材料和试剂
生物材料
1.甜罗勒品种Genoveser （Enza Zaden ）的种子

2.带有二元载体pKSE401衍生质粒的根癌农杆菌菌株EHA105，其含有NPTII作为选择标记基因

化学制品
硫酸卡那霉素（VWR International，目录号：89149-900 ）
利福平（圣克鲁斯，目录号：sc-200910 ）
Luria-Bertani（LB）汤，米勒（Fisher Scientific，目录号：BP1426-2 ）
琼脂（VWR International，目录号：AAA10752-36 ）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
3'，5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮（乙酰丁香酮）（Sigma-Aldrich，目录号：D134406 ）
Murashige和Skoog（MS）基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903 ）
植物藻（PlantMedia ，目录号：40100072-1 ）
噻二唑（TDZ）（PlantMedia ，目录号：30631018-2 ）
1-萘乙酸（NAA）（PlantMedia ，目录号：30631016-1 ）
Timentin （PlantMedia ，目录号：42010012-3 ）
Cloroxmax （次氯酸钠6％），含Clorox常规漂白消毒剂（Clorox）
使用Synergy净水系统（EMD Millipore）产生的MilliQ水

玻璃器皿，塑料器皿及其他消耗品
用于细菌生长的无菌P etri皿（100 x 15毫米，BD Falcon，目录号：351029）
1.5 ml微量离心管
分光光度计试管
注射器过滤器（0.2 μ M）（VWR国际，目录号：28145-477）
无菌移液管尖端（20，200，1 ，000微升）
无菌15 ml和50 ml锥形管（VWR International，目录号：82050-276和82050-346）
玻璃培养基瓶
软木钻（2号）
无菌纸巾上（Scott ® C形折叠的毛巾）（VWR国际，目录号：10815-570 ）
无菌镊子和手术刀（高压灭菌）
细胞培养皿（100 x 20 mm，Greiner Bio-One，目录号：664160-TRI）
带盖植物培养容器（190 ml，Greiner Bio-One，目录号：967161）
3M TM Micropore TM手术胶带（3M Healthcare，目录号：1530-0）
铝合金箔
3.5英寸方形花盆
土壤混合物（例如，SunGro园艺S混合4号混合物）
塑料平板（1020托盘，重型）和圆顶（用于1020托盘的7英寸通风圆顶），用于植物生长（温室大卖场，目录号：CN-FLHD和PR-DOME7）

媒体和解决方案
抗生素储备溶液，植物生长调节剂和其他溶液
卡那霉素（50 mg / ml）（请参阅食谱）
利福平（25 mg / ml）（请参阅食谱）
Timentin （200毫克/毫升）（请参阅食谱）
TDZ（1 mg / ml）（s食谱）
NAA（0.5 mg / ml）（s食谱）
乙酰丁香酮（AS）（0.2 M）（请参阅食谱）
12％（v / v）的Clorox常规漂白消毒液（请参阅食谱）
农杆菌培养基
LB琼脂（参见食谱）
农杆菌接种培养基（IN）（见配方）
甜罗勒再生的培养基
愈伤组织和芽诱导（SI）介质（请参阅食谱）
根诱导（RI）介质（请参阅食谱）

设备

-80 °C冷冻室
高压灭菌器（允许温度为121的任何型号°C）
植物生长室（任何具有温度和光照控制的模型）
孵化器摇床（例如，New Brunswick Scientific，型号：Excella E25）
pH计（例如，赛默飞世，猎户星A111）
层流罩（例如，LABCONCO，型号：36125）
移液器® 20，200,1000微升（例如，RANIN，吸取-精简版XLS）
分光光度计（例如，Eppendorf，6131 23550）
定轨振荡器（例如，德国Heidolph Rotamax 120轨道平台振荡器）
光照和温度受控的植物组织培养室

程序

植物生长
将甜罗勒种子种植在装有Sunshine Mix 4的方形花盆中，并使其在25 °C的植物生长室中光照12 h使其生长3周。
用于转化的植物处于两个真叶阶段。
前两片真叶的长度通常在1.5-2.0厘米之间，用于切除外植体以稳定转化。

农杆菌制剂
注意：在无菌条件下在层流通风橱中进行操作。

转化前三天，将带有所需质粒的根癌农杆菌EHA105条纹接种于LB琼脂平板上，并用适当的抗生素将其于-80 °C保存。我们使用源自pKSE401载体的质粒（Xing等人，2014）使用CRISPR / Cas9对甜罗勒ObDMR1进行定向诱变（Navet and Tian，2020）。的LB琼脂在我们的实验板是在补充有15微克/ ml的利福平（用于选择根癌土壤杆菌EHA105）和50微克/毫升卡那霉素（用于质粒的选择）。孵育在28所述板℃下两天。注意：该板可在4 °C下保存并在一周内使用。
转化的前一天，使用无菌的1. 0.5 ml微量离心管从上述培养皿中sc取细菌，并在含有适当抗生素（在我们的研究中包含卡那霉素和利福平）的新LB琼脂培养皿中传播。将平板在28 °C下孵育过夜。
对转化的天，刮去的细菌细胞用无菌1ml的部分移液管尖端，重悬在1ml的土壤杆菌接种培养基（IN）通过吸取溶液上下直到homogen ë OU中的悬浮液中观察到。将悬浮液转移至装有5 ml IN培养基的15 ml管中，并充分混合。
注意：由于铝制介质中含有对光敏感的乙酰丁香酮，因此请用铝箔覆盖该管，以免产生光。

使用分光光度计，以IN培养基为空白，测量上述细菌悬液的OD 600 ，然后将最终OD 600调整至〜0.6（用于接种外植体的浓度）。100-150外植体大约需要20 ml农杆菌悬浮液。将悬浮液在无菌（50 ml锥形管）中于室温（RT）在定轨振荡器上以70 rpm在黑暗中孵育2小时。
注：松开50ml锥形管的盖，以允许通气和再涂与管铝箔。

外植体的制备
注意：在无菌条件下，在层流罩中执行步骤C 2，C 3和C 4 。

在培养农杆菌悬浮液的同时准备外植体。从三周大的甜罗勒植物上摘下第一对真叶，然后将其浸入500 ml培养基瓶中的12％（v / v）Clorox常规漂白消毒液中，对叶子进行表面消毒5分钟。该步骤应轻轻进行，以免损坏叶片。对于每个转换，我们通常处理约100个叶子。
表面STE后立即rilization，洗净在无菌叶子的MilliQ通过几次轻轻倒转瓶水3分钟。ř EPEAT该洗涤步骤三次。总共需要进行四次洗涤，以除去粘附在叶片上的任何漂白剂。
将叶子转移到无菌纸巾上。使用无菌2号软木塞从中脉靠近叶基的区域从每片叶片上切下两个圆形叶片，如图1所示。

图1.从表面灭菌的真甜罗勒叶上切下两个外植体（直径为6.25 mm的叶盘）

从每个叶切除外植体后，立即将它们放置在无菌P填充无菌ETRI菜的MilliQ水作为如图2所示。这保持新鲜，直到外植体从所有叶中提取的叶盘。

图2.漂浮在无菌MillQ水中的外植体（叶盘）

用农杆菌接种外植体并共培养
注意：在无菌条件下进行。

完成后农杆菌INC ubation和外植体的制备，浸没全部在将外植体的土壤杆菌悬浮液30分钟（大约20毫升的农杆菌悬浮液所需要的100-150的外植体），为s hown在图3中保持管远离通过用覆盖它光铝箔。每10分钟轻轻翻转试管3-4次，以确保所有外植体均浸入悬浮液中。

图3.图示显示了将叶盘浸入农杆菌悬浮液中

轻轻擦拭两层无菌纸巾之间的叶子，以吸干叶盘，以去除多余的悬浮液。
共培养：T转让（BOT）的农杆菌-inoculated使用无菌镊子在补充有200愈伤组织和枝条诱导（SI）培养基平板植微升AS与背面侧接触介质（每20个外植体P ETRI皿）（图4A）。密封与板微孔TM手术胶带和涡卷与铝箔。在黑暗条件下于25 °C在植物组织培养室中将平板孵育三天。

转基因植物的再生
转移的土壤杆菌感染的外植体转移到补充有SI培养基平板200微克/ ml的特美汀（来抑制其生长的根瘤农杆菌EHA105）和30微克/毫升卡那霉素诱导和转基因愈伤组织的选择。密封与板微孔TM手术胶带胶带，包装与铝箔并在25温育所述板℃的黑暗条件下4-6周定期传代培养到新鲜培养基每两个星期。
在此过程中，我们观察到几个关键的再生阶段，包括：1周内以不规则的方式使叶盘膨胀（图4B），又在1-2周内形成愈伤组织（图4C），然后发芽细小芽。通常为浅黄色/黄色（因为板在黑暗条件下孵育）（图4D），偶尔是绿色（图4E）。

建议每周定期检查板，以观察愈伤组织/芽的形成。必要时，请勿让愈伤组织/芽变暗（棕色/黑色），并在新鲜培养基上进行亚培养。继代培养时，通过去除所有死的/腐烂的（棕色/黑色）组织来清洁愈伤组织/芽，然后将其置于新鲜培养基上。

注意：培养基中也可能出现芽，因此在进行新的亚培养时应翻转侧面，以便进行适当的通气。

图4.愈伤组织和芽诱导（SI）培养基的再生阶段。A.在含有乙酰丁香酮的SI培养基上与农杆菌共培养叶片外植体。B.在补充有timentin和卡那霉素的SI培养基上培养1周后，叶片圆盘膨胀。C. 2周后形成愈伤组织。D.苍白/黄色的芽从生长的愈伤组织中出现。E.绿芽。

一旦芽上的愈伤组织培养，切割个别十拿九稳TS（长度约0.5cm以上）用无菌解剖刀并转移到植物培养容器含有根诱导（RI）介质补充有200微克/ ml的特美汀和30微克/毫升卡那霉素（图5A）。密封与容器微孔TM手术胶带，盖与铝箔并在25温育在黑暗中1周的容器℃下。
注意：不要让幼芽过度拥挤容器；放置芽时允许半厘米的间距。

3. 1周后，取下箔纸，将容器在光照下于25 °C下在12小时的光照下孵育4-8周，每两周定期在补充有timentin和卡那霉素的新鲜RI培养基上进行常规传代培养。在对新鲜培养基进行亚培养的过程中，请确保去除任何死亡或腐烂的组织，并仅转移分化良好的绿芽茎（图5B）。转移的每个分化良好十拿九稳吨茎分开到组织培养容器，以允许根建立和转基因植物（图的充分发展小号5C- 5 d）。在为茎杆提供光照条件后，通常需要2-3周才能发展成具有牢固根的转基因植物。在这一阶段（图小号5C- 5 d），叶组织可以从容器增长到测试用于通过PCR转基因整合植物切除。

笔记：

密切观察容器，必要时进行传代培养；
丢弃在一个月内没有根形成迹象的芽。

图5.在根诱导（RI）培养基上的芽和根发育。A.带有新芽的芽从SI介质转移到RI介质以进行进一步开发。B.在光照下2周后，在RI培养基上显影芽。光盘。具有完善的芽（C）和根（D）系统的小植株。

适应环境
从培养基容器中取出具有成熟芽和根系的转基因植物，并用无菌MilliQ水彻底清洗根部，以去除残留的培养基。
栽于湿润的土壤混合物（图6A）和在100％相对湿度生长3-4天在覆盖有在生长室集的塑料圆顶的托盘，在25 ℃下用12小时的光周期。
通过部分打开塑料圆顶，在接下来的2-3天中逐渐降低湿度，最后移除塑料圆顶，使植物适应离体条件。
一旦植物达到一定高度（12.0-15.0厘米），将其重新放入较大的盆中，然后将其转移到25-30 °C的自然光下的温室中繁殖种子（图6B）。

图6.再生的转基因植物在土壤中的驯化（A）和温室中用于种子生产的转基因植物的持续生长（B）

笔记

不要使用较旧的甜罗勒叶进行转化（因为这样会降低效率）。
使用新鲜制备的乙酰丁香酮（AS）溶液，以提高转化效率。
尽可能限制含有AS的溶液/介质的曝光。
在表面灭菌和洗涤时，应轻柔地处理已拔出的叶子，因为剧烈摇动可能会损坏叶子。
在常规的传代培养中，应通过去除深色/腐烂的组织来清洁愈伤组织和幼芽。
不要过度拥挤的组织培养P ETRI菜肴，或发展组织的容器，因为它可能会限制器官分化和生长的营养供应。
定期检查组织培养板/容器是否有真菌和细菌污染，尤其是在亚培养到新培养基后的第2天。一旦发现污染，通过小心地去除真菌/细菌菌落（如果仍然很小）或将干净的组织立即转移到新的培养基中来拯救未受污染的组织。

菜谱

卡那霉素（50 mg / ml）
将500 mg硫酸卡那霉素溶于10 ml MilliQ水中

使用0.2过滤消毒μ米注射器过滤器

以1毫升等分试样在-20 °C下储存

利福平（25 mg / ml）
将250 mg利福平溶于10 ml DMSO中

储存在-20 ℃下在1ml的等分试样包在铝箔以避光

Timentin （200毫克/毫升）
将2克Timentin溶于10毫升MilliQ水中

使用0.2过滤消毒μ米注射器过滤器

以1毫升等分试样在-20 °C下储存

噻二唑（TDZ）（1毫克/毫升）
将50 mg TDZ溶于1 ml 1 N NaOH中，并用无菌MilliQ水逐渐稀释，使最终体积为50 ml

储存在4 °C ，可以使用几个月

NAA（0.5毫克/毫升）
将25 mg NAA溶于1 ml 1 N NaOH中。通过不断搅拌溶液，使用无菌MilliQ水将体积调至50 ml

储存在4 °C ，可以使用几个月

乙酰丁香酮（AS）（0.2 M）
通过涡旋将40 mg乙酰丁香酮溶解在1 ml DMSO中，使其完全溶解

包裹在管铝箔; 实验当天要新鲜

12％（v / v）高乐氏常规漂白消毒液（300毫升）
Clorox常规漂白剂36毫升

MilliQ水264毫升

拌匀

补充有卡那霉素（50 µg / ml）和利福平（15 µg / ml）的LB琼脂，250毫升
LB汤米勒6.25克

琼脂3.75克

使用MilliQ水将容量补足至250毫升

高压灭菌，一旦介质冷却至50 °C ，加250μ升卡那霉素（50毫克/毫升）和150微升lrifampicin （25毫克/毫升），漩涡媒体拌匀在100×15毫米陪替氏倾d ishes

将板存放在4 °C并在一个月内使用

农杆菌接种培养基（IN）[ 4.3 g / L Murashige和Skoog基础培养基（MS），3％蔗糖，16.8μM噻唑酮（TDZ），pH 5.7，补充200μM乙酰丁香酮（AS）]，100 ml
MS基础培养基 0.43克

蔗糖3克

TDZ（1毫克/毫升）400 μ升

将上述物质溶于80 ml MilliQ水中，用0.5 N NaOH将pH调节至5.7，并使用MilliQ水补足至100 ml

高压釜中，加入100 μ升AS（0.2 M），当它冷却到室温，盖与铝箔，以避免光。

始终在实验当天进行

愈伤组织和枝条诱导（SI）媒体（4.3克/ L MS，3％蔗糖，0.8％植物琼脂，16.8 μM TDZ，pH值5.7）在补充有200 μM AS 500毫升
MS基础培养基 2.15克

蔗糖15克

TDZ（1毫克/毫升）2毫升

将上述物质溶于400 ml MilliQ水中，用0.5 N NaOH将pH调节至5.7，并使用MilliQ水补足至500 ml

加入4克植物琼脂

高压釜中，添加500 μ升AS（0.2 M），当它冷却到约50 ℃下，充分混合，并在细胞培养皿倾/ P ETRI-板，盖用铝箔避光

始终在实验当天进行

愈伤组织和芽诱导（SI）培养基，补充了timentin （200 µg / ml）和卡那霉素（30 µg / ml），500 ml
如上所述准备SI介质（9）

在当高压灭菌后培养基冷却至50 ℃下，加入500 μ升特美汀（200毫克/毫升）和300微升卡那霉素（50毫克/毫升），漩涡媒体一个第二倒在细胞培养皿

介质板可以在4 °C下保存两周

根诱导（RI）媒体[ 4.3克/ L MS，3％蔗糖，0.8％植物琼脂，0.054 μM NAA，pH值5.7]补充有特美汀（200 μ微克/毫升）和卡那霉素（30 μ微克/毫升），500毫升
MS 2.15克

蔗糖（3 ％） 15克

NAA（0.5毫克/毫升）10 μ升

将上述物质溶于400 ml MilliQ水中，用0.5 N NaOH将pH调节至5.7，并使用MilliQ水补足至500 ml

加入植物琼脂 4克

高压釜中，一旦媒体冷却到50 ℃下，加入500 μ升特美汀（200毫克/毫升）和300微升卡那霉素（50毫克/毫升），漩涡媒体和植物组织培养容器倾

媒体容器可以在4 °C下保存两周

致谢

这个协议是从原始的研究论文衍生通过Navet和田（2020）。根据Phippen和Simon（2000）描述的甜罗勒再生开发方法以及以前由Deschamps和Simon（2002）报道的农杆菌介导的甜罗勒转化方法对其进行了修饰。该工作得到了NIFA HATCH（登录号1003536和1020611）以及美国农业部-美国农业研究服务局第58〜5320〜4〜020号协议的支持，该协议的标题为“病虫害的防治和特种作物的增值”，由美国农业部管理。夏威夷大学马诺阿分校热带农业与人力资源学院。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Deschamps，C.和Simon，J.（2002）。根癌农杆菌介导的罗勒罗勒叶和O. citriodorum的转化。Plant Cell Rep 21：359-364。
Navet ，N.和Tian，M.（2020年）。通过CRISPR / Cas9在异源四倍体甜罗勒中高效靶向诱变。Plant Direct 4（6）：e00233。
Phippen ，WB和Simon，JE（2000）。从罗勒（Ocimum basilicum L.）嫩芽再生。体外Cell Dev-PL 36（4）：250-254。
邢HL，董L.，王ZP，张HY，韩CY，刘斌。王XC和陈QJ（2014）。用于在植物中进行多重基因组编辑的CRISPR / Cas9工具包。BMC Plant Biol 14：327。