材料和试剂

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1.铝箔油，450 mm×90 m卷（火花实验室耗材，目录号：ALF01）

2.感兴趣的抗生素/抗菌素，例如硫酸庆大霉素盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：17849-5G-F）

3.不含抗生素的Luria-Bertani（LB）琼脂板（请参见配方1）

4.感兴趣细菌菌株，例如，大肠杆菌DSM 1103（DSMZ培养物保藏中心）

5.聚丙烯离心管，可高压灭菌，锥形，50 ml（Sparks Lab Supplies，目录号：AB-P10403）

6.无菌低温瓶2 ml（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：11787939）

7.乙醇溶液，70％（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：15430665）

8.甘油，≥99.5％（Sigma-Aldrich，目录号：G9012-500ML）

9.甘油30％（请参见配方2）

10. LB汤（Sigma-Aldrich，Lennox，目录号：L3022-1KG）

11.四分之一强度的LB肉汤（请参见配方3）

12.含琼脂的LB肉汤（Sigma-Aldrich，Lennox，目录号：L2897-1KG）

13.微管尖，将10μl/200μL/ 1 ，000微升（火花实验室用品，目录号：AB-P10115 / AB-P10107 / PT011）

14.多井板，U 96孔，聚苯乙烯，无菌（火花实验室用品，目录号：G650161）

15. 150毫米/ 230毫米玻璃巴斯德式移液器（火花实验室用品，目录号：PP150 / PP230）

16.磷酸盐缓冲盐水（PBS），10倍浓缩液，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：P5493-1L）

17. PBS ，1倍（请参见第4章）

18.无菌一次性注射器20 ml（Sparks Lab Supplies，Terumo，货号：SYR6208）

19.无菌注射器过滤器，蓝色，0.22 µm，25 mm（Sparks Lab Supplies，目录号：FIL6610）

<

设备

<

空气泵，带8个出口铬歧管，25 L（Warehouse Aquatics，Blagdon Koi ）

高压灭菌器（梅森技术，图特瑙尔，LABV-D 3870ELV-D 85L）

杜兰式玻璃瓶，玻璃，耐高温加热，1 L，45 mm宽口，蓝色塑料盖（Sparks Lab Supplies，目录号：BOT5310）

杜兰式玻璃瓶，玻璃，可高压灭菌，5升，45毫米宽嘴，蓝色塑料盖（火花实验室用品，目录号：BOT5314）

2 mm，4 mm和6 mm钻头的电钻（博世，五金店）

冰柜-80°C（Haier Biomedical）

冰箱，4°C（肯伍德）

培养摇床，37℃（梅森技术，新不伦瑞克TM伊诺® 42R，目录号：M1335-0006）

酶标仪（Tecan，Sunrise TM ）

多通道移液器Lambda Plus 8，1-10μl/ 20-200μl （Fisher Scientific，Corning TM ，目录号：11333625/11353625）

蠕动泵205S手动驱动器（Watson-Marlow，目录号：026.3001.00U）

205Ca8，8通道，8辊乙缩醛盒P / H（Watson-Marlow，目录号：023.1201.000）

橡胶塞，版本号27，顶部直径31 mm，底部直径27 mm，高度32 mm（VWR，目录号：391-2117）

管架，不锈钢，10×30毫米（Fisher Scientific，Grant Instruments TM ，目录号：15365842）

管夹，不锈钢，捏旋塞（Fisher Scientific公司，Bochem TM HOFFMANN TM ，目录号：11885091）

塑料管块，可高压灭菌，中档，带15个位置（Fisher Scientific，Bel- Art TM SP Scienceware TM ，目录号：11753177）

管道连接器，聚丙烯，直的，用于4-7 mm的管道（Fisher Scientific，Azlon TM ，目录号：10772227）

油管，中型，硅胶，半透明，内径5毫米，壁厚1.5毫米（VWR，目录号：DENE3100508 / 25）

油管，泵，PVC歧管，内径2.79毫米，壁厚0.8毫米，紫色/白色（Fisher Scientific，沃森·马洛，目录号：980.0279.000）

油管，小号，硅胶，半透明，内径4毫米，壁厚1.5毫米（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，货号：10644182）

数字式非搅拌水浴锅22升（Sparks Lab Supplies，Clifton，货号：NE2-22D）

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软件

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麦哲伦TM软件（Tecan，Sunrise TM ）

Excel（微软）

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程序

<

这个小型的多重化学恒温器系统是根据Miller等人（2017）和Tonoyan等人（2019）的设计构建的（请参见图1中的示意图）。

注意：以下步骤涉及一个单独的小型化学恒温器的构造；重复程序AC吨ö组装复用系统。

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图1. DIY，小型，多重连续培养系统的示意图

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零件的制造和固定

培养室（图1、2）。只需使用具有以下优点的50 ml聚丙烯离心管即可：a）足够的顶部空间用于20-30 ml培养物，b）可高压灭菌，c）透明，d）带有体积标记。

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图2.单个化学恒温器的图示。介绍了单个化学恒温器的组成和高压灭菌细节。

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培养室塞子（图2）。使用可高压灭菌的红色橡胶塞，该塞子适合50毫升试管的内部，并钻4个孔。对于介质流入，请使用电钻与6和2 mm钻头配合使用，分别在塞子的顶部（大）和底部（小）侧面钻两个通孔。对于空气流入，样品流出和废物流出，请使用2毫米钻头钻孔。

空气流入和培养混合（图1、2）。空气通过230毫米巴斯德玻璃移液管输送到培养室中。这是最长的移液器，到达培养管的底部。通过用无菌空气鼓泡将培养物混合。

将空气移液器推入塞子的中央大孔，然后小心地将玻璃杯的底部打碎，使其适合培养管的内部。

在空气移液器的顶端安装一条4-5厘米的中等硅胶管（用作连接器），并安装0.22 µm的注射器空气过滤器。

注意：此过滤器不可高压灭菌，因此在运行开始时应无菌连接。

用足够长的中号硅胶管将空气过滤器的另一端连接到气泵的一个出口（图3）。

注意：此管道不需要消毒，也不需要高压灭菌以保持干燥。

通过气泵的出口控制曝气速率。

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图3.多重连续培养系统的图示。描绘了系统的组成部分及其连接。

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样品流出（图1、2）。通过浸入培养管（第二长吸管）中的230 mm玻璃巴斯德吸管从培养皿中收集样品。

将采样移液器推入塞子的三个小孔之一，然后小心地将底部尖端折断到适当的长度。

在取样移液器的顶端连接2-3厘米的中等硅胶管。

连接到15厘米长的小硅胶管，并在其上安装夹子。

注意：可以使用200μl的移液管尖端的不同尺寸之间的连接器管材通过切割其尖锐的边缘和之间插入管材。

在取样管的末端连接一个无菌注射器，以用作取样端口。

注意：请勿在第一次采样时对注射器进行高压灭菌并进行无菌连接。

废物流出（图1、2）。用230毫米巴斯德玻璃移液管从培养室中清除废物，该移液管进入培养管内直至30毫升刻度，以确保准确的培养物体积（25毫升）（这是第三长的移液管）。通过移液管的长度控制培养物的体积。

将废液移液器推入塞子的小孔中，然后小心地将底部尖端折断到适当的长度。

在废液移液管的顶端连接一根足够长的中等硅胶管。

安装一个1毫升的移液器吸头以作为废物端口，该端口放置在1升废物瓶内（图1、3）。

介质容器（图1、3）。这是一个5升的蓝色瓶盖。

用4毫米钻头在盖子上钻2个孔，以固定2个刀片。使用Azlon直型连接器作为插入件。

将一根5-6厘米的中等硅胶管（用作连接器）安装到其中一个插入件（命名为空气过滤器端口），并连接到0.22 µm的注射器空气过滤器，以确保无菌压力均衡。

注意：此过滤器不可高压灭菌，因此应在高压灭菌后将其无菌连接。

将一条45厘米长的硅胶小管（称为排水管）连接到介质容器内的第二个插件（称为介质管端口），介质通过该插件排干并通过介质管循环。

将足够长的介质硅胶管连接到介质管端口的外端。将切好的200 µl尖端（用作连接器）安装到该管的另一端。

仅在运行前连接到白色/紫色泵管（在紫色端）。

媒体流入（图1、2）。培养基通过150毫米巴斯德玻璃移液管输送到培养室，是最短的移液管。

将介质移液器推入塞子的小孔中，并小心地将其底部尖端折短，但不要太短，以至于气泡起泡会导致介质管和介质容器中的回污染。

注意：尽管此处未实现，但您可以在介质移液器的顶端安装一条4-5厘米的介质硅胶管，并安装一个止回阀，以免污染介质容器。

将足够长的中段硅胶管连接到介质移液器（或运行前的止回阀）。

连接白色/紫色泵管（在白色端）。

运行开始时，将白色/紫色泵管与上方的介质容器管相连接。

通过蠕动介质泵的速度控制稀释率（图3）。

<

实验前零件的灭菌

介质储罐的高压灭菌（图3）。

放在一个5升瓶媒体的高压釜带和使250毫升体积标记的多达5个，500毫升。

可以在四分之一强度的LB肉汤中培养连续培养物，以确保营养限制。根据配方3进行准备。

用装有两个插件的盖子盖住5 L的介质瓶。

将排水管连接到介质瓶内。

在介质管上安装金属霍夫曼夹。

注意：夹紧介质管很重要，因为在高压灭菌过程中介质将从瓶子中流出。

将铝箔纸包裹在介质管的裸露末端。

将连接到空气过滤器端口的硅胶小管塞满。

确保介质瓶通风良好，以免爆炸-将5 L介质瓶的盖子松动。

将组装好的培养基瓶放入高压灭菌器（大得足以容纳5升带管的瓶子）中，并使用液体循环在121°C高压灭菌15分钟。

（可选）让介质在台式计算机上放置几天以检查是否有污染。

对单个化学恒温器进行高压灭菌（图2）。组装除热器的所有零件和管道，但以下情况除外：

请勿将注射器过滤器连接到空气移液器上，而要用金属箔包裹空气移液器的末端。

请勿将白色/紫色泵管的末端连接到介质容器的末端，而应将白色/紫色泵管的末端箔化。

不要将注射器连接到采样管上，而要用箔纸包起来。

将流出管的末端贴上箔纸。

用一块大的箔纸将每一个恒化器及其管路包裹起来，作为信封，并使用液体循环在121°C下高压灭菌15分钟。

废液瓶的高压灭菌。用铝箔和高压釜覆盖几个1 L蓝盖瓶的头部。

零件连接

连接单个化学恒温器的各部分（图1-3）。

高压灭菌后，在层流罩中打开化学恒温器的铝箔封套，并连接所有拆卸的部件（如果有）。

将无菌注射器过滤器连接到空气移液器。

将不锈钢试管架安装在未搅拌的数字水浴锅中，并将单独的化学恒温器放入其中。

将空气过滤器连接到介质容器（图1、3）。高压灭菌后，将无菌的蓝色注射器过滤器连接到空气过滤器端口。

注意：要在露天环境中连接不同部件，请先喷洒大量70％的乙醇。

将介质容器连接到单个化学恒温器（图1、3）。

无菌连接介质管和泵管。

将泵管放入泵盒中，然后将其夹入内部。

将空气过滤器连接至气泵（图1、3）。

将化学恒温器的空气过滤器连接到干燥的，未消毒的空气管道上。

将空气管连接到气泵的8个出口之一。

制作采样端口（图1-3）。

无菌地从采样管中取出箔纸，并连接一个20 ml无菌注射器。

用中型夹钳夹住采样管。

安排废物流出（图1、3）。无菌地从废液口中取出铝箔，然后刺穿铝箔，将其插入无菌的1 L废液瓶中。

注意：1升的瓶子是最方便的废物容器，因为可以测量废水量（用于稀释率调整），并且不需要每隔一天更换一次瓶子。

<

开始实验

建造完成后，小型多重连续系统的灭菌和最终组装（参见图1的示意图）建立了细菌培养实验。

设置介质泵。

一旦连接了多重系统的所有组件，就将单个小的化学恒温器（最多8个）放入水浴中，并将泵管插入泵盒中，打开蠕动培养基泵以循环培养基并填充培养物室到所需的体积。

注意：确保将培养基从培养基容器中抽到培养室中，而不要倒退。

无菌（用70％乙醇喷洒培养室的顶部）将废液移液器调整到大约30 ml的高度，以确保25 ml的培养物体积。

关闭培养基泵，将培养基留在培养室内过夜，以检查是否有污染。

注意：如果没有污染，则可以接种单个的小型化粪池。

将培养基泵设置为所需的稀释率：D =废液量/（经过时间×培养液量）。我们的实验所需的稀释率为0.4 / h。25毫升培养物的流速为10毫升/小时，这对应于约在此处描述的Watson-Marlow泵和恒化器系统上为0.75 rpm。

注意：定期记录来自各个小型化工厂的废物量并计算稀释率。相应地调整泵或单个泵盒以安排所需的稀释率。

设置气泵。通过气泵出口歧管的手柄调节过滤消毒空气的流量。

注意：理想情况下，我们希望将空气以特定速率（例如100毫升/分钟）输送到培养室中。但是，通过目视调节空气供应，以确保移液器不会阻塞。

接种恒化器系统。

实验前一天，从琼脂平板上生长的所需菌株的过夜培养物中选择一个菌落，然后将生长物转移到3 ml用于连续培养的相同液体培养基中（例如LB的四分之一强度）。

注意：这种单菌落悬浮液（也称为恒化器亲本）将用于接种8个平行的恒化器，以确保在整个连续培养过程中使用的亲本菌株在开始时就具有遗传均匀性。

通过目测将其浊度与OD 625 = 0.08（每毫升约10 8个菌落形成单位）的光密度的培养物进行目测比较，推断该培养物的细胞密度。

停止培养基和空气泵，以无菌方式打开培养室的橡胶塞，并在每个小的化学恒温器室中将亲本培养物接种到大约50 ℃ 。10 5 - 10 6 CFU / ml的最终密度（例如，转印0.25毫升恒化父悬浮液在约10 8 CFU / ml的成25毫升的培养基培养室的内部）。

将水浴温度设置为37°C，然后启动气泵。

分批将培养物放在小型化粪池中培养24小时，以达到培养物饱和状态。

通过启动介质泵使介质流入，切换到连续模式。

保留恒化器亲本菌株。

在接种了恒化器系统之后（步骤D3c），在连续摇动的37°C条件下，将未使用的恒化器母体悬浮液孵育数小时。

保持几微升用于步骤E1a。冻结剩余的ca来保存库存。在-80°C下，将1 ml的培养物与1 ml的30％无菌甘油混合在清楚标记的低温小瓶中。

对单个小的化学恒温器进行采样。

注意：理想情况下，每天都要对Chemostats进行采样，以测量不同的参数。

在采样口上喷洒大量70％的乙醇，松开它，取出1 ml培养物，丢弃，重新连接另一个无菌注射器，并采样2.5 ml培养物。

重新连接另一个无菌注射器，并夹住采样口。

保存来自单个小型化石的样品。

将1.5 ml的采样培养物转移到1 ml的30％无菌甘油中，并清楚地标记为低温瓶。上下吹打均匀混合。

P储备在-80°C。

将其余的采样培养物用于步骤E3a，E4a，E5a。

<

从头产生阻力

从同基因药物敏感的细菌菌株（例如，大肠杆菌DSM 1103）开始，不断发展的种群暴露于不断增加的抗微生物剂（例如庆大霉素）中。为了实现选择性压力，同时保持大量种群，应逐渐增加抗微生物剂的浓度，当培养物的密度恢复到添加抗微生物剂之前记录的值时，可增加抗微生物剂的浓度。

测定抗同基因恒化亲本菌株的最小抑菌浓度（MIC）。为了推断将要添加到Chemostat系统的培养基容器中的初始抗菌剂浓度，使用标准肉汤微量稀释法针对Chemostat母体确定了目标抗菌剂的MIC。

在保存化学趋化因子亲本之前，请使用适当体积的培养物（步骤D4a）准备一个ca。10 6 cfu / ml悬浮液。

使用96孔板，在四分之一强度LB中准备合适的目标抗菌剂的2倍稀释范围。

使用多通道移液器，在抗微生物稀释液中加入等体积的准备好的接种物（步骤E1a）。这样，接种物的起始密度被标准化为5×10 5 cfu / ml。

进行步骤E1A- E1一式三份B; 将一式三份的96孔MIC板在37°C下孵育24小时。

将MIC定义为抗菌剂的最低浓度，以防止出现浑浊。

将一式三份测量值的中位数报告为针对化学稳定剂母体的抗菌素的MIC（请参见表1中的示例）。

表1.在第0天（D0），来自同基因亲本培养物的最低抑菌浓度（MIC）数据的示例；未曝光（重复1）；在进化的n天中，连续暴露的抗菌素1（重复1）和抗菌2暴露（重复1）。给出了来自3个测量值（来自肉汤微量稀释测定法）的MIC值（μg/ ml），中值MIC值（μg/ ml）以及在特定采样日获得的MIC与恒化母体（在D0上）的MIC之比。

同基因亲本

D0

D1

D2

…

n

抗菌剂1

<

<

<

<

<

＃1测量

8

<

<

<

<

＃2测量

8

<

<

<

<

＃3测量

8

<

<

<

<

中位数

8

<

<

<

<

抗菌剂2

<

<

<

<

<

＃1测量

0.1

<

<

<

<

＃2测量

0.1

<

<

<

<

＃3测量

0.1

<

<

<

<

中位数

0.1

<

<

<

<

未曝光的文化

D0

D1

D2

…

n

抗菌剂1

<

<

<

<

<

＃1测量

<

8

8

8

8

＃2测量

<

8

8

8

8

＃3测量

<

8

8

8

16

中位数

<

8

8

8

8

比率（Dn / D0）

<

1个

1个

1个

1个

抗菌剂2

<

<

<

<

<

＃1测量

<

0.1

0.1

0.2

0.2

＃2测量

<

0.1

0.1

0.1

0.1

＃3测量

<

0.1

0.1

0.2

0.1

中位数

<

0.1

0.1

0.2

0.1

比率（Dn / D0）

<

1个

1个

2

1个

抗菌1暴露培养

D0

D1

D2

…

n

抗菌剂1

<

<

<

<

<

＃1测量

<

8

4

4

8

＃2测量

<

8

8

4

8

＃3测量

<

8

8

4

8

中位数

<

8

8

4

8

比率（Dn / D0）

<

1个

1个

0.5

1个

抗菌剂2

<

<

<

<

<

＃1测量

<

0.1

0.1

0.2

0.2

＃2测量

<

0.1

0.1

0.2

0.2

＃3测量

<

0.1

0.1

0.2

0.2

中位数

<

0.1

0.1

0.2

0.2

比率（Dn / D0）

<

1个

1个

2

2

抗菌素2暴露培养

D0

D1

D2

…

n

抗菌剂1

<

<

<

<

<

＃1测量

<

8

8

8

8

＃2测量

<

8

8

8

8

＃3测量

<

16

4

4

8

中位数

<

8

8

8

8

比率（Dn / D0）

<

1个

1个

1个

1个

抗菌剂2

<

<

<

<

<

＃1测量

<

0.1

1.6

3.2

3.2

＃2测量

<

0.1

1.6

3.2

3.2

＃3测量

<

0.1

1.6

1.6

6.4

中位数

<

0.1

1.6

3.2

3.2

比率（Dn / D0）

<

1个

16

32

32

<

在单独的培养基中添加抗菌剂。

首先，通过在培养基容器内无菌引入适当的体积，在单个培养基容器中补充其0.5×MIC的目标抗微生物剂（根据chemostat亲本）。

当暴露于抗微生物剂的培养物的OD 600达到添加抗微生物剂之前记录的值时，逐步将单个培养基容器中抗微生物剂的浓度增加0.5×MIC增量。

采样培养物的光密度测量。

从取样的化学恒温培养物中加入150 µl到96孔板的孔中，并使用酶标仪测量OD 600 。

一式三份进行测量，将结果取平均值（参见表2中的示例）。

表2.来自未曝光的细胞密度数据的示例（重复项1）；在进化的n天中，连续暴露的抗菌素1（重复1）和抗菌2暴露（重复1）。显示了来自3个测量值（来自酶标仪的读数）的OD 600值，平均值和标准偏差。

未曝光的文化

D1

D2

…

n

＃1测量

0.226

0.387

0.478

0.736

＃2测量

0.296

0.339

0.511

0.71

＃3测量

0.267

0.378

0.382

0.726

平均

0.263

0.368

0.457

0.724

标准偏差

0.03517

0.02551

0.06701

0.01311

抗菌1暴露培养

D1

D2

…

n

＃1测量

0.227

0.158

0.125

0.296

＃2测量

0.215

0.137

0.099

0.336

＃3测量

0.179

0.167

0.109

0.163

平均

0.207

0.154

0.111

0.265

标准偏差

0.02498

0.01539

0.01311

0.09057

抗菌素2暴露培养

D1

D2

…

n

＃1测量

0.246

0.127

0.08

0.12

＃2测量

0.268

0.1

0.1

0.128

＃3测量

0.164

0.121

0.06

0.127

平均

0.226

0.116

0.08

0.125

标准偏差

0.05481

0.01418

0.02

0.00436

<

枚举培养物的活细胞数。

从每天的恒化器样品中取10μl等分试样，使用多通道移液器和96孔板在1x PBS中连续稀释10倍。

使用多通道移液器在无抗菌的LB琼脂平板上，从适当的稀释液（每个稀释液3个）中复制5升等分试样（取决于培养物的密度，可能需要不同的稀释度）。

干燥斑点并在37°C下孵育LB琼脂板过夜。

列举每种可计数的稀释液中的单个菌落；计算CFU / ml的使用公式原始样品：CFU / ml的=＃的CFU /稀释/体积铺板对一式三份的结果进行平均（请参见表3中的示例）。

<

版权所有©20 20作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个

说明：logonew

表3.未曝光的细胞计数示例（重复1）；进化的第（D）1和D2天连续培养1个抗菌素（重复1）和2个抗菌素（重复1）连续培养。仅考虑可接受计数范围内的计数。框出用于平均（avg）cfu / ml和标准偏差（std）计算的值。TNTC –数量众多。

未曝光的文化

D1

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

电镀量（毫升）

稀释

＃1 cfu

＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

＃3平均CFU /毫升

平均CFU /毫升

性病

0.005

1个

汇合的

汇合的

<

汇合的

汇合的

<

汇合的

汇合的

<

<

<

0.005

0.1

汇合的

汇合的

<

汇合的

汇合的

<

汇合的

汇合的

<

<

<

0.005

0.01

TNTC

TNTC

<

TNTC

TNTC

<

TNTC

TNTC

<

<

<

0.005

0.001

8

1.6E + 06

<

14

2.8E + 06

<

TNTC

TNTC

<

<

<

0.005

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1.6E + 06

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2.8E + 06

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D2

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电镀量（毫升）

稀释

＃1 cfu

＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

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TNTC

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TNTC

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0

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0

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2.2E + 06

8.0E + 06

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抗菌1暴露培养

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电镀量（毫升）

稀释

＃1 cfu

＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

＃3平均CFU /毫升

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汇合的

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电镀量（毫升）

稀释

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＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

＃3平均CFU /毫升

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1.2E + 06

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1.6E + 06

1.6E + 06

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抗菌素2暴露培养

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D1

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电镀量（毫升）

稀释

＃1 cfu

＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

＃3平均CFU /毫升

平均CFU /毫升

性病

0.005

1个

汇合的

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汇合的

汇合的

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TNTC

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1.8E + 06

D2

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电镀量（毫升）

稀释

＃1 cfu

＃1 cfu /毫升

＃1平均CFU /毫升

＃2 cfu

＃2 cfu /毫升

＃2平均CFU /毫升

＃3 cfu

＃3 cfu /毫升

＃3平均CFU /毫升

平均CFU /毫升

性病

0.005

1个

汇合的

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2.0E + 06

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3.1E + 06

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2.6E + 06

7.8E + 05

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版权所有©20 20作者；保留所有权利。独家被许可人生物协议有限责任公司。1个

说明：logonew

确定抗微生物药物对每日采样培养物的MIC，以检测耐药性的出现。

通过从浮游种群样品中取出等份试样，并在3个单独的试管中将四分之一强度LB稀释至细胞密度为10 6 cfu / ml，从每日的化粪池样品中制备3个接种物。

按步骤E1b- E 1c中所述，在96孔板中以连续2倍稀释的目标抗微生物剂以5 × 10 5 cfu / ml的最终密度挑战这3个接种物。

在37°C下孵育24小时的96孔MIC板。

从这些一式三份定义MIC。将中间值报告为MIC（请参见表1中的示例）。

对于每种化学恒温器培养物，将MIC变化计算为采样日MIC与化学恒温器亲本MIC的比值（表1）。当注意到来自恒化器母体MIC的MIC持续> 4倍持续增加时，请考虑来自恒化器的培养物对抗菌素具有抗性。

从日常采样的多态性培养物或单个菌落中提取基因组DNA，以进行全基因组测序（WGS）分析（此处未描述）。

解冻保留的多态群体样本甘油储备的残余物，并立即使用优选的提取方法沉淀以进行gDNA分离。

或者，从LB琼脂平板上的培养物中划线，并选择单个菌落进行gDNA提取。

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实验后清理

通过从泵管上拆下介质管，断开各个化学消毒器和介质容器的连接。

丢弃培养室管，并将橡皮塞放入新的50 ml管中。

将单个的化学恒温器及其管路包裹在大的铝箔信封和高压釜中。

分别高压灭菌介质储存器及其管路。

净化后，用清水彻底冲洗所有的管材和瓶子用自来水。

再次分别对所有零件进行箔和高压灭菌，然后存放以备再用。

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数据分析

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每个小型的化学恒温器都可以指定为一种特定的处理或重复处理（例如，化学恒温器1（Ch1）–对照未暴露的培养物，重复1； Ch2 –对照未暴露的培养物，重复2； Ch3 –抗菌1暴露的培养物，重复1； Ch4 –暴露于抗菌剂1的培养物，重复2； Ch5 –暴露于抗菌剂2的培养物，重复1； Ch6 –暴露于抗菌剂2的培养物，重复2；以此类推。最小抑菌浓度（µg / ml），细胞密度（如表1-3所示，可分别收集OD 600 ）和细胞数（cfu / ml）的数据，获得所有必要的数据后，可显示出源自化石的培养物的生长和表型抗性图，如图1所示。Tonoyan等人的文章1，2019 。

由于每个数据点都依赖于先前的数据，因此从复制区域性得到的平均值不是正确的，因此复制不是独立的度量。同样，选择化学恒温器的实验是进化过程的快照，每个并行进化的文化实际上是进化的另一种情况，它将创造出不同的生长方式和不同的突变集。如果重复文化显示几乎相同的结果，您可以报告其中一个重复。如果没有导致重复的图形，您还可以在一个图形中包含这些重复项（请参见图4）。

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图4.对照（CTR）未暴露的连续培养物的生长（A）和抗性（B）图的一个例子。每天测量无抗菌选择（CTR1和CTR2）的2个平行复制培养物中抗微生物ATM1和ATM2的细胞密度（OD 600 ），活细胞数（cfu / ml）和最小抑制浓度（MIC）。MIC的倍数变化是在特定采样日获得的CTR未暴露培养物的MIC与恒化器亲本MIC的比值。

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笔记

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在所述的连续培养系统中的其他改变，可以与光合微生物广泛地使用。

蓝细菌和微藻类的生长需要额外的生长条件，例如光照，并持续提供CO 2 。在许多可用于培养的光源中，发光二极管（LED；例如，Photon Systems Instruments，LED光源SL 3500）已经成为光合作用微生物的合适选择。另外，将需要带有透明聚碳酸酯水箱的恒温水浴箱（例如，黄花忠实仪器有限公司，型号：DK-98-IV），以使光线通过系统。对于CO 2供应，可以将气泵连接到气体混合系统（例如，光子系统仪器，气体混合系统GMS 150），该系统可以产生不同气体的精确混合物。根据最佳光合作用的增长要求，可以通过设置最终气体混合物（例如，空气中2％CO 2 ）和总气体流量（1 ml / min）的适用相对组成来定义气体混合物。

菜谱

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无抗生素LB琼脂平板

根据制造商的说明进行准备

使用液体循环在121°C高压灭菌15分钟

倒入培养皿

储存在4°C以便进一步使用

甘油30％

加入30 ml≥99.5％的甘油，并用蒸馏水（dH 2 O）使最终体积达到100 ml

使用液体循环在121°C高压灭菌15分钟进行灭菌

存放在室温下以备将来使用

夸特强度的LB汤

重量27.5克LB肉汤并溶解在5 ，500毫升的卫生署2 ö

PBS ，1×

加入10 ml无菌10×PBS，并用无菌dH 2 O使最终体积达到100 ml

存放在室温下以备将来使用

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致谢

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该方案改编自先前发表的著作（Miller等人，2017和Tonoyan等人，2019）。

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利益争夺

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RF博士是Westway Health的雇员，拥有公司股份。VOF教授还拥有该公司的股份。LT博士是Westway Health的雇员。FG博士声明不存在利益冲突。

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参考文献

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Gresham，D.和Dunham，MJ（2014）。在实验进化中持续培养的持久效用。基因组学104（6 Pt A）：399-405。

Gresham，D.和Hong，J.（2015年）。恒化器中适应性进化的功能基础。FEMS微生物修订版39（1）：2-16。

Jansen，G.，Barbosa，C.和Schulenburg，H.（2013）。实验进展是剖析抗生素耐药性的有效途径的有效工具。药物抗性Updat 16（6）：96-107。

Miller，AW，Kerr，EO和Dunham，MJ（2017）。微型化学稳压器阵列的组装。Cold Spring Harb协议2017（7）：pdb prot088997。

Tonoyan ，L.，Fleming，GTA，Friel，R.和O'Flaherty，V.（2019）。在新型抗菌复合物的选择性压力下，大肠杆菌的连续培养不会导致耐药性的发展。科学代表9（1）：2401。