材料和试剂

笔记：
1. 除非另有说明，所有试剂均应在室温下储存。
2. 多个部分使用的试剂在这里只提到一次。

A、总RNA和mRNA的分离
1. 2毫升SafeSeal微量离心管（Sarstedt。目录号：69500）
2. 1.5-ml TubeOne®微型离心天然管，不含RNase、DNase、DNA和热原（STARLAB，目录号：S1615-5550）
3. 碳化钨珠（Qiagen，目录号：69997）
4. 10-µl刻度针头、填充物、RNase、DNase、DNA和热原（STARLAB，目录号：S1111-3700-C）
5. 200-µl黄色针头，填充，RNase，DNase，DNA和热原（STARLAB，目录号：S1111-0706-C）
6. 1250-µl XL刻度针头，填充，RNase，DNase，DNA和热原（STARLAB，目录号：S1112-1720-C）
7. 植物组织：成功利用5周龄和2周龄拟南芥植株
8. 液氮
9. RNA清洁和浓缩器-25，带有Zymo SpinTM IIC柱（Zymo Research，目录号：R1017或R1018）
10. TRI-试剂®（Sigma-Aldrich，目录号：T9424）
注意：储存在4°C。
11. DEPC净化水（InvitrogenTM，目录号：11597065）
注：无核糖核酸酶的水（如Sigma-Aldrich，目录号：W4502）同样适用。
12. ≥99.8%乙醇/乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32221-M）
13. RNaseZapTM RNase去污溶液（InvitrogenTM，目录号：AM9780、AM9782或AM9784）

B、用于高通量总RNA分离
1. 锥形管（康宁，Falcon，产品目录号：352096和352070）
2. 组织匀浆用玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：Z250473）
3. Tris HCl pH 8.0，1 M（InvitrogenTM，目录号：AM9855G）
4. 氯化锂，8 M（Sigma-Aldrich，目录号：L7026-500毫升）
5. EDTA pH值8.0，0.5 M（Sigma-Aldrich，目录号：03690）
6. SDS（InvitrogenTM，目录号：AM9820）
7. 二硫苏糖醇（DTT，Sigma-Aldrich，目录号：43815）
8. 消泡剂A（Sigma-Aldrich，目录号：A5633-100G）
9. 5 M NaCl（InvitrogenTM，目录号：AM9760G）
10. 2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
注：存放于危险化学品柜内。
11. 无核糖核酸酶水（Sigma-Aldrich，目录号：W4502-1L）
12. 链霉亲和素共轭磁珠（NEB，目录号：S1420S）
注意：储存在4°C。
13. 生物素化聚dT低聚物（赛默飞世尔，目录号：NA）
笔记：
a。5′-bio-ACAGGACTCGTCGCTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。
b。储存在-20°C。
14. 无核糖核酸酶PCR条带（布鲁克斯生命科学，4级，目录号：4ti-0781）
15. 可选：吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379-25ML）
16. 可选Thermo Fisher 09系列产品（编号：mag-981）
17. 可选：SYBR green I（赛默飞世尔，目录号：S7563）
18. 溶解/结合缓冲液（LBB）（见配方）
19. htLBB（见配方）
20. WBA（见配方）
21. WBB（见配方）
22. LSB（见配方）
23. 1 Mβ-巯基乙醇（见配方）
24. 5毫米DTT（见配方）
25. 可选：血清（见配方）

C、用于RNA清除和cDNA制备
笔记：
a。程序C和D中的所有试剂应保存在-20°C；
b。在可能的情况下，我们建议购买试剂作为溶液而不是粉末，以尽量减少使用前的操作，并有助于防止核糖核酸酶污染。
1. Dynabeads®Oligo（dT）25（Thermo ScientificTM，目录号：61002）
2. 随机十聚物（50µM）（InvitrogenTM，目录号：AM5722G）
注：随机引物混合物（新英格兰生物实验室，目录号：S1330S）也可作为替代品。随机引物组合可以提供稍微更好的覆盖整个编码序列。
3. RNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂（InvitrogenTM，目录号：10777019）
4. DNase I重组，无RNase（罗氏，目录号：04716728001）
注意：去除大量的DNA污染行动或者是无涡轮DNATM公司配套元件（InvitrogenTM，目录号：AM1907）可以使用。
5. 高保真聚合酶（Thermo-ScientificTM，Phusion，目录号：F534L）
6. 高保真逆转录酶（InvitrogenTM，上标III，目录号：18080093）
可选：对于某些应用，可使用保真度较低的逆转录酶（例如，RevertAid，Thermo ScientificTM，目录号：K1622）可大大节省成本。
7. dNTP混合物，每个25 mM（Thermo-ScientificTM，目录号：R1121）
8. 大肠杆菌DNA连接酶和缓冲液（新英格兰生物实验室，目录号：M0205S/L）
9. 大肠杆菌DNA聚合酶I（新英格兰生物实验室，目录号：M0209S/L）
10. RNaseH（新英格兰生物实验室，目录号：M0297S/L）
11. 大肠杆菌Exonules I（）新英格兰生物实验室，目录号：M0293S/L
12. 无RNase A、DNA酶和蛋白酶（10 mg/ml）（Thermo-ScientificTM，目录号：EN0531）
13. 安瓿XP珠子（Beckman Coulter，目录号：A63880）
14. Qubit dsDNA HS分析试剂盒（InvitrogenTM，目录号：Q32851或Q32854）

D、用于标记库准备
1. Nextera DNA文库准备试剂盒（Illumina，目录号：FC-121-1030）
注：已停止使用，第2项（以下）中列出的试剂为替代品。
2. Illumina标记DNA TDE1酶和缓冲试剂盒（Illumina，目录号：20034197或20034198）
3. NEBNext®高保真2×PCR主混料（新英格兰生物实验室，目录号：M0541S/L）
4. KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（2×）通用（罗氏，目录号：KK4600、KK4601、KK4602或KK4618）
5. 水龙头NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：T5130）
6. MgCl2（Sigma-Aldrich，目录号：M1028）
7. PEG 8000（Sigma-Aldrich，目录号：1546605）
8. 自制5×标记缓冲液（见配方）

E、用于库索引
1. 定制设计的Illumina测序兼容指数引物，由Sigma合成（补充）

设备

1. 组织匀浆机（SPEX样品制备，Geno/研磨机）
注：Qiagen TissueLyser也成功使用：样品板在研磨过程中应旋转一半，以确保研磨均匀。
2. 涡流混合器（任何品牌）
3. NanoDropTM 8000分光光度计（Thermo-ScientificTM，目录号：ND-8000-GL）
4. 2100生物分析仪系统（安捷伦，目录号：G2939BA）
5. 4150 TapeStation系统，可选（安捷伦，目录号：G292AA）
6. 大尺寸磁纯（Chemicell，目录号：MP-20）
7. 1.5-ml管旋转混合器（SoCal-BioMed，Waverly，目录号：RT1-E）
8. Magwell 96井磁选机（EdgeBio，目录号：57624）
9. 板式搅拌机（科学工业，Genie，目录号：Si-0400A）
10. 微型离心机（Thermo-ScientificTM，MicroCL 17，目录号：75002450）
11. 带式离心机（任何品牌）
12. PCR机（任何可编程热循环器）
13. 96孔微型板加热块，可选（任何品牌）
注：首选单温孵育步骤。
14. 多通道移液管，0.5-10µl（Eppendorf，目录号：ES-12-10）
15. 多道移液管，30-300µl（Eppendorf，目录号：ES-12-300）
16. QubitTM Flex荧光计（InvitrogenTM，目录号：Q3327）
17. 实时定量PCR机，这里我们使用CFX96触摸式实时PCR检测系统C1000 TouchTM（BioRad）

程序

笔记：
1. 程序A-D是使用Tn5制备mRNA序列文库的标准方案。有关哪些步骤可以暂停或自定义的详细信息也将作为附加注释进行指示。步骤E用于高通量RNA序列文库的制备。已经熟悉程序A-D的所有步骤并对处理大量RNA-seq样本有信心的用户可以从程序E开始他们的库准备。
2. 对于涉及RNA或mRNA的所有步骤，请确保所有表面清洁（例如，使用RNaseZapTM RNase去污溶液清洁工作台表面）。所有与核酸接触的试管和针头应为无核酸酶级。

A、总RNA分离
这里我们以5周龄的拟南芥植株为例，在22°C的短日照（10小时光照/14小时黑暗）下生长。
1. 为了获取材料，快速、轻轻地将组织折叠到预先标记的含有2个均质化碳化物颗粒的2ml试管中，然后在液氮中冷冻组织。每株植物的两片完全展开的叶子和每个基因型和处理的3株植物（共6片叶子）作为一个样本（Ding等人，2020年）。
笔记：
a。为了减少样本量和工作负荷，对每个样本进行了2片叶子的测试，并与该方案进行了比较。
b。如果与较年轻的拟南芥一起工作，每个样本大约2个幼苗或20-100毫克（新鲜重量）植物组织效果良好。
c。如果需要更多的起始物料，以下所有步骤都可以按比例放大.
d。使用液氮时，请务必使用护目镜。
2. 在液氮中预先冷却的Geno/Grinder块中研磨组织：30/s频率下的单个30-s脉冲就足以处理叶片材料。在得到细磨组织的粉末后，在液氮中重新冷冻。
笔记：
a。在装载样品进行研磨时，保持块体在液氮中是有帮助的。
b。研磨条件可能因组织而异。0.5-1分钟25分钟研磨-30/s的频率通常足够，但应目视评估样品是否均匀化为细粉末。
3. 向每根试管中加入800毫升预冷TRI-Regent®溶液，盖上盖子，用涡流混合器快速地重新喷射纸巾粉。在冰上孵育3分钟。
注意：打开管道时要小心避免爆炸样品。
4. 再次将样本从泥浆中旋入均质溶液中。
5. 将所有样品在冰上再培养5分钟。从这一步开始，在室温下工作。
注：如果使用多个样本，则一次处理3到4个样本进行两步涡流，以尽量减少RNA降解。
6. 在台式离心机中以10000×g的速度旋转所有管8分钟。
7. 在等待离心的同时，准备与步骤A1中相同数量的新鲜2ml试管。贴上标签并向每根试管中加入400µl≥99.8%的EtOH。
8. 从每根试管中取400µl上清液，放入预先填充有EtOH的相应的2毫升新试管中。轻轻翻转试管几次，使样品混合，直到所有样品均化。
笔记：
a。剩余上清液可在-70或-80°C下储存作为备用样品。
b。可调节上清液的体积；应调整EtOH的体积，使其与上清液的体积相等。
9. 结合RNA：将混合液转移到Zymo SpinTM IIC柱中，在10000×g下离心30秒，丢弃流动。
10. 洗涤柱：加入250µl RNA洗涤缓冲液，10000×g离心30秒，丢弃流动液。
11. 去除基因组DNA（gDNA）：对于每个要处理的样本，在无RNase的试管中制备DNA酶I反应混合物。轻轻倒转搅拌均匀。将80µl混合物转移到每个柱上，关闭盖子并在室温（20-30°C）下培养15分钟。
组分体积（1反应）
DEPC处理水69µl
RNaseOUTTM（40 U/µl）1µl
DNaseI培养液（10×8µl）
重组DNA酶I，无RNase（10 U/µl）2µl
80µl/每管
笔记：
a。如果你有多个RNA样本管，通过复用标准的DNA酶I反应混合物来制作一个主混合物；另外加10%。
b。如果在程序B后持续发现大量的gDNA污染（例如，通过PCR），TURBO-DNase可用于更高效的DNA去除，根据制造商的协议。
12. 洗涤柱：加入400µl RNA洗涤缓冲液，10000×g离心30秒，跳过流通丢弃步骤。
13. 最后洗涤：加入200µl RNA洗涤缓冲液，在10000×g下离心2分钟，确保洗涤缓冲液完全去除。小心地将色谱柱移入1.5毫升的试管中，并丢弃流过的收集管。
14. RNA洗脱：直接向柱基质中加入50µl DEPC处理水，10000×g离心30 s。
注：或者，对于高浓度RNA，使用≥25µl无核酸酶水或DEPC处理水。
15. 用纳米滴分光光度计测量RNA浓度。
笔记：
a。洗脱的RNA应保存在冰上。
b。可选的断点：RNA可以储存在-70~-80个摄氏度长达数周；
c。可选项：只要有可能，总RNA的质量可在高灵敏度设备上进行评估，该设备配有相应的兼容RNA芯片/试剂和专为植物RNA设计的程序，例如安捷伦公司的生物分析仪2100或TapeStation 4150。来自Aglient机器的RNA电泳图谱提供RNA完整性数（RIN）。RIN大于6的RNA可用于构建高质量的NGS文库。

B、从总RNA中提取mRNA
注：在冰上执行所有步骤，除非另有说明，尤其是那些影响mRNA的步骤。
1. 准备好Dynabeads®低聚果糖（dT）25：使用前，通过移液管或轻轻旋转使Dynabeads®低聚果糖（dT）25重新悬浮。
注意：在容器底部不应出现串珠，且溶液在移液管尖端应呈均匀状态。从储存容器开始，这需要几秒钟的缓慢混合；对于体积较小的后续步骤（通常为5-10个完整的上下吸管周期）将导致完全的珠子再悬浮.
2. 对于每个样品，将10µl悬浮微粒（适用于2-10µg拟南芥总RNA，如果需要，可调节体积）转移到无RNase的1.5-ml微型离心管上，并将试管放置在磁铁上（例如，磁纯）。
注：此步骤也可在兼容磁铁上的PCR条带中执行。
30秒后（或悬浮液澄清后），去除上清液。
4. 清洗珠：从磁铁上取下试管，并在Dynabeads®Oligo（dT）25试剂盒提供的50-100µl新鲜溶解/结合缓冲液中重新悬浮珠子。将悬架放回磁铁上。
5. 30 s后（或悬浮液清澈时），从清洗的Dynabeads中去除上清液（溶解/结合缓冲液）。
6. 从磁铁上拆下微型离心管。
7. 在300µl DEPC处理过的水（高达33 ng/µl）中添加10µg分离的总RNA到小球上，并通过移液管完全重新悬浮小球。
8. 将试管放入旋转混合器中，在室温下连续搅拌3-5分钟，使mRNA的polyA尾部与珠上的寡糖（dT）25杂交。
9. 将悬浮液放回磁铁上2分钟，收集珠子/mRNA并去除上清液。
10. 在室温下，用Dynabeads®Oligo（dT）25试剂盒提供的600µl洗涤缓冲液A将珠子/mRNA复合物洗涤两次。在每次清洗步骤中，完全重新喷涂珠子，并使用磁铁将珠子从溶液中分离出来。
11. 用Dynabeads®Oligo（dT）25试剂盒提供的300µl洗涤缓冲液B清洗珠子/mRNA复合物一次。将珠子完全再悬浮，并使用磁铁将珠子从溶液中分离出来。
12. 洗脱mRNA：添加20µl 10 mM Tris HCl pH 7.5（洗脱缓冲液）并在65-80°C（水浴或加热块）下培养2分钟。立即将试管放在磁铁上，将含有mRNA的上清液转移到新的无核糖核酸酶试管中，并将该试管置于冰上。不要丢弃珠子。
笔记：
a。在这一步中，热融化低聚体（dT）25的mRNA。如果样品在转移前冷却，mRNA重新结合到寡聚体（dT）25上，产量降低。可以重新加热样品以重新释放mRNA；
b。在这一步，通常大部分核糖体RNA（rRNA）将被移除。然而，对于任何一个cDNA文库的构建，应避免任何可追溯的cDNA文库的污染。以下步骤确保了RNA序列cDNA文库的纯度。
13. Dynabeads®Oligo（dT）25的重复使用：在洗涤缓冲液B中清洗两次珠子（与步骤B11相同）。每次清洗时完全重新喷涂珠子。
14. 用80µl裂解/结合缓冲液（4倍体积）稀释洗脱的mRNA。
15. 开始第二次mRNA纯化：从珠子中去除洗涤缓冲液B的第二次洗涤，并加入稀释后的mRNA。
16. 在室温下混合培养3-5分钟。
17. 重复步骤B4至B12，最后在pH值为7.5的10µl 10 mM Tris HCl中洗脱RNA。
笔记：
a。可选断点：mRNA可在-70～-80保存摄氏度长达数周；
b。保留另外10µl的m核糖核酸在-70~-80之间摄氏度冷冻柜作为备用。

C、双链cDNA的合成
注：在冰上执行所有步骤，除非另有说明，尤其是那些影响mRNA的步骤。
1. 将以下成分作为混合物I添加到PCR带中：

组分体积（1反应）
随机十氯醚（50µM）或随机底漆混合物（60µM）1µl
纯化的mRNA（来自程序B或程序E）10µl
2. 将RNA变性至二次冰上至少5分钟，然后立即将其转移到二次冰上。
3. 通过短暂离心收集试管中的内容物，并添加混合物II：
组分体积（1反应）
DEPC处理水1µl
5×上标III第一股缓冲液4µl
0.1米DTT 1微升
10 mM dNTPs混合物1µl
RNaseOUTTM（40 U/µl）1µl
上标TM III RTase（200 U/µl）1µl
9µl/每管
注意：配方提供d表示最终体积为20µl。如果mRNA的产量足够，在10µl的反应中，所有体积可以减半，而不会损害第一链cDNA的产量或质量。
4. 通过移液管和短暂离心混合后，按照以下程序将PCR条带装入热循环器中：
温度时间
25 °C 5分钟
50 °C 60分钟
70 °C 15分钟
笔记：
a。选择性断裂点：由mRNA合成的第一链cDNA可储存在-20摄氏度几个月了。
b。以下步骤只使用10µl的第一链cDNA，剩余部分保留在-20内摄氏度冷冻室备用。
5. 制备以下第二链cDNA合成混合物：
组分体积（1反应）
DEPC处理水28µl
10×大肠杆菌DNA连接酶缓冲液5µl
25×添加剂（500 mM Tris HCl，25 mM MgCl2）2µl
核糖核酸酶（0.5 U/µl）1µl
大肠杆菌DNA聚合酶I（10 U/µl）2µl
大肠杆菌DNA连接酶（10 U/µl）1µl
10毫米dNTPs 1微升
40µl/每管
混合物的最终体积为50µl。
6. 在16°C下培养反应h.2。
7. 向PCR条带的每个孔中添加1µl外显子（Exo）I（20 U/µl），以耗尽多余的随机十聚体/引物。
8. 在37°C下培养30分钟。
9. 终止pH值为8.0μM（EDT）的反应。
10. 添加1µl 10 mg/ml RNase A。
11. 在37°C下培养30分钟以降解所有残余RNA。
12. 将20-µl的ds-cDNA转移到1.5-ml试管中（无DNase）。
笔记：
a。可选断点：ds-cDNA可储存在-20摄氏度几个月了。
b。剩下的储存在-20摄氏度作为备份。
13. 轻轻旋涡安瓿XP，以恢复沉淀的磁珠。向cDNA中添加36µl安瓿XP珠（1.8×输入cDNA体积）。
注：安瓿XP珠根据ABR缓冲液的浓度选择性地结合核酸大小（它们被储存在其中），因此遵循体积比是至关重要的。
14. 混合安瓿XP，用移液管彻底取样（混合>10次）。
15. 在室温下孵育5分钟。
16. 将反应管放在磁架上2分钟，从溶液中分离出小球，并去除上清液。
注：为避免与珠子结合的cDNA丢失，保留5µl体积（例如，去除51µl）。
EtOH清洗：在磁铁架上添加200µl 70%EtOH。室温下孵育30秒，无需再投珠。完全清除并丢弃乙醇。
18. 重复洗两次。从磁铁架上拆下管子。
19. 洗脱：加入≥25µl 10 mM Tris HCl pH 7.5（洗脱缓冲液），通过移液管彻底混合。
笔记：
a。建议上下吸管20次，完全混合；
b。使用少于25µl的洗脱缓冲液可能会导致洗脱效率降低。
20. 室温下孵育2分钟。
21. 将反应板放置在磁铁架上1分钟，以将珠子从溶液中分离出来。
22. 将纯化的ds-cDNA转移到新鲜的1.5ml试管或条带中（不含DNase）。
23. 按照商业推荐的方案，使用Qubit Flex荧光计中的dsDNA-HS检测试剂盒测量cDNA浓度。
注：可选断点。纯化的ds-cDNA可在-20℃保存摄氏度几个月了。

D、 cDNA标记文库的制备
笔记：
a。将所有样品和产品一直放在冰上，除非它们在热循环器中。
b。协议可以在本节的每个步骤之后暂停；产品存储在-20摄氏度.

1. 将cDNA稀释至所需浓度
注：标记反应至少有四个参数（起始cDNA、Tn5量、孵育时间和可选的PEG-in反应），这些参数可以优化以获得最小PCR周期的可接受文库大小范围。我们在这里提出两种可能性：一种是下面的（劳动密集型，以尽量减少放大步骤），另一种是用于高通量的库准备（程序E，每个库所需时间缩短，一般可接受的产量，图1）。这些应该提供合理的起点，但不能完全取代理想条件下的优化。关于参数的更完整的探索，见Picelli等人。（2014年）。

图1。不同的反应条件可以得到可接受的库大小分布。显示的是来自两个极端的DNA浓度（A）0.1ng或（B）2ng标记的cDNA的生物分析仪痕迹，分别用16或10个周期进行PCR。每次反应在55°C下用0.1 l Tn5进行7分钟。在（B）中的反应是在8%聚乙二醇存在下进行的。大多数文库的大小应该在300-500bp之间，因为大于这个值的片段不能很好地测序，小于这个风险偏好测序的片段。μ

2. 按下表所示，在PCR条带或板的每个孔中制备标记和小份的主混合物：
组分体积（1反应）
无核酸酶水3.4µl
照明菌DNA TDE1酶0.1µl
Illumina Tagment DNA TDE1缓冲液0.5µl
4µl/每口井
每次反应加入1µl ds cDNA（1ng/µl），最终标记体积为5µl。
3. （可选断点）在55°C下培养反应混合物5分钟。反应结束后，立即将试管放在冰上。
4. 扩增转座的cDNA片段：在每个cDNA标记产物（5µl）中加入10µl 2×NebNex PCR主混合物到PCR条带或板的每个孔中。将条形码配对引物P7-i和P5-j添加到条带中的每个管中。
组分体积（1反应）
标记反应5µl
NEBNext PCR主混料10µl
10µM P7-i（i=1,2，…）2.5µl
10µM P5-j（j=1,2，…）2.5µl
5. 按照预PCR循环程序将反应混合物加载到热循环器中：
时间温度
1个循环 5分钟 72 °C（填隙）
30秒 98 摄氏度
5个周期 10秒 98 摄氏度
30秒 63 摄氏度
1分钟 72 摄氏度
（可选断点）
6. 采用实时定量PCR（RT-qPCR）技术，以最少的PCR重复次数确定最佳文库产量的周期数。制备qPCR混合物，如下表所示：
组分体积（1反应）
无核酸酶水4µl
2×KAPA快速qPCR混合物5µl
10µM P5-i 0.25µl
10µM P7-j 0.25µl
PCR前cDNA文库混合物（每个）1µl
笔记：
a。P5-i和P7-j是与每个pre-PCR cDNA文库组合中使用的相同的引物；
b。其他质量控制方法也可用于确定产生最终cDNA-NGS文库所需的附加周期。
7. 使用以下程序在RT qPCR机器上加载反应混合物。根据每个样品的相对荧光单位（RFU）曲线，在最大RFU的1/3处画一条水平线，在交叉处画一条垂直线，横过表示循环数的轴（图2，高质量预放大步骤）。这个数字是应用于PCR前产物以生成最终cDNA文库的附加循环数（Buenrostro等人，2015年）。
时间温度
40个周期 10秒 98 摄氏度
30秒 63 摄氏度
1分钟 72 摄氏度
8. 用确定的循环数进行二级库放大。
时间温度
确定的周期（我们的经验是5-15个周期） 10秒 98 摄氏度
30秒 63 摄氏度
1分钟 72 摄氏度
9. 按照步骤C13-C22用安瓿XP珠纯化cDNA文库。（可选断点）
10. 使用生物分析仪高灵敏度DNA分析，按照标准商业协议分析文库的数量和质量。使用等摩尔比和相似大小分布的cDNA文库进行复合，并在所需的Illumina测序平台上使用适量的NGS（遵循测序机构的指示）。

E、 mRNA分离的替代方案
当要制备24个以上的样品时，使用多重RNA提取是有益的。以下协议改编自HT-Seq和BrAD-Seq协议（Kumar等人。2012；Townsley et al.，2015），一天内可轻松容纳48个组织制备样品，通过ds cDNA合成。图2提供了mRNA提取的示意性指南。

图2。带标记的图书馆准备示意图

1. 将组织收集到含有研磨珠的2毫升试管中，在液氮中快速冷冻。组织建议与程序A相同。
注意：两到四个4毫米的玻璃珠也适用于研磨。
2. 制备htLBB：如果使用高达50毫克的组织，则每个样本允许约1毫升htLBB。如果事先制备，让htLBB加热至室温，并在添加至样品之前添加5µg/µl 2-巯基乙醇。请勿将htLBB与2-巯基乙醇储存在一起。–
3. 在液氮冷却Geno/研磨机块中研磨：研磨条件如程序A所述。
4. 用htLBB重新研磨样品：向植物粉末中添加体积相近的室温htLBB，将样品移到室温块中，再次研磨1分钟。不要让样品冻结。
笔记：
a。对于两个拟南芥幼苗，添加~450µl htLBB：过量的htLBB不是问题，但过少的htLBB会干扰mRNA的提取；
b。如果有多套Geno/Grinder试块可用，换成新的一套有助于避免样品冻结。
5. 在室温下培养约5分钟。
6. 在室温微离心机中放置颗粒植物碎片，~16000×g，10min。在旋转过程中，标记五组8孔PCR条带：两组用于裂解液，一组用于磁珠，两组用于连续RNA洗脱。
7. 将上清液等分到PCR条带中：2×200µl。一组带向前移动，另一组在-70至-80°C下备用。
注意：小球并不是完全固态的建议立即使用第一份清洁上清液。
8. 向活性条中添加1µl 12.5µM生物素化低聚物dT。利用多道生物素分液管和多个生物素分液管将样本分配到主样本管中。
9. 在室温下孵育10分钟。
10. 培养期间，用链霉亲和素磁珠制备条带（第三组）。将20µl链霉亲和素珠状浆液分配到每根管上并放置在磁铁上。当珠子沉淀后，取出珠子储存缓冲液，并在100µl htLBB中完全再悬浮。
笔记：
a。再次使用主混合条和多通道移液管是有帮助的。
b。珠子容易沉淀：每隔几根管子分配完后，用吸管以中等速度旋转，再使原料重新冷却。
11. 生物素孵育完成后，将htLBB磁珠条放在磁铁上，去除上清液（htLBB），并在磁珠上添加200µl裂解物低聚dT混合物。
12. 在室温下混合培养10分钟。
注：对于混合，建议使用平板混合器，但也可以将平板粘在设定为1400/min的1.5 ml试管培养箱混合器上，或以最小速度粘到漩涡上。
13. 混合完成后，短暂地旋转条带，从盖子上去除溶解物/珠状混合物，将条带放入磁架中，收集珠子2分钟。
14. 去除上清液，加入200µl冰镇WBA，用吸管吸匀，使珠子完全再悬浮。
笔记：
a。上清液可以丢弃或保存如果需要的话提取DNA。
b。它可以提高mRNA的稳定性，以保持清洗缓冲液，分配容器，和磁架在冰上，但这不是必要的。
15. 将试纸条放回磁架中收集珠子，去除上清液（WBA），加入200µl冰镇WBB，用吸管吸干，使珠子完全再悬浮。
16. 将试纸条放回磁架中收集珠子，去除上清液（WBB），加入200µl冰镇LSB，用吸管吸干，使珠子完全再悬浮。
17. 将试纸条放回磁架中收集珠子，去除上清液（LSB），添加15.5µl室温10 mM Tris HCl，并用移液管充分重新悬浮珠子。
18. 在80°C下培养珠子2分钟。
注意：在加热过程中，通过置于温水浴或温水下。
19. 从加热块上取下金属条，放在磁架上，然后立即将15µl的金属条取出（第四组）。
注：在这一步中，加热使低聚体（dT）25的mRNA熔化。如果样品在转移前冷却，mRNA重新结合到寡聚体（dT）25上，产量降低。重新加热样品以重新释放mRNA是可能的。
20. 在100µl WBB中再悬浮珠子。
21. 制作DNase主混合：
组分体积（1反应）
DEPC处理水5µl
RNaseOUTTM（40 U/µl）0.5µl
DNAseI培养液（10×2.5µl）
重组DNA酶I，无RNase（10 U/µl）2µl
10µl/每管
22. DNase I消化：向15µl mRNA中加入10µl反应混合物，37°C孵育20分钟。
注：并非所有组织都需要DNase培养。优化时，考虑跳过DNA酶培养和RNA中DNA污染的检测（例如，通过针对gDNA的PCR）。如果没有检测到明显的gDNA污染，可以跳过DNase处理；仍建议进行第二轮纯化以去除rRNA污染。
23. DNase I灭活：每次反应加入1.5µl EDTA，敲打混匀，75°C孵育10分钟。
24. 在脱氧核糖核酸酶失活期间，从珠中丢弃WBB（步骤E20），并在新鲜WBB中重新使用微珠。
25. 立即将板条转移到冰上；培养至少2分钟。
26. 向25µl DNase反应中添加175µl htLBB。
27. 丢弃第二次WBB洗涤液，并在htLBB中的200µl DNA酶处理RNA中重新悬浮小球。
28. 重复步骤E12-E19，在10µl 10 mM Tris HCl中进行最终洗脱，进入第五组标记条带中。
注：mRNA的产量可以用纳米滴分光光度计来估算。产率应为20-30 ng/µl，具有干净的峰，260/280在2-2.2范围内，260/230约为2。测试表明基本上没有rRNA污染，gDNA污染通常在0.1-1ng范围内，大多数样本接近0。1纳克。
29. 文库制备的其余步骤（第一和第二链cDNA合成，标记）可大致按照程序C和D进行，调整如下和图3所示。

图3。高通量mRNA分离示意图

a、第一链和第二链cDNA的合成可以在PCR条带中重复进行。可以跳过核酸外切酶和核糖核酸酶A的步骤，因为这些污染物将通过随后的安瓿/血清净化步骤基本去除。
b、高通量dsDNA定量：与Qubit中的ds-cDNA定量不同，可以使用SYBR-green在黑色96孔板中使用标准板读取器来估计浓度（Leggate等人，2006）。简而言之：在96孔板中混合1-2µl ds cDNA和1µl 100x SYBR绿。在黑暗中孵育>1分钟，然后在485 nm处激发并在535 nm处测量荧光。0-10 ng/µl的标准曲线可由已知浓度的商用DNA制剂（如DNA梯状物、小牛胸腺DNA）制成，并可用于估算样品浓度。
c、高通量安瓿清洁：对于早期步骤，安瓿可以用自制的“Serapure”代替（DeAngelis等人，1995年；Fisher等人，2011年；Lundin等人，2010年；Rohland和Reich，2012年）。
注意：“Serapure”的成本明显低于安瓿，但在大约1-2周后会失去稳定性，因此不建议在最后的纯化步骤中使用。
d、为了减少文库扩增所需的PCR周期而不优化每个文库，增加ds-cDNA的起始量，并在反应混合物中加入PEG。
组分体积（1反应）
ds cDNA（2 ng/µl）1µl
5×自制标记缓冲液1µl
照明菌DNA TDE1酶0.1µl
40%聚乙二醇8000 1µl
无核糖核酸酶H2O 1.9µl
5µl/每管
标记7分钟，而不是5分钟。在这些条件下，10个扩增周期对于大多数没有过度扩增的库来说就足够了。未经充分放大的任何样品可通过程序D中概述的两步程序进行放大。自制标记缓冲液的制备如Picelli等人，2014年，使用TAPS和MgCl2（见配方）。
e、对于库QC，在标准琼脂糖凝胶上可视化，并使用平板阅读器和SYBR染料进行定量。使用这些结果来确定哪些库需要重新准备并设计池。在生物分析仪上只测试最终的集合库进行测序。

食谱

1溶解/结合缓冲液（LBB）1溶解/结合缓冲液（LBB）
解决方案组件50毫升储备溶液体积
100毫米Tris HCl 1 M pH 7.5 5毫升
0.5 M氯化锂8 M 6.25毫升
10 mM EDTA 500 mM pH 8 1毫升
1%盖子20%w/v 2.5 ml
5毫米DTT 1米250微升
不含核糖核酸酶的水到50毫升
2. htLBB公司
笔记：
a。1 Mβ-巯基乙醇（配方6）应在使用前立即添加到LBB中：5µl/ml。
b。如果使用预先准备好的LBB，在室温下至少30分钟，使消泡剂A升温。
以大约9µl/mg或450µl的推荐样本量添加LBB。
解决方案组件50毫升储备溶液体积
100毫米Tris HCl 1 M pH 8 5毫升
1 M氯化锂8 M 6.25毫升
10 mM EDTA 500 mM pH 8 1毫升
1%十二烷基硫酸钠20%w/v 2.5 ml
5毫米DTT 1米250微升
消泡剂A 750µl
不含核糖核酸酶的水到50毫升
3. WBA公司
解决方案组件50毫升储备溶液体积
10 mM Tris HCl 1 M pH值8 500µl
150毫米氯化锂8米940微升
1毫米EDTA 500毫米pH 8 100微升
0.1%十二烷基硫酸钠20%（w/v）125µl
不含核糖核酸酶的水到50毫升
4. WBB公司
解决方案组件50毫升储备溶液体积
10 mM Tris HCl 1 M pH值8 500µl
150毫米氯化锂8米940微升
1毫米EDTA 500毫米pH 8 100微升
不含核糖核酸酶的水到50毫升
5. LSB公司
解决方案组件50毫升储备溶液体积
10 mM Tris HCl 1 M pH值8 500µl
150毫米NaCl 5米1.5毫升
1毫米EDTA 500毫米pH 8 100微升
不含核糖核酸酶的水到50毫升

6. 1 Mβ-巯基乙醇
解决方案组件100µl储备溶液体积
1 M 2-巯基乙醇14.3 M 7µl
无核糖核酸酶H2O 93µl

7. 5毫米DTT
解决方案组件4毫升的储备量
二硫苏糖醇（粉末）--2.08 g
无核糖核酸酶H2O至4毫升

8. 六翼天使
解决方案组件50µl的库存量
PEG 8000——9克
NaCl 5 M 10毫升
Tris HCl，pH值8.0 1 M 500µl
EDTA，pH值8.0 5 M 100µl
无核糖核酸酶H2O——至49毫升
吐温20--27.5µl
血清mag速溶珠——1毫升（用TE缓冲液洗涤两次）

9. 5×标记缓冲液（Picelli等人，2014）
解决方案组件5毫升的储备量
50 mM水龙头NaOH pH 8.5 1 M 250µl
25毫米氯化镁5米10毫升
过滤消毒、等分、冷冻

致谢

MB承认欧盟地平线2020研究与创新计划在Marie Skłodowska-Curie Actions（赠款协议：703954）下的支持。KK感谢欧盟“地平线2020”研究与创新计划在Marie Skłodowska-Curie重返社会奖学金（赠款协议：790057）下提供的支持。捷克实验室的研究得到了盖茨比慈善基金会、苏黎世大学、欧洲研究理事会（赠款协议：773153）和瑞士国家科学基金会（赠款协议：31003A_）的支持。PD感谢Marie领导下的欧盟地平线2020研究与创新计划的支持。Skłodowska-Curie Actions（赠款协议：656243）和来自生物技术和生物科学研究理事会的未来领导人研究金（赠款协议：BB/R012172/1）。
本文提出的高吞吐量协议是在已发布的HTR和BrADseq协议的基础上改进的（Kumar等人，2012年；Townsley等人，2015年）。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的利益要宣布。

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