材料和试剂

1.用于dSTORM样品制备和成像的8孔ibidi µ-载玻片（Ibidi ，目录号：80827）
2. 42 x 28 x 6 mm的活检盒（Leica Biosystems，ID：IP-活检盒-III）
3.金属基础模具（Leica Biosystems，ID：金属基础模具）
4.通过聚-L-赖氨酸处理的带电载玻片，用于共聚焦成像样品制备和成像，例如ProbeOn Plus（Fisher Scientific目录号：22-230-900或Polysine TM显微镜粘附载玻片（Thermo Scientific目录号：J2800AMNZ））
5.铝箔（您可以从当地商店购买）
6.该玻片，矩形，24×60毫米，＃1.5厚度（Knittel玻璃，目录号：425-2460）
7.容量为1.5 ml或2 ml的Eppendorf Safe-lock微量离心管（Eppendorf，目录号：022-36-320-4 [1.5 ml]，022-36-335-2 [2 ml]）
8.纸板滑动托盘（Heathrow Scientific ，目录号：HD9902）
9.纸巾（Divers / Dutcher，目录号：475040）
10.空的移液器吸头盒，用于放置ibidi µ- slide的自制加湿室，例如Adamas-Beta 1,000 µl容量吸头
11.丁腈手套，例如Fisherbrand TM Comfort丁腈手套（Fisher Scientific，目录号15642367 ）
12.国家诊断TM Histoclear TM组织清除剂（Fisher Scientific公司，HS-200-1GAL ，CAS号：5989-27-5）
13.包埋中石蜡（Leica Biosystems，ID：em-400-embeddding-medium-paraffin ）
14. Oxoid脱脂奶粉（Thermo Fisher Scientific，目录号：LP0031B）
15. CMB3a结晶纤维素结合模块，带有组氨酸标签的重组CBM蛋白（PlantProbes ，目录号：CMB3a）（Blake等，2006； Hernandez-Gomez等，2015），储存在-20 °C
16.抗低酯化高半乳糖醛酸聚糖（甲基酯化度（DM）高达40％）的小鼠单克隆抗体2F4（PlantProbes ，目录号：2F4）（Liners，Thibault和Van Cutsem，1992），储存在4 °C
17.针对高酯化同型半乳糖醛酸聚糖LM20的大鼠IgM单克隆抗体（PlantProbes ，目录号：LM20）（Verhertbruggen等，2009），储存在4 °C
18.针对高半乳糖醛酸聚糖的部分甲基酯化表位的大鼠IgA单克隆抗体（PlantProbes ，目录号：JIM7 ）（Knox等，1990），储存在4 °C
19.针对木葡聚糖的鼠IgG2a单克隆抗体优先结合木葡聚糖LM24的XLLG基序（PlantProbes ，目录号：LM24）（Tanackovic等，2016），储存在4 ℃下
20.鸡肉中生产的抗His标签多克隆抗体，抗6X-His标签（Abcam，目录号：ab9107）在-20 °C下储存
21.在兔中生产的抗His标签多克隆抗体（Merck，目录号：SAB4301134 ），储存在-20 °C
22. Paul Dupree赠送了一种抗曼南的兔PDM抗体（Handford等，2003； Yang等，2016），在4 °C下保存。有关可用性，请联系raymond.wightman@slcu.cam.ac.uk
23.重组和His-标记的CBM4纤维单胞FIM我（ATCC 484）内切葡聚糖酶C（CBD4 N1产生自）E. Ç OLI。CBM4是哈里·吉尔伯特（Harry Gilbert）赠予的一种礼物（Johnson等，1996； Blake等，2006），储存在4 °C下。有关可用性，请联系raymond.wightman@slcu.cam.ac.uk
24.山羊抗大鼠CF568二抗（西格玛，目录号：SAB4600086），储存在-20 °C
25.山羊抗小鼠CF568共轭的F（ab）'2二抗片段（Sigma，目录号：SAB4600400），储存在-20 °C
26.与Alexa Fluor 647（Stratech Scientific，目录号：115-607-003-JIR）偶联的山羊抗小鼠F（ab'）2二抗片段，储存在4 °C下
27.与Alexa Fluor 647（Abcam，目录号：ab181292）偶联的驴抗小鼠F（ab'）2二抗片段，储存在4 °C下
28.与Alexa Fluor 647偶联的驴抗鸡F（ab'）2二抗片段（杰克逊免疫研究，目录号：703-606-155），储存在4 °C下
29.与ATTO488偶联的山羊抗小鼠F（ab'）2二抗片段（Hypermole ，目录号：2402-0.5MG），储存在-20 °C
30.山羊抗小鼠Alexa 488共轭二抗（Sigma，目录号：SAB4600387），储存在4 °C下
31.与Alexa Fluor 647（Abcam，目录号：ab150151）偶联的驴抗大鼠F（ab'）2二抗片段，储存在4 °C下
32.的ProLong Gold抗淬灭封固（热Ficher科学，目录号：P36934），保存于4 ℃下
33.氯化铵（NH 4 Cl）（Sigma-Aldrich，目录号：254134），在室温下存放
34.在H 2 O （Merck，目录号：P8920）中的0.1％（w / v）聚赖氨酸溶液，储存在室温下
35.无水乙醇（CARLO ERBA试剂，目录号：4146802），在室温下存放
36.醋酸≥96％（AnalaR NORMAPUR ，目录号：20099.324），在室温下存放
37.甲醛（西格玛奥德里奇目录号：F1635 ），在室温下存放
38.拟南芥花序分生组织固定在1厘米长的阶段，和3日龄幼苗的子叶，叶轴节星的F瑞特（补充˚F igure 1AG ），未成熟的玉米叶在叶片6个节点（补充˚F igure 1AF ）
39. Ñ AIL抛光（你可以从当地的药店得到它）
40.用于果胶酶促提取的果胶水解酶（西格玛，目录号：P3026或Magazyme，目录号E-PLYCJ）
41.用于一般细胞壁染色的Calcofluor White Stain （Sigma Aldrich，目录号18909-100ML -F ）
42. 2 F4缓冲液（T / Ca / S缓冲液终浓度）（请参见配方），在室温下保存
43. FAA解决方案（请参阅食谱），存储在RT
44.甲醛在10x 2F4缓冲液中稀释（请参阅食谱）
45.用于果胶裂解酶孵育的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.8）（请参见食谱）

设备

一次性切片机刀（Microm Microtech ，目录号：F / MM35p）
微型镊子（Ideal- tek ，目录号5-SA）
250毫升玻璃矩形Coplin染色罐，带盖（Wheaton，目录号：900620）
Fisherbrand TM显微镜载玻片盒，用于自制加湿室，用于Polysine显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：22363400 ）
用于捕获由切片机获得的系列切割的刷子（补充图1K，来自当地文具商店的ny精细刷子，例如Etude，P10531.00，＃2 ）
HistoCore Arcadia加热石蜡包埋站（Leica，ID：14039357258）
徕卡EG F电动可加热钳
切片机（Leica，型号：RM2265）
有关更多信息，请参见用户手册。
冰箱4°C
孵化室，例如Selecta （设定为60 °C），不需要气流
实验室冷冻室（-20°C），例如Kirsch FROSTER LABO 330 ULTIMATE
电子实验室加热板（BIO-OPTICA米兰的SpA ，CA talog Ñ棕土：40-300-300）
实验室化学通风柜

对于成像步骤：
任何配备四根激光线的荧光显微镜都可以在UV（405 nm），绿色（488 nm），红色（561 nm）和远红色（633 nm）中进行检测（此处我们使用Zeiss LSM 710，Zeiss Oberkoch en德国）
手册可在此处获得。
规范
支架：倒置（带有侧面端口的Axio Observer Z1）
Z驱动和XY工作台（选件）：电动XY扫描工作台，具有标记和查找功能（xyz ）和平铺扫描（马赛克扫描）；最小增量1μm
物镜：x10，x25，x40，x63，x100
激光：氩激光（458、488、514 nm），氦氖激光（633 nm），二极管激光405 nm和DPSS激光561 nm
405 nm for Calcofluor白色
Alexa 488和ATTO 488的488 nm
CF568和Alexa 568的561 nm
Alexa 647的633 nm
扫描模块
型号：具有32个光谱检测通道（QUASAR）的扫描模块
扫描仪：两个独立的振镜扫描镜，具有超短的线条和框架，可以向后飞。
扫描分辨率：4 X 1至6 ，144 X 6 ，144个像素
扫描速度：8帧/秒，512 x 512像素。
荧光光谱探测器数量：2
明场透射探测器：已安装
软件
标准软件：ZEN2010
可选软件战：Image J或斐济
计算机规格：HP Z800工作站，64位Windows 7旗舰版2009年，24 GB内存，英特尔®至强® CPU，X5650，两个处理器2.67 GHz的，2.66GHz的
野外显微镜（Nikon N-STORM）

软件

Grafeo（用于dSTORM数据分析和可视化的定制软件，https://github.com/inatamara/Grafeo-dSTORM-analysis-（Haas等人，2018 b ）
斐济（https://imagej.net/Fiji/Downloads）

程序

在此协议中，我们使用拟南芥子叶分生组织，杨桃（Averrhoa carambola）rachis（复合叶中的中央纤维）和玉米叶样品。
样品制备
杨桃生长在温室中的土壤两年，和叶穗轴在收获四月2019玉米的乞讨土壤中生长在田间播种在五月和在七2019年开始收获其开花前。拟南芥物生长于MS（的Murashige和Skoog的）不含蔗糖固体营养琼脂培养基上，在21中恒定光℃下，和发芽（3 DAG）后收获在3天苗（Peaucelle，怀特曼和Höfte，2015）。拟南芥分生组织是从生长在生长室内土壤上的植物中收获的，当花序长为1 cm时收获。去除具有可见萼片的花，保留所有最近的花蕾（如Yang等人，2016所述）。
叶杨桃的羽轴切割用超薄切片机可有可无刀成0.5厘米长的外植体（补充连接古尔小号1AG ，2A ）。玉米芽尖端的未成熟区域是从小植株中分离出来的（图1AF）。将在第6个节点没有中脉的玉米未成熟叶片切成5 mm x 5 mm的正方形（补充图2C ）。
固定拟南芥不同器官的体积范围通常在1:10至1：100（组织至固定液体积）之间，此处我们将20颗未除去子叶的幼苗放在装有1.0 ml FAA溶液的1.5 ml Eppendorf管中。玉米叶外植体的体积比为1：3，杨桃叶ra轴外植体的体积比为1：100。我们分别在装有1.5 ml FAA溶液的2.0 ml Eppendorf管中放入5个玉米叶外植体和10个杨桃叶轴心外植体。的显著协议步骤示于补充图1和制备组织外植体，并在切片机切割位置补充˚F igure 2。

固定和样品嵌入
戴丁腈手套。
修复植物器官在˚F在1.5 / 2 mL Eppendorf管AA溶液在室温下1个小时或过夜，在4℃。将固定的样品在4 ° C下的70％EtOH中保存1个月（s注释）。无需真空处理。
脱水的样品小号70％，95％，和两次100％乙醇：通过在连续稀释的乙醇，在室温下温育各至少30分钟。在Eppendorf管中使用约1.5 ml的体积。
在室温下，用1.5 ml 50％Histoclear的乙醇在Eppendorf中的乙醇中替换乙醇1小时，然后在室温下分别用1.5 ml 100％Histoclear的乙醇替换1 h（此时间取决于样品的厚度。减少孵育时间）适用于非常薄的组织切割，例如根部或下胚轴切割至30分钟）。
将样品转移到一个活检盒（IP-活检盒式-III，徕卡Biosystems）中。在步骤B前12小时，在预热至60-70 ° C的培养箱中开始熔化石蜡。完全熔化石蜡和新Histoclear应预热至60-70℃之前小号TEP乙6，使50％的石蜡在Histoclear 。在一个典型的实验中，我们在S tep B 6中使用大约600 ml的石蜡和100 ml的Histoclear 。
预热吨他含有200ml最终的250ml玻璃广口瓶中的50％Histoclear和50％石蜡之前小号TEP乙6。
注意：我们建议使用熔点低（56-57 ° C）的EM-400包埋中等石蜡。这有助于精确定位样品并减少组织变形。
通过将活检盒浸入250 ml Coplin玻璃染色罐中（补充图1B），在培养箱中用石蜡代替Histoclear 。在60-70 ° C的温度下，先将200％的50％Histoclear和50％的石蜡的混合物在3个小时内混合3小时，然后再将200 ml的100％的石蜡进行两次混合，持续3 h，最后在60- 70 ℃ 。
开启HistoCore Arcadia H加热石蜡包埋位置（补充图1C），并在步骤B 8之前将HistoCore Arcadia H设置为操作模式（将石蜡罐，分配器，工作表面的温度设置为〜70 ° C并设置一个冷点）在4 °C下。有关更多信息，请参见HistoCore Arcadia H用户手册）。
从培养箱中取出活检盒并在250ml Coplin玻璃染色罐中加热100 ％石蜡。在室温下固化石蜡之前，让活检盒漂浮在加热的仪器托盘融化的石蜡中，然后将其放置在HistoCore Arcadia H约70 ° C的热准备表面上（补充图1D）。
使用可加热的镊子将样品从活检盒转移到金属基础模具（补充图1E）。样品应被定位在垂直于切割平面在室温下固化的石蜡之前（补充Figu水库1F至1H和2 d ）。
一旦定位，通常可以在4°C下使用冷点（补充图1G中所示的小圆形金属板）实现石蜡的快速固化。
注意：石蜡的快速冷却将限制石蜡晶体的形成，并使制剂透明。相反，缓慢冷却将导致晶体形成和制剂的扩大。结晶的石蜡稍硬一些，极大地限制了切片机切割过程中定位样品的能力。
后小号TEP乙10，存储在4℃下过夜样品。在用切片机切割样品之前，请在室温下将波纹管保持在22 °C以防止石蜡软化。
打开切片机。我们建议在手动模式下使用切片机。可以使用电动模式，但是我们没有对其进行测试。用于切割厚度的设置有：3 - 5微米（˚F或多个信息：参见用户手册徕卡的，型号：RM2265 ）。
手动从模具中取出组织标本的石蜡块，修剪石蜡块，然后将其固定在切片机的样品夹和固定器中（补充图1H）。此步骤将确保干净且均匀的切割，并形成直的色带，如补充图1K所示。
修剪蜡块拿到面临的刀切片标本的切割面（参考图1我），如果你需要它。
通过使用刷子（捕获部分补充图1K），并把它们在聚-L-赖氨酸处理过的显微镜载片（参考图1L）或8孔ibidi μ-载玻片（补充图1M）不反转的部分，即，位置带电的载玻片或ibidi井底玻璃上面向刀的组织部分一侧（“发光”侧）。
添加的水的液滴betw EEN在滑动件和串行组织切片上滑动或单个ibidi阱（参考图小号1 N和O，小号EE下面注）。
注意：如果使用的ibidi多孔载玻片dSTORM样品制备中，添加0.1％的聚-L-赖氨酸溶液代替水在此阶段。
将载玻片在42 ° C保持3分钟。
[R EMOVE水仔细而不触及削减。残留的任何水滴都会形成气泡，并导致这部分样品的损失。在此阶段，通过以手臂的长度摆动1或2次来手动旋转干燥幻灯片（补充图1P）。
注意：只有在大流行期间才需要戴口罩和手套。
在加热板上于37 °C放置至少干燥过夜（补充图1Q）。载玻片可以在室温下保存至少一个月。使用显微镜载玻片盒进行存放，避免灰尘。
Deparaffining （补充˚F igure 1R）：将最多8个微垂直滑动（或16个滑动背靠背）到250ml科普林玻璃染色缸和浸泡在三个连续的滑动用200ml治疗Histoclear各30分钟，在正常光线条件下的室温下，无需摇晃。然后洗涤该Histoclear -处理microslides与200毫升的使用250ml玻璃的100％乙醇染色罐20分钟。
注意：可以在下一步中的下一个重复使用罐子。不要用水冲洗罐子；只需倒出广口瓶中的溶液即可。
再水化用连续的样品处理使用相同的两个玻璃罐子在前面的步骤中使用，每次15分钟，在100％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，25％乙醇，10％乙醇中2F4缓冲器，最后100％2F4缓冲液，在室温下在正常光照条件下，无需摇动。每个步骤使用约200 ml的体积。
注意：可以在下一步中的下一个重复使用该jar。不要用水冲洗罐子；只需倒出广口瓶中的溶液即可。
进行到小号TEPÇ 1 （Immunolabeli NG）尽快，以避免部分的干燥。
笔记：
在小号TEP乙12 ，样品应事先制备并在4保持° ℃过夜。然而，样品也可以是切口（小号TEPS乙-12-乙18）后1个小时小号TEP乙10.在这种情况下，存储在所述样品-20 °下搅拌1小时之前，切割和切割在不到15分钟后从-20 ° C取样
固定在70％乙醇中并在100％乙醇中脱水后，请使用Eppendorf试管存储组织。

样品存储断点：完全替换为100％Histoclear后，样品可以在RT下存储几天。但是，Histoclear易挥发，可以溶解石蜡。因此，建议不要超过几个星期。固定后，样品可以在4°C下保存几个月。包埋后，样品可以在低于25°C的温度下保存数年。用切片机切割后，微片上的样品可以在室温下保存数周。

免疫标记
我们提出多色用针对低2F4抗体的免疫染色的一例甲基酯化homogalacturonan结合h的二聚体缔合通过钙离子omogalacturonans ，LM20高甲基酯化homogalacturonan，JIM7用于部分甲基酯化homogalacturonan，CBM 3和CBM 4识别大多结晶和无定形纤维素分别，PDM识别甘露聚糖和LM24识别木葡聚糖。对于所有步骤，即使不使用2F4抗体，也要使用2F4缓冲液代替PBS。它已被证明可以与CMB3和CMB4不同的LM和JIM抗体以及微管抗体（有关可用的LM，JIM和其他抗体以及植物探针的列表，请在此处访问：www.plantprobes.net）正确使用组织切割拟南芥，大米，杨桃和玉米的样品（Yang等人，2016）。重要的是，如果在任何阶段用水或PBS冲洗该缓冲液，您将失去2F4抗体染色。
笔记：
免疫染色之前，可选地，在2F4缓冲液中使用50 mM NH 4 Cl淬灭游离醛基15分钟。用2F4缓冲液洗涤3次，每次3-5分钟。建议执行此步骤，因为样品固定步骤B2中使用的FAA溶液中的任何残留醛基都会与抗体的氨基反应，从而导致非特异性抗体结合。
我们建议按照步骤s C 1 - C5的顺序依次应用所有一抗，以防止竞争和空间位阻效应，尤其是对于位置紧密的表位，例如此处介绍的细胞壁靶标（纤维素，木葡聚糖，果胶和甘露聚糖，图1）。但是，在大多数情况下，同时进行一抗孵育非常有效。
为避免非特异性抗体结合，我们在2F4缓冲液中使用5％的牛奶作为封闭缓冲液。但是，随着时间的流逝，牛奶可能会受到污染。因此，请在不到72小时内完成免疫染色步骤C1-C5 ，并在必要时于4°C进行过夜抗体孵育。在室温（RT）下进行简短的抗体孵育和洗涤步骤。
染色时间表。对于薄组织切片（<5 µm），在室温下2 h一抗孵育时间就足够了。对于较厚的切口和某些抗体，此时间延长至最少3小时。
微波治疗。根据制造商的不同，选定的抗体可能需要微波加热才能激活或加速反应（400瓦时1-2分钟）。此步骤应快速以防止样品沸腾–微波加热后，该方案中提出的抗体均未显示出更高的标记效率。
对于来自Sigma的曲霉果胶酶的酶处理，请用200μ升的果胶酶在温育缓冲液（见ř ecipes）在最终稀释0.1％在室温下10分钟至之前。步骤C 1 （CBM孵育）或步骤C2 （初级抗体孵育）。酶处理后，每次3-5分钟用2F4缓冲液清洗切片3次。当您使用其他果胶裂解酶如Megazyme的E-PLYCJ，检查他们的publica-灰名单的反应条件。
如何制作手工制作的潮湿箱（补充图1U）。将2-3层纸巾放在空的微量移液器盒（10 cm x 14 cm x 9.5 cm）或用于显微镜载玻片托盘的空盒（3 cm x 8.5 cm x 21 cm）的底部，并加入蒸馏水（〜20 ml），以使纸巾湿润。盖好盒子。用铝箔包裹潮湿的房间。如果您使用共焦成像样品制备微滑梯，确保样品的的MicroSlide是不是与接触湿纸巾。为此，我们建议使用显微镜载玻片托盘。
在每一步中，我们使用200微升理论值的ë每盖玻片溶液含有抗体的（补充˚F igure 1S），而我们使用50或70-100微升的含有抗体的溶液每8孔的单个孔中ibidi滑动（补充˚F igure 1T，小号EE人所以步骤C 8 ）。用于洗涤，我们使用大约500微升每盖玻片或200微升每单井2F4的用5％乳缓冲液。将切片放置在液滴的中心。试剂（抗体）在液滴上浓缩（一种称为咖啡渍的过程）。在这里，我们提出以下最佳顺序抗体染色顺序。可选地，在抗体或试剂孵育之前，执行步骤C 1或C 2，将您的样品在封闭缓冲液中孵育30分钟。然后直接去小号TEP Ç 1 。

纤维素结合分子（CBM3或CBM4）孵育：在封闭缓冲液中稀释2/100体积/体积（v / v）CBM3 / 4试剂，然后添加到样品中。孵育2在室温或4℃过夜ħ ℃下在潮湿的腔室（补充˚F igure 1U）。除去CBM3溶液后，用封闭缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如果隔天在4°C下进行过夜孵育，则在清洗步骤前至少30分钟将潮湿的样品室从冰箱中取出。
第一次一级抗体孵育：在封闭缓冲液中稀释20/100 v / v 2F4抗体，然后添加到样品中。在室温下孵育2小时，或在潮湿箱中于4 °C过夜。除去2F4溶液后，使用封闭缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如果隔天在4°C下进行过夜孵育，则在清洗步骤前至少30分钟将潮湿的样品室从冰箱中取出。
第二次一抗孵育：在封闭缓冲液中稀释10/100 v / v LM20抗体，然后添加到样品中。在室温下孵育2小时，或在潮湿箱中于4 °C过夜。去除LM20溶液后，使用封闭缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如果隔天在4°C下进行过夜孵育，则在清洗步骤前至少30分钟将样品从冰箱中取出。
第三次初级抗体孵育：在封闭缓冲液中稀释1/100 v / v兔或鸡抗组氨酸标签抗体，然后添加到样品中。在室温下孵育2小时，或在潮湿箱中于4 °C过夜。除去抗体溶液后，使用封闭缓冲液洗涤3次，每次5分钟。如果隔天在4°C下进行过夜孵育，则在清洗步骤前至少30分钟将潮湿的样品室从冰箱中取出。
二级抗体孵育：在与二级抗体混合物相同的封闭缓冲液中稀释所有三种二级抗体1/100 v / v 。在室温下孵育2小时，或在潮湿箱中于4 °C过夜。在黑暗中孵育二抗，以避免光致漂白。为此，用铝箔纸包裹加湿室。除去后次级抗体-混合物溶液，洗3次，用封闭缓冲液5分钟。如果隔天在4°C下进行过夜孵育，则在清洗步骤前至少30分钟将潮湿的样品室从冰箱中取出。Ť他的第二抗体温育也可以顺序进行（参见Ť故障排除小节），虽然在的情况下˚F igure的1〜4 ，同时加入所有的次级抗体。
笔记：
步骤C 1 - C 5 ：在加湿室中执行所有抗体孵育步骤。
使用另一种物种（例如兔，豚鼠，马和人）的抗体，可以将该协议扩展到三个以上的靶标。但是，在共聚焦显微镜上对四种以上的颜色进行成像需要附加的激光线（> 700 nm）或光谱分解步骤。
使负控制图像而不1日，2次，3种p rimary抗体像图1 A（只有。步骤C 5至少在第一个试验的情况下，用第二抗体混合物。
对于dSTORM成像，从步骤B14开始，我们建议使用多孔Ibidi玻璃底μ玻片，例如8孔玻片（Ibidi ），可以轻松地将其插入并固定在许多显微镜载物台上。多孔载玻片方便了几种成像条件的准备，减少了试剂用量，提高了半定量分析免疫染色的均一性。对于8孔载玻片Ibidi，我们推荐使用70-100微升每孔的试剂在步骤小号Ç 1 - C ^ 5的免疫标记。

后免疫固定。
此步骤对于dSTORM纳米显微镜样品很重要，对于使用固定介质进行共焦成像的样品则不需要。由于与共聚焦显微镜样品相反，dSTORM样品未安装在安装介质中，因此它会降低抗体复合物的热运动并减慢抗体从表位的解离。
温育样品10分钟在3.7％甲醛（小号EE配方4）在10适量稀释X 2F4缓冲器，并在室温蒸馏水。为此，将200 µl的3.7％甲醛溶液滴在ibidi多孔载玻片内部的样品上。在通风橱中执行此步骤，并戴上丁腈手套。
用3 00 µl 2F4缓冲液洗涤3次，每次3分钟。在通风橱中执行此步骤。
猝灭70甲醛μL下降的15分钟的50mM氯化铵。此步骤可降低在成像过程中处理样品时与甲醛接触皮肤的风险。稀氯化铵在2F4缓冲液（见ř ecipes）。温育后，洗涤简要3次后3 00微升液滴的2F4缓冲器。您也可以使用其他含有胺基的醛猝灭剂，例如2F4缓冲液中的50 mM甘氨酸。
样品安装和存放。仅用于共焦成像。
注意：请勿为dSTORM样品制备执行此步骤。
要延长样品的使用寿命，请用盖玻片将载玻片安装在含有抗褪色剂的固定介质中。我们建议的ProLong Gold抗淬灭封固（赛默飞世尔科技）（补充˚F igure 1V）。为了防止气泡的形成，放置在盖玻片封固的液滴，并轻轻将其放下上用微型镊子滑动（补充˚F igure 1W-AA）。密封用指甲油盖玻片，以防止干燥（补充˚F igure 1AB）和把密封的微滑动到纸板滑动托盘（补充˚F igure1AC）和存储在黑暗中在4 ℃。
样品储存。仅用于dSTORM成像。
完成后小号TEPS Ç 6 ，一个DD 500微升的2F4缓冲到各8个孔，密封用石蜡膜中，包裹物在铝箔上，并保持在4潮湿室℃，如在呈现补充图1AD和1 AE 。
注意：您可以执行此操作以进行共焦成像，但是您无法将样品装入抗褪色封固剂中；因此，不建议这样做。
选择荧光染料。
对于共聚焦成像，我们建议使用明亮且耐光的染料，例如Alexa Fluor，ATTO和CF系列。对于dSTORM成像，仅某些染料有效。我们建议使用ATTO488，CF568和Alexa647染料。对于dSTORM纳米显微镜成像，我们建议使用F（ab'）2二抗片段或纳米抗体，或者在可能的情况下，将一抗直接与目标荧光团偶联。对于密集包装的表位，我们建议使用单个标记的二抗。

故障排除
高背景：降低二抗浓度。优良作法是进行一抗和二抗的滴定。例如，如果建议的抗体稀释度是1：200，则滴定测试的一个好的起点是1：50、1：100、1：200、1：400和1：800稀释度。免疫染色之前，在2F4缓冲液中使用50 mM NH 4 Cl淬灭游离醛基15分钟。在已经产生第二抗体的封闭缓冲液中使用血清，例如，山羊血清中的山羊血清。在S tep C 1或C2之前，将抗体在4°C下孵育过夜。
预期不到的高度共定位：对所有第二抗体使用顺序染色。如果可能，对所有第二抗体使用相同的宿主物种（例如，来自山羊的一组抗大鼠抗体，抗兔抗体和抗小鼠抗体等）。为避免脱靶结合，请使用高度交叉吸附的二抗。我们建议准备仅执行步骤C5的测试样品，这是应用第二抗体而没有第一抗体的情况。
低信号：增加一抗浓度和/或孵育时间。尝试使用新一批的一抗和二抗。更改第二抗体（共轭染料，宿主物种或同一类型抗体的生产者）。增加二次抗体浓度（进行的滴定-试验在2，4，和6倍增加的抗体稀释液）和/或温育时间（在2小时，4小时，6小时进行测试）。检查2F4缓冲液的pH。如果pH值不为8.0，则进行调整。

共焦成像技巧
1）复染
对于用共聚焦显微镜对细胞壁成分进行半定量分析，请比较来自相同实验制备物的样品。如果可能，请考虑使用激光扫描共聚焦显微镜的第三或第四通道观察复染样品，如果预计复染强度在不同样品条件下不会改变。对于细胞壁染色，请使用例如钙氟荧光白染色剂。添加200微升的卡尔科弗卢尔白色染色后小号TEP Ç 5以5mM浓度在2F4缓冲器和孵育5分钟在室温下。洗涤两次简要地用500微升的2F4缓冲区之前施加的抗褪色封固介质的样品（步骤C 7 ）。复染可用于将强度数据规格化为大小，例如面积或单元壁厚度。准备每个实验准备要比较的所有条件。
2）显微镜操作
成像前1h打开激光器。在成像期间，请确保不要饱和检测器上的信号以进行下游定量。在整个实验过程中保持激光功率和检测器增益相同，并且在可比较实验之间保持所有其他设置不变。此外，为了避免在最终拍摄之前优化图像质量的过程中出现光致褪色，请考虑使用科学兴趣较小但幻灯片上存在相似信号水平的组织样本或区域，1）找到目标点和焦点在明亮的领域。如果在显微镜上安装了DIC，则微分干涉对比图像（DIC）可以更方便地聚焦图像。2）在最终目标点附近的位置优化图像质量。3）在优化图像质量期间，请频繁停止扫描。4）作为共聚焦激光扫描模式的初始设置，激光功率的1％至2％是聚焦样品的良好起点。5）建议以更快或最大的扫描速度（任意水平的扫描速度：在Zeiss LSM 710中为> 9）来关注初始条件（ZEN软件的Live按钮在Zeiss LSM 710中很方便）。
注意：根据Zeiss当地办事处的说法，LSM710有15种任意级别的扫描速度，最大级别“ 15”时的绝对速度为8帧/秒。当执行定量成像，由于光漂白，从未采取最终图像的同一区域的两倍。因此，在特定方向（从右到左，从前到后）移动微型载片的XYZ载物台，以避免观察到同一点。为了进行可靠的定量，需要进行2-3个独立的实验（独立的技术重复）并进行比较。执行先导实验以确定通用参数，例如增益和像素停留时间，并消除/最小化任何光漂白。对所有通道进行顺序成像，始终从最长的波长开始，到最短的波长结束。

数据分析

图1显示了不同细胞壁表位的双色和三色IHC，代表了细胞壁多糖三个不同家族的成员：果胶（2F4，LM20和JIM7），纤维素（CBM4，CBM3）和半纤维素（PDM和LM24））在杨桃叶轴的横切面（补充图2和表1 ）。
比较图1的A和C，在高HG计数区域和高HG计数较低的组织中，纤维素染色（CBM3和CBM4 ，参见表1 ）较弱。这可能表明纤维素和果胶占据了排他性的壁室。然而，酶的果胶提取转ealed高得多的纤维素检测水平与CBM4 （比较图小号1C和1E）。这表明，在完整的细胞壁中，大多数纤维素表位被果胶所掩盖。如果不进行果胶提取，则剩余的纤维素染色可能与木葡聚糖相对应，这可由CBM探针部分检测到（参见PlantProbes CMB3试剂说明，Hernandez-Gomez等，2015）。实际上，图1D显示针对木葡聚糖的CBM3和LM24抗体在壁的子集中呈现出低程度的重叠。

图1.杨桃（杨桃）叶片叶轴上不同细胞壁表位的多色共聚焦图像。A.仅用二抗染色的对照图像。B. 2F4，CBM4和LM20和（C）2F4，CBM4和JIM7表位的三重染色。D.双染色CBM3和LM24的。E.酶法提取果胶后，对CBM4和PDM进行双重染色。所有图像均使用相同的显微镜设置获取（建议的设置请参见表2 ）。最后一栏代表切割的透射图像。图像在斐济可视化。比例尺小号，100微米。

表1.图1-4中使用的第一抗体，CBM试剂和第二抗体稀释液

表2.使用共焦激光扫描显微镜对三重免疫染色和钙氟荧光白复染色的建议发射滤光器带宽，优化后可将光谱串扰减至最小。有关dSTORM滤波器组的详细信息，请参阅Haas等。（2020年）

图2显示了拟南芥子叶L2层（表皮下的一层）中不同果胶种类的3D dSTORM纳米显微镜成像，其纵向剖面在补充图2E中进行了描述。在图2 A和2 B，低甲基化（2F4），高甲基化（LM20），并且观察到部分地甲基化（JIM7）果胶的典型小区边缘染色（见表1）。三维dSTORM图像显示，该染色细胞壁（间层）内弱，大多局限于面临的细胞质单元壁边缘-t他的亮点IHC的一般最大限制之一：表位可访问性和渗透性抗体。然而，在该具有相似的空间和化学分辨率（可得技术光例如，IEM ），3D dSTORM提供总体较高的标记和检测的密度，并在中间薄片检测表位的数目仍然是3D更高dSTORM比IEM （科斯格罗夫和安德森（Anderson），2020年。绕过此限制的一种可能方法是从细胞壁中去除一种聚合物（例如，被重组蛋白酶K降解的结构蛋白）以增加抗体渗透。但是，这可能会引起非特定的壁扰动。针对细胞壁靶标的小型纳米抗体的开发将在将来帮助解决这些局限性。相关超分辨率光学和电子显微镜的进步可能有助于提高性能，并消除3D dSTORM和EM的局限性。

图2.在拟南芥子叶的L2（疏皮细胞）层的三细胞交界处的同型半乳糖醛酸的两色3D dSTORM成像。两色散点图显示了定位的（A）JIM7（绿色）和2F4（紫色）以及（B）LM20（绿色）和2F4（紫色）表位的3D坐标。图像插图显示了低分辨率倾斜照明图像，并在散点图中显示了红色正方形轮廓区域。2D –二维顶视图（XY）和3D – 3D倾斜视图，其中Z轴垂直于常规图像平面。橙色线表示在下面的面板中放大的细胞壁区域。图像比例尺，4 µm。使用GrafeoV.2可视化数据。

图3示出了3D dSTORM纳米显微镜中的表皮层的不同果胶物质的检测的拟南芥子叶具有纵向部分中补充图2G所述。在这两种˚F igure小号3A和3 B，2F4和LM20的表位形成的背斜，但不是平周壁染色的丝状图案，先前描述为HG纳米丝（哈斯等人，2020）。此纳米丝四级结构是具有挑战性的果胶的规范视图中Muro的架构，为无定形凝胶状基质。这些出乎意料的结果引起两个问题：（1）丝状图案将果胶表示为纤维素微纤维之间的间隔物，或（2）果胶抗体无法穿透由纤维素微纤维形成的凹槽之间（Cosgrove and Anderson，2020）。为了解决这些问题，我们在子叶的背壁上标记了部分甲基化的HG表位（JIM7），图3A。与LM20和2F4 HG表位相比，J IM 7呈现了更为广泛和统一的分布模式。首先，与LM20 / 2F4丝状分布相比，JIM7表位的扩散分布表明果胶甲基化模式与其定位有关。其次，这意味着LM20和2F4的HG纳米丝是可能的，这不是由于纤维素微纤维形成的凹槽中的表位不可及，因为JIM7表位可以定位在此处，图3A。此外，在未事先提取果胶的情况下，对未成熟叶片第6个节点（补充图2C和F中的纵向截面）的玉米表皮细胞中的纤维素（CBM3）和HG（2F4）进行了双重染色，结果表明2F4纳米丝之间没有空隙纤维素没有被填充，并且没有果胶提取的纤维素染色的整体水平非常低，图3C。

图3.双色3 d dSTORM在的波瓣Homogalacturonan的成像拟南芥子叶路面细胞和玉米叶路面细胞。二维彩色散点图示出局部（A）JIM7（绿色）和2F4（紫色）的三维坐标，和（B）LM20（绿色）和2F4（紫色）的表位在拟南芥子叶。图像插图显示了3D dSTORM散点图中显示的区域的低分辨率荧光图像。橙色线表示在下面的面板中放大的细胞壁区域。（C）两色散点图，显示了玉米叶片中局部2F4（紫）和CBM3（橙色）表位的3D坐标。比例尺，1 µm。使用GrafeoV.2可视化数据。

图4示出了双色3D dSTORM的成像拟南芥原基和分生组织朝向纤维素（CBM3或CBM4）和（杂）甘露聚糖（PDM）和与现有果胶提取具有1cm的纵向截面的的花序（补充˚F igure小号2B和2 D ，表1 ）。比较面板A和B显示，检测到主要为结晶性纤维素的CBM3形成了离散的细丝分布，而与CBM4相比，CBM3标记了无定形纤维素。甘露聚糖的染色在不同的细胞壁中显示出不同的丰度：从大部分不包含在纤维素中的扩展壁部分（图4A）到点缀在纤维素纳米原纤维的染色装饰末端（图4B）。

图4.两色dSTORM在纤维素的成像（CBM3 / 4）和（杂），甘露聚糖（PDM）拟南芥原基，和分生组织。佩奇吨插件瓦特ERE酶促与萃取果胶酶之前的免疫染色协议处理（小号TEP Ç 1 ）。两色散点图显示了分生组织中局部（A）CBM4（蓝色）和PDM（橙色）以及（B）原基中CBM3（蓝色）和PDM（橙色）表位的3D坐标。曲线左侧的插图显示了一个低分辨率的荧光图像，并在散点图中显示了红色正方形轮廓区域。比例尺，1 µm。使用GrafeoV.2可视化数据。

结论
IHC是研究细胞壁化学中亚细胞变化的有力工具。但是，它有几个限制。由于光谱串扰和抗体种类的数量，可以同时探索的表位数量有限（<4个）。此外，只能检测到具有明确抗体的表位。此外，除非细胞壁成分之一被降解以帮助穿透，否则抗体对内部细胞壁成分的可及性受到限制。同样，用于IHC的样品制备可能会导致组织变形；因此，空间尺度的测量和拓扑可能不是绝对的。尽管如此，多色IHC与新颖的光学纳米技术相结合，为生物分子的复杂空间组织提供了前所未有的见解。结合超分辨率成像，多色IHC现在正在改变我们对细胞壁结构和植物生长的看法。细胞壁介导植物细胞与环境的相互作用，因此我们希望该技术将帮助我们了解植物免疫力，果实成熟，植物与微生物的相互作用，植物生长和产量。荧光探针，单分子技术和数据分析要使常数改进，3D dSTORM有巨大的潜力，以精益求精的分子组件和它们的功能我们的知识（克莱恩ê牛逼人。2014年，金等人。，2019; Gwosch等。，2020;张等人，2020）。因此，“与流行的看法相反，眼见为实。在这里，信念就停止了，因为不再需要信念了。” ，金字塔的Terry Prattchet

菜谱

2F4缓冲液（T / Ca / S缓冲液终浓度）
Ť ø稀所有的抗体，制备封闭缓冲液和洗涤缓冲液（http://www.plantprobes.net/pp_2F4.pdf）。
Tris-HCl 20 mM pH 8.2
氯化钙2 0.5 mM
氯化钠150 mM
最终pH应为8.0
˚F ormaldehyde一个lcohol一个cetic酸FAA解决方案
50％乙醇
10％醋酸
甲醛3.7％
百分比表示FAA溶液中的最终浓度
在2F4缓冲液中稀释的1 M氯化铵溶液
将53.489 g氯化铵粉末混入1 L 2F4缓冲液中
调节pH至8.0
甲醛稀释于10x 2F4缓冲液中
混合1体积的37％甲醛溶液，1体积的10 x 2F4溶液和8体积的蒸馏水。
在通风橱下表演
用于果胶裂解酶孵育的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.8，Stoll和Blanchard，1990年）
0.2 M Na 2 HPO 4 · 7H 2 O
将53.65 g溶于MilliQ水中，制成1 L溶液A
0.1 M柠檬酸
将19.21 g溶于MilliQ水中，制成1 L溶液
混合24.8 ml的溶液A和25.2 ml的溶液B并稀释至100 ml，pH值为4.8
如果需要，检查pH值

致谢

这项工作提出了扩展协议，该协议已在Haas等人的文章中发表。，2020年。dSTORM在MRC分子生物学MRC实验室（剑桥）进行，我们感谢Nick Barry和Jonathan Howe的支持。我们为赫尔曼·霍夫特（HermanHöfte）提供帮助，帮助他们进行筹款和结果讨论。
资金：AP获得了法国国家研究局（ANR）GoodVibration ANR-17-CE13-0007和欧盟的支持，这是通过授予AgreenSkills +奖学金（根据授权协议号201310）。IJPB受益于Saclay Plant Sciences-SPS（ANR-17-EUR-0007）的支持。塞恩斯伯里实验室的显微镜设施得到盖茨比慈善基金会的支持。这项工作得益于IJPB的植物观测台技术平台的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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