温恒温器刀片将垂直切开大脑。为了对齐两个半球（当它们相对于前relation处于相同位置或非常相似时），实验人员必须将大脑切成薄片，直到将其分为四个象限，并由鼻沟和纵向裂隙分开（见˚F igure 4 ）。实验者应通过移动组织固定器的固定器，将这些凹陷作为神经解剖学参考来对齐半球。
关键步骤：d uring切片，保持在-15低温恒温器温度℃的，高于此温度的切片将解冻，并在该温度以下的切片会开裂。

图4.对齐半球的神经解剖学参考。注意，在图像（A）中，半球未对齐，而在图像（B）中，半球未对齐。C.插入物显示神经解剖参考的图形方案（鼻沟（rs ）=黑色箭头；纵裂（lf ）=绿色箭头）。

确定南汽开始，并开始收集与封口膜幻灯片片® 。在NAC开始时实验者能够识别胼胝体和通过肉眼前连合（参见˚F igure 5A ）。从这一刻起，实验者应放置在一个幻灯片与准备切片封口膜® （参阅有关如何执行此步骤中的一个重要的暗示˚F igure 6 ），直到前连合交叉大脑的中间平面（commissurated区域，其中存在从一个半球到另一纤维的通道），如图˚F igure 5B 。该接合区域指示NAc后极限。小心地放在封口膜顶部切片®覆盖的幻灯片。从大脑收集所有切片后，将载玻片应该像所示的一个˚F igure 7 。如果切片的厚度为60μm，您将收集大约24片切片，直到看到前连合穿过大脑的正中平面为止。
关键步骤：在将切片放在载玻片上之前，切勿从低温恒温器中取出切片，直到开始下一步（染色和脱水），否则切片会解冻。
注意：我的f，难以通过肉眼来可视化，实验者可以收集在一个共同的载玻片上的切片（无封口膜® ），用甲酚紫1％（在50％乙醇中稀释）的下降留下污点和可视化显微镜。

图5.确定NAc的前部和后部界限。A.参考点来识别伏隔核（前解剖限制）的开始，并开始收集在载玻片切片用Parafilm制备® 。B.定位NAc的末端（后解剖极限）并停止收集切片的参考点，注意接合区域。C.插入物显示神经解剖学参考的图形方案（call体（cc）=绿色箭头；前连合（aco ）=黑色箭头；侧脑室（lv）=蓝色箭头）。

图6.如何定位与封口膜幻灯片片® 。首先，温滑的背面（没有封口膜®用手指）（A）则接近滑动片，这将附加到封口膜® （B）。

图7.带有NAc切片的幻灯片。与NAC滑动的细节切片放置在封口膜的顶部® 。

染色切片
通过将包含切片的载玻片浸入染色架中，使用以下所述的沐浴程序对切片进行染色和脱水（有助于显微解剖并保留大分子）。值得一提的是，片不从片染色，一旦封口膜后回落®切片粘连帮助。将切片染色后，载玻片应如图8所示。
酒精中120秒70％（4 °C）;
在1％的Cresyl Violet中90 s（用50％酒精稀释）（4 °C ）
在70％酒精（4 °C ）中快速洗涤（2s）2次;
在100％酒精中（4 °C ）120秒;
在100％酒精中放置120秒（室温）；
晾干15分钟（可选：使用实验室通风橱）。
关键的一步：[R enew所有醇溶液后，使用20或后第一次使用30天。这不适用于1％的Cresyl Violet溶液，该溶液最多可使用60次或在首次使用3个月后使用。

图8.带有染色的NAc切片的幻灯片。与染色的伏隔滑动的细节切片放置在封口膜的顶部® 。

股票的滑动对，一个与回另一个，50ml锥形管内（˚F igure 9 ）。
关键步骤：Ť ö保存组织脱水，密封锥形管用Parafilm ® 。这样，带有切片的载玻片可以在-20 °C下冷冻几个月，而不会损坏组织。

图9.存放幻灯片。将玻片成对放入一个50 ml的锥形管中，一个放回另一个。

NAc手动显微解剖
从冷冻机中取出装有载玻片的锥形管，并在室温下放置至少15分钟以解冻。
关键步骤：Ĵ UST总解冻后打开锥形管中。
将幻灯片放在放大镜下（可选），以方便可视化大脑区域。在这一点上，实验者必须确定前连合（发白的圆形结构）。在n ° 11的手术刀的帮助下，刮除属于前连合的所有组织，并将其除去。执行此经过刮，使周围的伏隔核（也切割石蜡膜上的切割® ）。在这个时刻，我们建议实验者咨询地图集（如。，富兰克林和Paxinos，2013），确认只有伏隔核组织被除去。图10依次显示了NAc的位置以及如何使用手术刀在NAc周围进行切割。在该步骤之后，用针的帮助去除组织中，将其放置在一个1.5毫升微型管（参见˚F igure 11 ）。密封与管封口膜®并将其在-80存储℃下进行分子生物学过程。
注意：Ť华氏度acilitate NAc中去除与针，实验者可以离开的略微凸起部分的Parafilm ®用手术刀切割时。

图10. NAc手动显微解剖。（A1），（B1），和（C1）示出了伏隔的开始（前极限），中部和端部（后限制）的代表性序列，分别。（A2），（B2），和（C2）示出了这些相同的代表切片后伏隔被板缺由手术刀（注意，伏隔核与封口膜一起除去® ）。（A3），（B3），（C3）和（D2）显示了神经解剖参考的图形方案。（D1）显示了没有NAc的切片，请注意，前连合横穿大脑的正中平面，表明NAc的末端。（corp体（cc）=绿色箭头；前连合（aco ）=黑色箭头；侧脑室（lv）=蓝色箭头；纹状体背侧黄色箭头）。
注：我与N个最切片的话，可以考虑NAC的对扶优限为背侧纹状体，下极限，腹侧苍白球，内侧极限内侧隔复杂和侧脑室结束。横向界限较难辨认，但您可以考虑皮质的起点。

图11.使用微管储存NAc组织。1.5毫升微管用于从大脑mice`s与封口膜沿截取股票伏隔组织® 。

数据分析

显微组织可以用TRIzol处理®试剂为大分子萃取。显微切割可产生组织的低量，因为这一点，我们建议使用0.5毫升的TRIzol的® REAG每个样品ENT。对于在使用的TRIzol其它试剂®试剂协议中，我们建议使用在试剂数据片所建议的比例（见的TRIzol ®试剂用户指南这里）。
注：Parafil的片米®保持协议（相分离）的所述第一离心分离后，水相的表面上，在这一刻，他们可以容易地除去。
在接下来的步骤，在TRIzol试剂一些变化®试剂数据表可以被执行。在RNA沉淀步骤中，建议将0.25 ml 100％异丙醇，5 µg不含RNase的糖原或2 µl线性丙烯酰胺作为载体添加到水相中（它们将与RNA共沉淀，从而增加提取效率）。在此RNA沉淀步骤中，我们还建议将样品在-20 °C下孵育过夜（以最大化RNA沉淀），然后以12,000 xg离心10分钟。在实验方案的下一步（RNA洗涤）中，我们建议进行一两次RNA洗涤，否则可能会导致RNA过多流失。最后，可以使用10μl不含RNase的水或0.5％SDS溶液重悬RNA。
重要的是要提到的TRIzol是重要®试剂协议可能不具有高的蛋白质提取效率。因此，我们建议使用8 M尿素的另一种蛋白质提取方案。对于此建议的方案，加入500微升8M尿素到显微切割样品，温育在室温下（实验者可以执行在超声波仪3个快速脉冲）20分钟，然后以12,000rpm离心XG 5分钟。使用上清液。的碎片的Parafilm ®将人所以后暂停该离心分离，并且可以容易地除去。

RNA分析
通过的TRIzol提取的RNA ®试剂协议产量在质量和数量足够的材料实时PCR和RNA-seq的技术。这些技术已经在我们的实验室中成功地使用了从PAM协议中获得的样品进行了实施（参见Pagliusi Jr.等人，2018和Brandão等人，2019 ）。表1示出了RNA定量和通过PAM协议显微切割5个不同的样品纯度，并使用上述的TRIzol处理®试剂协议。

表1. RNA分析。RNA定量和通过PAM协议显微切割和使用的TRIzol处理5个不同伏隔样品纯度®试剂协议。
样品
定量ng / µl
比率260/280
1个
700.01
1.971
2
796.67
1.864
3
770.84
1.903
4
649.02
1.818
5
859.31
1.905

蛋白质分析
虽然我们认为，受的TRIzol提取蛋白质®试剂协议收益率在质量和数量足够的蛋白质印迹（WB）和ELISA技术（在通过PAM协议显微切割样品）的材料，只有WB是在我们的实验室测试。另外，Franck等。（2013年）使用来自PAM协议的样本进行了质谱分析。图12 （使用相同的样品对上述RNA分析）示出了用于WBβ肌动蛋白和丽春在使用通过PAM协议显微切割5个不同的样品我们的实验室中进行，并使用的TRIzol处理®试剂协议。

图12.蛋白质分析。（A）对于β肌动蛋白和Western印迹（B）丽春红染色膜中使用伏隔采样来自PAM协议我们的实验室中进行，并使用的TRIzol处理®试剂协议。

菜谱

甲酚紫1％（原料温度：4 °C ）
2.5克甲酚紫
250毫升乙醇50％
乙醇70％（原料温度：4 °C ）
60毫升乙醇100％
140毫升蒸馏水
乙醇50％（用于1％的甲酚紫）：
100毫升乙醇100％
100毫升蒸馏水

致谢

这项研究是由资金Coordenação德Aperfeiçoamento德Pessoal去NIVEL高级-巴西（CAPES） -财务代码001和圣保罗研究基金会（FAPESP） -允许数量2013 / 09749-4和2015 / 26777-7。我们感谢之前的研究（Franck等，2013; Quanico等，2015，2017a和2017b; Delcourt等，2017和2018），这些研究使我们能够执行和描述NAc显微解剖的方案。我们也感谢艺术家弗拉维亚Pagliusi （用于接触flaviapgl@gmail.com）是由遗传资源aphical方案适用于F igures 4 ，5和10 。

利益争夺

我们声明没有利益冲突。

伦理

此处介绍的所有实验均得到坎皮纳斯大学生物研究所动物使用伦理委员会-CEUA / UNICAMP的批准（协议3849-1和4249-1）。

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