材料和试剂

1.移液管头（爱思进，目录号小号：T-300，T-200-Y，T-1000-B）

2.手术刀刀片（GLOBALMED ，目录号：BD001 ）

3. 1.5 ml微量离心管（Axygen ，目录号：MCT-150-C）

4.培养皿（Nunc，目录号：150466）

5. 24孔板（Nunc，目录号：142475）

6.毛细管玻璃（萨特仪器公司，目录号：B100-58-10）

7.封口膜（B é MIS，目录号：PM-996）

8.微量移液器吸头（SUTTER，目录号：BF100-50-10）

9. 3毫升塑料移液器滴管（K EHUA ，目录号：KH145 ）

10. 0.22微米注射器过滤器（G ^颖中号ALL ，目录号：RSF02 ）

11.感受态大肠杆菌DH5α（TIANGEN，目录号：CB101-02）

12. pT7TS（由提供小蓉范，南京农业大学）

13.质粒纯化Midi试剂盒（QIAGEN，目录号：12143）

14. KOD聚合酶（TOYOBO，目录号：KOD-201B）

15.琼脂糖（BIOWEST ，目录号：B21033）

16. DNA凝胶提取试剂盒（AxyGEN ，目录号：AP-GX-250）

17.限制性酶Bgl II（Takara Bio，目录号：1021A）

18.限制性内切酶Spe I（Takara Bio，目录号：D1086a）

19.限制酶Bam H I（Takara Bio，目录号：1010）

20. T4连接酶（STRATAGENE，目录号：M0202V）

21.质粒DNA提取迷你试剂盒（Axygen ，目录号：AP-MN-P-250）

22.质粒纯化Midi（QIAGEN，目录号：12145）

23. AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen ，目录号：AP-GX-250）

24.异丙醇（SCRC，目录号：80109218）

25.乙酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）

26.蛋白酶K（西格玛奥德里奇，目录号：P2308）

27.氯仿（SCRC，目录号：100068720）

28. mMESSAGE mMACHINE ®套件高产加帽的RNA转录试剂盒（Ambion公司，目录号：AM1344）

29.非洲爪哇（sh-maosheng Co.）

30.胶原酶（Sigma-Aldrich，目录号：C0130）

31.胰蛋白酶抑制剂（西格玛奥德里奇，目录号：T2011）

32. KCl （西格玛奥德里奇，目录号：P3911）

33. NaCl（西格玛奥德里奇，目录号：S7653）

34. MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）

35. HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：PHR1428）

36. CaCl 2 （西格玛奥德里奇，目录号：C1016）

37. NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761）

38. MgSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）

39. MES（西格玛奥德里奇，目录号：M3671）

40.链霉素（西格玛奥德里奇，目录号：5711）

41.氨苄西林（Sigma-Aldrich，目录号：A5345）

42.硫酸庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1914）

43.无机盐储备溶液（见配方小号）

44.抗生素股票方案（见配方小号）

45. LB培养基（见配方小号）

46. LB琼脂（见配方小号）

47. ND96溶液（CA 2+ -free）（见配方小号）

48. ND96溶液（见配方小号）

49. MBS溶液（见配方小号）

50. ķ + -免费MBS溶液（见配方小号）

51.卵母细胞分离溶液（见配方小号）

设备

1 移液器仪（Eppendorf，型号：研究®加，0.5 - 10微升，10 - 100微升，100 - 1 ，000微升）
2 离心机（Eppendorf，型号：离心机5242R）
3 热循环仪仪（Eppendorf，型号：的Mastercycler ®关系梯度）
4 水浴摇床（骏，型号：N1-13S）
5 微量移液器拔轮器（萨特仪器公司，型号：P-2000）
6 显微注射（哈佛仪器，型号：PLI-100）
7 纳米光度计（Implen ，型号：P-360）
8 pH计（梅特勒-托利多，型号：FE20K）
9 ICP-AES（安捷伦，型号：4100MP-AES）
10 解剖显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16 ）

软件

1 Microsoft Excel（Microsoft）
2 脱氧核糖核酸

程序

A pT7TS质粒的构建
1 设计引物，包括特异性核苷酸（nt ）和合适的限制酶切位点，以克隆到pT7TS载体中。通常使用的限制性位点是B gl II，Eco R V，SpeI 。
注：更多关于pT7TS矢量信息是一个在vailable网站。

2 使用KOD聚合酶通过PCR扩增靶基因。热循环条件如下：在95 ℃加热5分钟后；处理35个循环，分别是95 °C 30 s，55 °C 30 s和68 °C延伸（1 kb / min）。
3 电泳后，用手术刀刀片切下琼脂糖凝胶的靶带。
4 通过AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。
5 消化的PCR产物和载体pT7TS使用对应限制性内切酶，然后纯化由消化的PCR产物和衬里pT7TS AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒，按照制造商的说明进行操作。
6 按照制造商的说明，使用T4连接酶将消化的PCR产物克隆到线性pT7TS中。
7 将反应混合物添加到大肠杆菌感受态细胞中。DH5α在无菌条件下，在冰上孵育30分钟。
8 在42 ℃的水中分批加热细胞90 s，立即在冰上孵育2分钟，然后加入1 ml LB培养基。
9 孵育悬浮液的大肠杆菌。DH5α转化子在37 °C下放置1 h。
10 扩展500微升的悬浮液中的转化体的到LB琼脂用50氨苄青霉素毫克/毫升，然后在37孵育琼脂平板℃下过夜。
11 通过使用特定引物的PCR验证这些克隆。热循环条件如下：在95 ℃加热5分钟后；进行35个循环，分别是95 °C 30 s，55 °C 30 s和72 °C延伸（1 kb / min）。然后在72 °C下拉伸5分钟。
12 PCR验证后，将候选克隆在10毫升无菌试管中于50毫升/毫升氨苄青霉素在37 °C摇动（20 0 rpm）的条件下接种到2毫升LB肉汤中过夜。
13 按照制造商的指导，用质粒DNA提取迷你试剂盒从接种混合物中提取质粒。
14 使用相应的限制酶消化质粒。
15 序列进一步验证阳性克隆我Ñ公司（生工Biotech）连接。

B 用于体外转录的质粒分离和纯化（QANGEN）
1 从选择性平板中挑选一个菌落，并在10毫升无菌试管中于37 °C摇动（120 rpm）过夜，将其与2毫升含50毫克/毫升氨苄青霉素的LB培养基一起接种。
2 转移发酵剂培养物，并在250 ml无菌烧瓶中的50 ml / ml氨苄青霉素的50 ml LB培养基中接种，并在摇动（200 rpm）下于37 °C接种过夜。
3 转移50 ml细菌培养物，以6,000 xg f或4 °C离心15分钟，将细菌细胞收集到离心管中。
4 在离心管中加入5 ml缓冲液P1 ，并通过涡旋将细菌沉淀完全重悬。
5 加入5 ml缓冲液P2，将密封管剧烈颠倒6次，充分混合，然后在室温下孵育5分钟。
6 加入6 ml冷藏的Buffer P3，通过剧烈颠倒密封管6次使其充分混合，然后在冰上孵育15分钟。
7 在4 °C下以12,000 xg离心30分钟。将上清液转移到新管中。
8 在4 °C下以12,000 xg再次离心上清液15分钟。
9 通过使用5 ml缓冲液QBT平衡QIAGEN吸头，并通过重力流将色谱柱清空。
10 将步骤B8中的表面活性剂添加到QIAGEN吸头中，并使其通过重力流进入树脂。
11 用2 x 10 ml缓冲液QC洗涤QIAGEN-tip。
12 用5 ml QF Buffer洗脱DNA，并在1.5 ml微量离心管中收集洗脱液。
13 加入0.7体积的异丙醇以沉淀DNA。剧烈颠倒微量离心管6次，充分混合，并在冰上孵育10分钟。
14 在微量离心机中以13,000 xg离心30分钟。小心倒出上清液。
15 用1 ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀，并以12,000 xg离心10分钟。小心倾析上清液，而不会干扰沉淀。
16 干燥沉淀10分钟，并重新悬浮DNA在50微升蒸馏水中。
17 通过紫外分光光度法在260 nm下确定DNA的产率。
18 将质粒保存在-20 °C下。

C 体外转录模板的制备
1 线性化模板
注意：可以选择限制性酶（Pst I，SalI，XbaI ，BamHI ，EcoRI和Sac I ）在插入片段的下游切割。选择适当的酶，不能切割插入序列。

a 通过按以下顺序将成分添加到室温下的无菌微量离心管中来制备混合物：
双蒸水可达400微升

10 × K缓冲液40微升

质粒20 μ克

Bam H I 4微升

b 短暂离心以收集试管底部的内容物并轻轻混合，然后在30°C下孵育20-24小时。
c 加入100微升ħ 2 O，100微升乙酸钠（3 M），和600微升异丙醇，以从步骤b的混合物，在-20℃下30分钟完全和孵化混合。
d 在微量离心机中于4°C离心30分钟（13,000 x g ）。小心倒出上清液。
e 用700μl70 ％乙醇洗涤DNA模板，并在4°C下以12,000 xg离心10分钟。小心倾析上清液，而不会干扰沉淀。
f 打开管盖，干燥模板10分钟，然后用100μl蒸馏水溶解DNA 。
g 通过紫外分光光度法在260 nm下确定DNA的产率。

2 消化核糖核酸酶
a 向模板中加入200μl蛋白酶K，轻轻混合，然后在37 °C下孵育30分钟。
b 加入400μl无RNase的H 2 O，600μl氯仿，完全混合并在室温下孵育10分钟。
c 在微量离心机中于4 °C离心30分钟（12,000 xg ）。
d 小心地将上清液转移到新的无RNase的微量离心管中。
e 向试管中加入100μl乙酸钠（3 M）和600μl异丙醇，完全混合并在-20 °C孵育30分钟。
f 在微量离心机中于4 °C离心30分钟（12,000 xg ）。小心倒出上清液。
g 用700μl70 ％乙醇洗涤线性DNA沉淀，并在4 °C下以12,000 xg离心10分钟。小心倾析上清液，而不会干扰沉淀。
h 将线性DNA沉淀干燥10分钟，然后用8μl无RNase的水溶解DNA 。
i 通过紫外分光光度法在260 nm下确定线性DNA的浓度。
3 体外转录
a 通过将成分按以下顺序添加到无RNase的微量离心管中来准备转录混合物：
无核酸酶水加入20微升

线性模板DNA 1 μ克

2 × NTP / CAP 10微升

10 ×缓冲液反应2微升

RNA聚合酶酶混合物2微升

b 轻轻混合，然后在37 °C下孵育2小时。
c 电泳0.5微升到测试转录是否预期长度。
d 加入1微升TUBRO DNA酶，在37轻轻孵育混合℃下30分钟。
e 电泳0.5微升到测试是否与模板DNA消化完全地。
f 添加580微升RNA酶游离H 2 O，600微升氯仿，并在室温下完全并孵育混合10分钟。
g 在微量离心机中于4 °C离心30分钟（12,000 x g ）。小心地将上清液转移到新的微量离心管中。
h 添加10 0微升乙酸钠（3 M）和600微升异丙醇，以该管，在-20完全孵育混合° Ç 30分钟。
i 在微量离心机中于4 °C离心30分钟（12,000 x g ）。小心倒出上清液。
j 用700ml洗涤产物微升在12的70％乙醇和离心机，000 X克10分钟，在4 ℃下。小心倒出上清液，不要破坏沉淀。
k 将cDNA沉淀干燥10分钟，然后用8μl无RNase的水溶解DNA 。
l 通过紫外分光光度法在260 nm下确定cDNA的浓度。
m 稀转录产物成1 μ克/微升。储存在-80 °C 。

D 从非洲爪蟾外科切除卵巢组织
1 准备生存手术：安排装满冰块的桶进行手术；无菌手术器械，包括镊子，手术刀和剪刀；外科缝合线 95％乙醇; 用于麻醉非洲爪蟾的充冰盒；ND96培养基；P ETRI菜。
2 用网捕一只健康的青蛙。将青蛙放入盛冰的盒子中间进行低温麻醉，直到肢体运动消失。
3 轻轻地将青蛙从箱子中取出，用水清洗，将其放在冰面上，脚朝您的背面。
注意：在整个操作过程中，请确保青蛙已麻醉且皮肤表面湿润。

4 将左手的食指和中指水平呈V形放在腹部上，按使皮肤绷紧。用手术刀在腹部的右或左下象限切一个1厘米长的切口。轻轻地抽出卵巢组织（图1A ）。
5 用剪刀切除卵巢组织的一部分，在ND96培养基中孵育（图1B ）。

图1.去除卵巢组织。A.手术切除卵巢；B.卵巢组织在ND96培养基中孵育。

6 通过手术和镊子将切口从肌肉层缝到皮肤层。
7 用水清洁皮肤表面。
8 将青蛙放在容器中，并将青蛙的鼻子放在水里。
9 恢复意识后，青蛙被放回水箱。

E释放卵母细胞（图2）

图2.所示协议的流程图和时间注意事项

1 用皮氏培养皿中的镊子将卵巢分成小块（直径10厘米）。确保每块包含数十个卵母细胞（图3A ）。
2 用10 ml ND96（不含Ca 2+ ）冲洗子房3次。
3 向100 ml烧瓶中加入25 ml含96 mg胶原酶和12.5 mg胰蛋白酶抑制剂的ND96（不含Ca 2+ ）。Ť ř ansfer卵母细胞的烧瓶中。
4 将烧瓶放在水浴振荡器上。在23 °C下轻轻摇动90分钟（60 rpm）（图3B）。
5 用20 ml ND96培养基轻轻清洗卵母细胞3次（图3C ）。

图3.用胶原酶释放卵母细胞。A.消化前将子房切成小块；B.在水振动筛中消化卵泡细胞；C.消化后的卵母细胞。

6 在显微镜下，用玻璃吸管将健康且分离的卵母细胞移至一侧。将这些良好的卵母细胞转移到含有20 m l ND96培养基的干净培养皿中。并在18 °C的培养箱中孵育2小时。
注意：如果在处理过程中卵母细胞受损，则建议每种情况下使用70-80个卵母细胞。

F卵母细胞显微注射
1 准备注射微量移液器：确定移液器拔具的设置。将毛细管固定在移液器上，然后按“开始”按钮。
2 将微量移液器放入180 °C的干燥箱中5 h。
3 打开微量注射并连接到气泵。并打开氮气瓶主阀，将压力调节至0.4 MP。
4 将微量移液器插入支架。将支架固定在微操纵器的臂上。
5 在解剖显微镜下，用火焰消毒过的镊子将尖端切成10μm的直径。
6 确定微量进样的设置：进样时间为20 ms ，进样压力为180 kPa，净压力为300 kPa，平衡压力为1-5 kPa。
7 在工作区域上放置一个盖有一块无菌石蜡膜的培养皿盖。
8 调整微量移液器角度，以确保微量移液器尖端接触板并通过解剖显微镜观察。
9 将1μl无RNase的水放在封口膜上。使用微量操纵器将微量移液器吸头调节到水滴上而不会使其破裂（图4A ）。
10 按下微量注射器上的“ Full”，将水尽可能多地吸入微量移液器。
11调整微注射器的压力，以使注射量约为30 nl /卵母细胞。
12 取出并丢弃封口膜。在培养皿盖上盖上新的封口膜。
13 吸取1μl的cRNA （或不含RNase的水作为阴性对照）在封口膜上。
注意：卵母细胞注入的水和同源蛋白质并用作阴性对照。

14 反复将微量移液器吸头调整到cRNA液滴中，然后按“填充”以吸收液滴。
15 尽快提起微量移液器。取下培养皿盖，并用装有ND96介质的网状培养皿替换。
16 将卵母细胞放在培养皿的中间。
17调整显微镜的焦点和微量移液器尖端的位置，以便可以观察到尖端和卵母细胞表面（图4B ）。

图4.卵母细胞显微注射。A.将RNA吸入微量移液器；B.将RNA注入卵母细胞。

18 穿刺卵母细胞，并触摸微型注射器的脚凳，将cRNA注入卵母细胞。
19 轻轻取出微量移液器吸头，然后对剩余的卵母细胞重复上述步骤。
20 注入所有卵母细胞后，将注入的卵母细胞移至MBS溶液中。
21 在微量注射器上按“清空”以倒出微量移液器中剩余的cRNA 。
22 将卵母细胞在培养箱中的MBS溶液中于18 °C孵育30小时以表达蛋白质。

G K +释放酶测定
1 用玻璃吸管丢弃不健康，死亡，肿胀的卵母细胞。
注意：没有清晰分界线的卵母细胞已经死亡或不健康。

2 用无K +的MBS溶液清洗卵母细胞5次。
3 将5个卵母细胞轻轻移入1.5 ml微量离心机中（每个微量离心机5个卵母细胞，代表一个样品），以测量K +释放前卵母细胞中的K +浓度。
4 在每个孔中用1 ml不含K +-的MBS溶液填充24孔板。
5 轻轻吸移草移液器中的5个卵母细胞，然后轻轻地将所有5个卵母细胞调整到尖端。
6 将5个卵母细胞放在孔中，不要将溶液带入孔中（图5 ）。每个孔代表一个样品。在18 ° C孵育3 h。

图5.钾释放。在无K + -MBS溶液中孵育卵母细胞以释放钾。

7 使用3 -m升塑料管吨d ropper具有放大一个第二钝孔口克ently混合在各溶液以及不伤害的卵母细胞（视频1）。
8 将每个孔中的所有溶液转移到1.5 ml微量离心管中。将该溶液用于分析培养基中的K +浓度（视频1）。
9 将每个孔中的卵母细胞转移到装有3 ml l K + -Free MBS溶液的新孔中（视频1）。
10 轻轻清洗卵母细胞，然后转移到含有3 m L K + -Free MBS溶液的新孔中进行第二次冲洗（视频1）。

视频1.释放K +后收集溶液和卵母细胞

11 清洗5次后，用吸管轻轻吸取5个卵母细胞，然后将所有5个卵母细胞轻轻调整至尖端。将5个卵母细胞放入1.5 ml微量离心机中（每个微量离心机5个卵母细胞，代表一个样品），以测量K +释放后卵母细胞中的K +浓度。
12 ħ ø mogenize的卵母细胞（来自步骤G3和步骤G9 ）在1M升0.1N HCl中通过上下移液。
13 过滤用混悬剂Millipore滤膜（0.22 μ米）。
14 将这些用于测量卵母细胞中K +浓度的样品用0.1 N HCl以1：2的比例稀释。
15 使用4100-MP AES或4210 MP-AES系统测量溶液中的K +浓度。

H 钾+浓度测量
1 制备标准样品用不同浓度的KCl （0 μM ，10 μM ，20 μM ，40 μM ，60 μM ，80 μM ，100 μM ）
注意：添加（0 μ升，10 μ升，20 μ升，40 μ升，60 μ升，80 μ升，100 μ升）的100mM的KCl成10米升0.1N HCl中。

2 打开MP Expert软件，然后选择“新建文件夹”。
3 单击“元素”子菜单以选择被测元素及其吸收波长。
4 单击测量条件子菜单以设置检测位置，雾化压力，检测时间，泵速等。
5 单击标准样品子菜单以设置标准样品数。
6 单击订购子菜单以设置样品的数量和名称。
7 完成所有设置后，单击“保存”。
8 单击分析子菜单中的运行选项以进行测量。分别测量标准样品和样品。

数据分析

1 从4100 -MP （表1）中提取文本形式的K +含量值的原始数据。
2 在Micro soft EXCEL中打开包含原始数据的文本。
3 通过以下公式计算每个卵母细胞的K +外排：
C / N，单位：nmol /卵母细胞。C表示的测量值，单位是μ摩尔/ L; N表示Ñ每个样品中的卵母细胞的红棕色。将五倍体的K +外流取平均值，并带有标准差。

表1.用于测量K +外排能力的溶液中测得的K +浓度

样品

卵母细胞数

体积（米升）

稀释率

所测K +浓度（μ中号）

卵母细胞中的K +含量（nmol /卵母细胞）

之前

钾盐

外排

H 2 O-1

5

1个

3

104.92

62.95

H 2 O-2

5

1个

3

102.23

61.34

H 2 O-3

5

1个

3

95.67

57.40

H 2 O-4

5

1个

3

108.00

64.80

H 2 O-5

5

1个

3

104.26

62.55

LKS2-1

5

1个

3

102.85

61.71

LKS2-2

5

1个

3

99.97

59.98

LKS2-3

5

1个

3

105.12

63.07

LKS2-4

5

1个

3

101.33

60.80

LKS2-5

5

1个

3

108.86

65.32

NRT1.5-1

5

1个

3

96.80

58.08

NRT1.5-2

5

1个

3

94.78

56.87

NRT1.5-3

5

1个

3

98.45

59.07

NRT1.5-4

5

1个

3

102.70

61.62

NRT1.5-5

5

1个

3

108.31

64.98

后

3小时

钾外流

H 2 O-1

5

1个

3

95.50

57.30

H 2 O-2

5

1个

3

93.13

55.88

H 2 O-3

5

1个

3

102.48

61.49

H 2 O-4

5

1个

3

100.50

60.30

H 2 O-5

5

1个

3

94.87

56.92

LKS2-1

5

1个

3

94.26

56.56

LKS2-2

5

1个

3

98.57

59.14

LKS2-3

5

1个

3

114.96

68.98

LKS2-4

5

1个

3

96.78

58.07

LKS2-5

5

1个

3

93.26

55.96

NRT1.5-1

5

1个

3

86.04

51.62

NRT1.5-2

5

1个

3

94.43

56.66

NRT1.5-3

5

1个

3

84.73

50.84

NRT1.5-4

5

1个

3

87.56

52.54

NRT1.5-5

5

1个

3

92.93

55.76

作为阴性对照的H 2 O和LKS2分别代表注水和突变NRT1.5注入的卵母细胞。

通过以下公式计算每个卵母细胞中的K +量：
C * R / 5，单位：nmol /卵母细胞。C表示的测量值，单位是μ摩尔/ L; N表示Ñ每个样品中的卵母细胞的棕土; R代表稀释率。

平均K个+标准devia一式五份的量和灰（表2）。

表2.在K +外流之前和之后测得的卵母细胞中K +含量

小号充足

卵母细胞数

体积（米升）

所测K +浓度（μ中号）

K +外排（nnmol /卵母细胞）

H 2 O-1

5

1个

6.07

1.214

H 2 O-2

5

1个

21.14

4.228

水2 O -3

5

1个

6.26

1.252

水2 O -4

5

1个

27.21

5.442

水2 O -5

5

1个

15.83

3.166

L KS2-1

5

1个

9.86

1.972

L KS2-2

5

1个

17.23

3.446

L KS2-3

5

1个

20.48

4.096

L KS2-4

5

1个

29.53

5.906

L KS2-5

5

1个

18.42

3.684

N RT1.5-1

5

1个

86.4

17.28

N RT1.5-2

5

1个

60.51

12.102

N RT1.5-3

5

1个

59.97

11.994

N RT1.5-4

5

1个

85.6

17.12

N RT1.5-5

5

1个

81.44

16.288

作为阴性对照的H 2 O和LKS2分别代表注水和突变NRT1.5注入的卵母细胞。

菜谱

无机盐原液
用去离子水制备每种无机盐储备溶液100毫升，并在室温下保存（表3）。

表3.库存解决方案

物质

克/摩尔

库存（M）

1 M存量（g / 100 m l ）

知识联盟

74.55

1个

7.455

氯化钠

58.44

1个

5.844

氯化钙2

111

1个

11.10

氯化镁2· 6H 2 O

203.3

1个

20.33

HEPES

238.3

1个

23.83

MgSO 4 · 7H 2 O

246.47

1个

24.65

碳酸氢钠3

84.01

1个

8.401

抗生素原液
用无菌水准备抗生素储备溶液，并储存在-2 0 °C （表4）。

表4 。抗生素原液

物质

介质中的g / L

1 ，000 X原液，克/50米升

稀释系数

硫酸庆大霉素

0.1

5

1：1 ，000

链霉素

0.1

5

1：1 ，000

氨苄西林

0.05

2.5

1：1 ，000

LB培养基
将10克胰蛋白,、 5克酵母提取物和10克氯化钠溶解在900毫升蒸馏水中
用蒸馏水将体积调节至1 L
高压灭菌溶液（在115 °C下放置15分钟）
在室温下保存高压灭菌的LB培养基
使用前添加终浓度为50 mg / L的氨苄西林
LB琼脂
将10克胰蛋白,、 5克酵母提取物和10克氯化钠溶解在900毫升蒸馏水中
用蒸馏水将体积调节至1 L
将15克琼脂添加到LB培养基中
在115 °C下高压灭菌溶液15分钟
冷却至50-60 °C，并以50 mg / L的终浓度添加氨苄西林
使用无菌技术将20 ml培养基倒入10 cm培养皿中。然后在4 °C下完全冷却
ND96溶液（不含Ca 2+ ）
将2 ml的KCl储备溶液（1 M），1 ml的MgCl 2 ·6H 2 O储备溶液（1 M），5 ml的HEPES储备溶液（1 M）和5.61 g的NaCl添加到900 ml的蒸馏水中
用蒸馏水溶解并调节体积至1 L
用NaOH / HCl调节pH值至7.5
在115 °C下高压灭菌溶液15分钟
在室温下储存培养基
冷却并添加硫酸庆大霉素和链霉素，终浓度为0.1 mg / ml
ND96解决方案
加入2 ml的KCl储备溶液（1 M），1 ml的MgCl 2 ·6H 2 O储备溶液（1 M），5 ml的HEPES储备溶液（1 M），1.8 ml的CaCl 2储备溶液（1 M）和5.61克氯化钠加到900毫升蒸馏水中。用蒸馏水溶解并调节体积至接近1 L
用NaOH / HCl调节pH值至7.5
用蒸馏水将体积调节至1 L
在115 °C下高压灭菌溶液15分钟
在室温下储存培养基
使用前加入终浓度为0.1 mg / ml的硫酸庆大霉素和链霉素

MBS解决方案
加入0.82 ml的MgSO 4 · 7H 2 O储备溶液（1 M），15 ml的HEPES储备溶液（1 M），0.71 ml的CaCl 2储备溶液（1 M），2.4 ml的NaHCO 3储备溶液（1 M ），1 ml KCl储备溶液（1 M）和5.14 g NaCl加900 ml蒸馏水。用蒸馏水溶解并调节体积至接近1 L
用NaOH / HCl调节pH值至7.4
用蒸馏水将体积调节至1 L
在115 °C下高压灭菌溶液15分钟
在室温下储存培养基
使用前加入终浓度为0.1 mg / ml的硫酸庆大霉素和链霉素
无K + MBS解决方案
加入0.82 ml的MgSO 4 · 7H 2 O储备溶液（1 M），15 ml的HEPES储备溶液（1 M），0.71 ml的CaCl 2储备溶液（1 M），2.4 ml的NaHCO 3储备溶液（1 M ）和5.2 g NaCl加900 ml蒸馏水。用蒸馏水溶解并调节体积至接近1 L
用NaOH / HCl调节pH值至7.4
用蒸馏水将体积调节至1 L
在115 °C下高压灭菌溶液15分钟
在室温下储存培养基
使用前加入终浓度为0.1 mg / ml的硫酸庆大霉素和链霉素
卵母细胞分离液
将43 mg胶原酶和12.5 mg胰蛋白酶抑制剂溶于25 ml ND 96（不含Ca 2+ ）培养基中

一Ç knowledgments

我比ķ小蓉风扇（南京农业大学）为我们提供了pT7TS VECT或。我也感谢王毅（中国农业大学）的讨论和帮助。这项工作得到了国家自然科学基金（31800198），江苏省高等学校自然科学基金（18KJB180010）和江苏省高等学校优先学术计划的支持。Dascal （1987）使用了该手稿中描述的适合卵母细胞分离和注射的方案。

利益争夺

没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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3 Li H，Yu，M.，Du XQ，Wang，ZF，Wu，WH，Quintero，FJ，Jin ，XH，Li，HD and Wang，Y.（2017年）。NRT1.5 / NPF7.3充当质子耦合的H + / K +反向转运蛋白，可将拟南芥中的K +加载到木质部中。植物细胞29（8）：2016-2026。
4 Miller，AJ和Zhou，JJ（2000）。非洲爪蟾卵母细胞作为植物转运蛋白的表达系统。Biochim Biophys Acta 1465（1-2）：343-358。
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7 王Y和吴文华（2013）。高等植物中钾的运输和信号传导。Annu Rev Plant Biol 64：451-476。
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