材料和试剂
1.用于玻璃微量移液器的玻璃毛细管，Microcap，50μl （Drummond Scientific Company，目录号：1-000-0500 ）
按照制造商的说明（Narishige ，https://products.narishige-group.com/group1/PC-100/pipette/english.html），使用拉拔器PC-100系统制作微量移液器。理想毛细管的特性（长度+外/内径）示于图URE 2A。为了精确控制从玻璃微量移液器流出的流量，使用手工制作的铂金线环进行了收缩。简要地，使微量移液器穿过铂丝的环。然后，将微量（3 -从端部5毫米）的混合物加热，直到3.5的收缩- 5.0微米直径经由电流的施加到环路形成（也参见平本，1974）。
2.盖玻片（Matsunami ，18 mm x 18 mm，厚度0.12-0.17 mm）
3.硅油（Shin-Etsu化学Co.Ltd 。目录号：KF-96-100CS ）（图URE 2C）
4.甲葡聚糖（10-kD）的BCECF缀合物（Fisher Scientific公司，Invitrogen公司TM ，目录号：D1878 ）（图URE 2B ）
图2.用于卵母细胞操作的材料和设备。A.用玻璃微量移液器制成的收缩物起制动器的作用。B. BCECF在玻璃毛细管中的溶液。C.将玻璃毛细管中的BCECF溶液放入装有硅油的毛细管容纳腔中。将装有硅油的玻璃微量移液器（A）插入BCECF溶液中；20 PL BCECF被吸入到微量。D.卵母细胞支架。E.操纵室。F.用于1-MA治疗的卵母细胞支架。G.用于1-MA治疗的操纵室。腔室有一个开口，可以取出ASW体积（25％），并用包含1-MA的相同体积的ASW代替。DG 除非另有说明，否则所有测量值均以毫米表示。
5. 1-甲基腺嘌呤（关东化学株式会社，目录编号：20131-1A ）
6.天门冬氨酸钾（东京化学工业株式会社，目录号：A0922）
7. HEPES，2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（DOJINDO，目录号：340-01371）
8.管，哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）（DOJINDO，目录号：347-02224）
9. KOH（和光纯药工业株式会社，目录号：168-21815）
10. NP-40 （的Nonidet P-40ナTesque公司，目录号：252-23）
11. NaCl （FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：191-01665）
12. KCl （KANTO CHEMICAL CO。INC 。，目录号：32326-00）
13. MgCl 2 ·7H 2 O （和光纯药工业株式会社，目录号：135-00165）
14. MgSO 4 ·7H 2 O （和光纯药工业株式会社，目录号：131-00405）
15. H 3 BO 3 （昭和化学株式会社，目录号：0214-6250）
16. CH 3 COONH 4 （和光纯药工业株式会社，目录号：019-02835）
17.氯化钙2 ·2H 2 Ô （和光纯药工业株式会社，目录号码：031-00435）
18.无钙ASW（请参阅食谱）
19. ASW（请参阅食谱）
20.改良的ASW pH 6.8（请参阅食谱）
21. pH为6.40-6.75或6.80-7.40的标准pH溶液（请参见配方）
22. BCECF解决方案（请参阅食谱）

设备

CMOS相机（滨松光子学株式会社，ORCA-Flash2.8，米Odel等：C11440-10C）
ECLIPSE Ti -U荧光显微镜（Nikon Instech ）
4×0.20 NA CFI超级荧光镜片（Niko n Instech ）
导航pH计（HORIBA，pH METER，F-52）
螺杆控制的微型注射器（成茂，型号：IM-9B ）

软件

HCImage U11158-02，03（Hamamatsu Photonics KK，https: //hcimage.com/ ）

程序

图3.表示过程概述w的流程图（过程A至F）

卵母细胞制备（视频1）

视频1.卵母细胞制备。该视频是在御茶之水大学制作的。根据御茶水大学的指导。并由御茶之水大学动物研究伦理委员会批准。

在提供有循环海水且温度为14°C的实验室水族馆中维持海星（Asterina pectinifera ）（Murabe et al。，2020）。
从雌性动物中分离卵母细胞或卵巢，并用无钙人工海水处理以消除卵泡细胞。
使用前，请在人造海水（ASW）中保持无卵泡的卵母细胞。

将BCECF显微注射到卵母细胞中（视频2）

视频2.显微注射技术

生成具有玻璃微量几的收缩微米直径，以控制流速出微量的（平本，1974年;还参见材料与试剂1和图URE 2A）。
用硅油填充收缩的微量移液器，并将其连接到螺杆控制的微量进样器（IM-9B Narishige ）。
镜下抽吸20 PL乙CECF溶液引入微量（图URES 2A -2 ℃）。
Microinject的BCECF溶液进入夹在卵母细胞保持器的两个盖玻片之间的卵母细胞海星（千叶等人，1992）（图URE小号2 d和2 E）。
在测量BCECF荧光强度或pH i之前，将注射BCECF的卵母细胞在ASW中于23° C孵育1 h 。
注意：注入的BCECF的扩散需要孵育1小时。

1-MA刺激前后注射BCECF的卵母细胞的图像采集（序列成像）（视频3）

视频3.使用BCFCF测量pH i

要评估相机的“噪点”，请获取暗图像（没有光传输到由HCImage采集系统控制的CMOS相机，该系统连接到配备有差分干涉对比（DIC）光学器件的荧光显微镜，该光学器件包括4×0.20 NA） CFI超级Fluor镜头）。
组卵母细胞预先注射无线个BCECF（如在所示的P rocedure B）在操作腔室1-MA治疗在23℃ （图2F和2G）。
获取DIC的卵母细胞8-15图像（图URE 4A）。
获得的卵母细胞的荧光图像来配置关注区域（ROI）（图1的区域URE 4B）：包围不含未扩散的BCECF和卵母细胞的图像中的区域GV来定义ROI细胞质中，使用HCI法师分析软件。注射后1 h，大多数注射的BCECF散布在整个细胞质中。但是，通常在喷油点附近油滴处保留一小部分较亮的部分。重要的是，这更亮区域应被排除在感兴趣区（图URES 4C和4 d）。

图4.卵母细胞的图像采集。一。代表性卵母细胞的DIC图像。乙。注射BCECF的卵母细胞的荧光图像。Ç 。ROI用绿线定义。背景区域也用绿色上色。d 。放大的卵母细胞图像显示ROI。由于GVBD导致荧光强度快速变化，因此GV区域不包括在ROI中。

选择一个区域，而不卵母细胞，以获得背景荧光（图URE 4C）。
在用1-MA处理之前，获取BCECF注射的卵母细胞的荧光显微图像，在436 nm和495 nm下每10 s激发5分钟以上。在HCImage采集系统的计算控制下，使用滤光轮从氙气灯获得这种激发交替。然后，在505nm处，并通过510通过一个二向色分束器出射的光穿过- 560nm的发射滤光器，最后通过CMOS摄像头，并通过记录HCImage采集系统。
暂停CMOS相机，吸出25％的ASW，然后再添加25％的ASW，其中包含2 µM 1-MA（最终浓度：0.5 µM）。
立即加入1-MA后，打开（或重新开始）的CMOS摄像头获得卵母细胞的荧光图像2 - 30分钟。有关程序和原型图像的更多详细信息，请参阅原始研究（Hosoda等人，2019年;图S5F，左图）（另请参见视频3）。

使用BCECF注射的卵母细胞和HCImage分析系统记录的图像计算平均荧光强度比
打开“图像显示”窗口，显示卵母细胞的荧光显微图像序列。如果卵母细胞在记录过程中移动，则应根据步骤C4中的步骤定义新的ROI 。
从8计算436 nm和495 nm激发之间的荧光强度比- 15个卵母细胞，使用HCImage分析软件。
平均每个时间点8-15个卵母细胞的ROI比率。
实验之后，使用程序F中概述的程序将平均比率转换为pH i 。

用改良的ASW（含CH 3 COONH 4的无钠ASW）进行pH i钳制，并在注入已知pH值的标准溶液后进行校准
注意：对于卵母细胞请客编在pH 6.8具有经修饰ASW中，pH值我预计在〜7.0至待夹持的，因为pH值我值变得〜除改性ASW的pH值高0.2 （森胁等人，2013; Hosoda et al 。，2019 ）。要准确地校准钳制的pH i ，请使用至少三种类型的pH标准溶液注入不同组的卵母细胞。当实际（或实数）的pH我比的已知pH值更高标准注射溶液，该BCECF的荧光强度比将注入后降低，因为在pH值我还取决于在较低的标准溶液的注射降低pH值。相反，当实际的pH我比所注入的标准溶液的pH值已知较低时，BCECF的荧光强度比将增大。其后，实际的pH值我应为两个注入标准溶液的pH值之间。当实际pH值我等于注入的溶液中，其强度比不发生变化。使用此方法，可以检测到pH i差异低至0.05。在本节中，以pH值为6.8的改良ASW为例，将未刺激的卵母细胞的pH i固定，并向不同组的卵母细胞中注入不同的pH标准溶液（pH 7.00、7.05、7.10）以估算固定pH值读者可以期望看到如图5A，5 B和5 C所示的三种不同结果，可以对pH i进行校准。

除去BCECF-注入OOC从卵母细胞保持器（图ytes URE 2D）后程序B ，并且在20恢复它们微升ASW，使用可调整容积微量。然后，将它们立即转移到1毫升的无钠ASW中，其中含有pH 6.8的CH 3 COONH 4 （改性ASW pH 6.8）。之后，轻轻搅动卵母细胞15 s。
转移卵母细胞20微升pH 6.8的改性ASW在pH 6.8至新鲜改性ASW（1毫升）中，并轻轻搅动卵母细胞15秒。重复此过程5次以完全消除Na + （在pH 6.8时使用改良的ASW）。
三明治未成熟卵母细胞使用卵母细胞保持器（图两个覆盖眼镜URE 2D）。
定义卵母细胞的ROI并选择没有卵母细胞的区域作为背景荧光–步骤C4和C5 。
注意：步骤E1至E4中的过程应在20分钟内完成，以获得可复制的数据。
记录卵母细胞的荧光图像序列≥100 s。
要注入pH标准溶液，请暂停CMOS相机。
注入卵母细胞，其卵母细胞的体积为pH 7.00的pH标准溶液的2％；音符的改性ASW在pH6.8可以夹紧pH值我在〜7.0（森胁等人，2013;细田等人，2019）。
快速打开CMOS相机系统，以记录荧光强度比的变化至少20 s。
使用HCImage分析软件，测量ROI内部的平均荧光强度，并计算436 nm和495 nm激发波长之间的平均强度之比。典型的结果示（图URE 5A）。在该特定示例中，荧光强度比在注入pH标准溶液时降低。因此，估计钳制的pH i高于pH 7.00。因此，在下一步中，应使用pH值高于7.00的标准溶液，以引起荧光强度比增加，并最终确定实际pH i 。

图5.在pH 6.8下用修饰的ASW处理的卵母细胞中pH i的估算。一。pH值为7.00的标准溶液在100 s至140 s之间注入。在该卵母细胞中，夹紧的pH i估计高于pH 7.00。乙。在125 s和185之间注入pH为7.10的标准溶液。据估计，钳制的pH i低于pH 7.10。Ç 。钍在pH 7.05的pHË标准溶液125秒和220秒之间注入。没有观察到BCECF荧光强度比的变化。因此，钳制的pH i估计为pH 7.05。

在步骤E1- E 6中描述的步骤之后，向卵母细胞注入每个卵母细胞2％的pH值为7.10的标准溶液。因为pH值下降7.00的荧光强度比（图URE 5A），pH值7.10预计将增加该比值。
打开CMOS相机系统，并计算标准溶液在pH 7.10下的荧光比，如步骤E7 -E 9所述。
典型的结果示（图URE 5B）。如预期的那样，在注入pH标准溶液后，荧光强度比增加。因此，CLA地跳过pH值我被估计为低于pH值7.10的pH大于7.00和更高。因此，要找出pH值适当且不会引起荧光强度比变化的标准溶液，应考虑标准溶液7.00≤pH≤7.10。
在手术后DESCR在IBED步骤E1-E6 ，注射用pH 7.05每一个标准溶液的卵母细胞体积的2％的卵母细胞，然后打开CMOS摄像系统上，并计算各自的荧光比率，如在所提到的步骤E7 -E9 。
典型的结果示（图URE 5C）。正如预期的那样，荧光强度比未在所述pH值标准溶液注射改变，这表明实际的pH值我应该等于所注射溶液（=的pH值7.05）。

正常海水中pH i的校准
注意：F中的步骤应在执行C中的步骤的同一天进行。
要进行两点校准，请使用改良的ASW处理未成熟的卵母细胞（n = 8-15），以将pH i固定在较高和较低的值，并获得各自的BCECF高强度和低强度比。通常，修饰的SW在pH 6.4（pH值我〜6.6）和在pH 7.3（pH值我〜7.5）可被使用。实际pH值我在改性ASW卵母细胞所描述的i的估计Ñ P rocedure E.
计算每个点的平均值s。
绘制相对于pH i 6.6和pH i 7.5的荧光比率，以获得标准线性校准图/函数。原始研究已经提供了有关此程序的更多详细信息（Hosoda等，2019;图S5D和E）。使用标准的线性校准图/函数，将过程E的比率数据转换为pH i值。再次，请参阅原始研究中的步骤以获取更多详细信息（Hosoda等，2019;图S5F）

菜谱

无钙ASW
476 mM的NAC升
10毫米氯化钾
36毫米MgCl 2
18毫米硫酸镁4
20 mM H 3 BO 3 ，调节至pH 8.2
反潜战
462毫米氯化钠
10毫米氯化钾
36毫米MgCl 2
18mM硫酸镁4
10毫米CaCl 2
20 mM H 3 BO 3 ，调节至pH 8.2
修改后的ASW pH 6.8
480 mM氯化胆碱
55毫米MgCl 2
5毫米氯化钾
10 mM管道
10毫米HEPES
20毫米CH 3 COONH 4
9.2毫米CaCl 2
用KOH调节pH 6.8
pH 6.40-6.75或6.80-7.40的标准pH溶液
0.5 M pH值为6.40-6.75的管道; 用KOH调节pH
pH值为6.80-7.40的0.5 M HEPES ；用KOH调节pH
BCECF解决方案
2 mM右旋糖酐（10-kD）共轭BCECF
100 mM天门冬氨酸钾
10毫米HEPES
0.05％NP-40，pH 7.2
用KOH调节pH 7.2
注意：应使用Navi h pH计（HORIBA）将ASW，改良的ASW和标准溶液的pH调节至23°C ，其分辨率为0.001 pH单位。与pH i测量相关的所有实验均应在23 °C下进行。

致谢

这项工作得到了日本科学促进协会KAKENHI（批准号为17K07405），武田科学基金会以及东京大学大气与海洋研究所提供的合作计划的支持。该协议改编自Moriwaki等。，2013年和Hosoda等人。，2019（用于pH i校准）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

伦理

实验是在御茶之水大学进行的。根据御茶水大学的指导。并由御茶之水大学动物研究伦理委员会批准。

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