材料和试剂

中号icropipette提示（吉尔森TM移液器经典TM ，目录号：吉尔森F12360x和，STARLAB ，TipOne ® ，目录号：1812至40年，一一一〇年至1840年，1110- 3800）
注意：移液精度对于获取可靠的原始数据至关重要。使用电动多通道移液器（100 µl）可能会有所帮助（例如，Sartorius AG）

将200μl TipOne ®移液器吸头（无菌），黄色，圆锥形，机架（STARLAB，目录号：S1111-6701-C）
0.22-μm过滤器
一次性塑料血清移液管（Sarstedt ，目录号：86.1254.001）
用于细胞培养的1升和2升玻璃烧瓶（SciLabware ，目录号：1135 / 26D和1135 / 30D）
50 ml管（Sarstedt ，目录号：62.547.004）
15 ml管（Sarstedt ，目录号：62.554.002）
1.5 ml微管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
Stellar Scientific离心管，高速（20,000 x g ），50 ml，红色螺帽（Stellar Scientific，目录号：T15-701）
Stellar Scientific离心管，高速（20,000 x g ），15 ml，红色螺旋盖（Stellar Scientific，目录号：T15-701）
圆形92 x 16毫米培养皿（Sarstedt ，目录号：82.1473）
一次性塑料柱（Thermo Scientific，目录号：29922）
非灭菌96孔平底透明板（Corning，目录号：9017）
带透明底的非无菌96孔平底黑色板（Corning，目录号：3631）
Zeba TM Spin脱盐柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：89882）
纯化的质粒含His-标记的生物传感器为乳糖/ IPTG诱导型表达（例如，钙传感MatryoshCaMP6（阿斯特等人在载体中，2017年）的pRSET -B）为镍-次氮基三乙酸（的Ni-NTA）亲和层析，以及作为空载体，或缺少在BL21 GOLD（DE3）细胞中表达的FPs （阴性对照）的生物传感器骨架蛋白。质粒和菌株在下面更详细地描述
菌株
大肠杆菌BL21金（DE3）[ fhuA2 [ lon ] ompT gal（λDE3）[ dcm ] ∆ hsdS ；λDE3 = λsBa mHIo ∆ EcoRI -B int：:( lacI :: PlacUV5 :: T7 gene1）i21 ∆nin5 ]（New England Biolabs，目录号：C2527I）

cOmple te TM ULTRA片剂，小型，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（默克公司，目录号：11836170001）
Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen，目录号：30210）
Bradford分析试剂盒（Bio-Rad，目录号：500-0006）
MOPS（3-（N-吗啉代）丙烷磺酸）缓冲液（Carl Roth，目录号：6979.3）
咪唑（AppliChem，目录号：A1073,0500; UN3263）
D-（+）一水合葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：14431-43-7）
乳糖（梅克，目录号：7660.0250）
BSA（牛血清白蛋白； Carl Roth，目录号：0163.3）
Bacto TM胰蛋白（（BD BioSciences ，目录号：211705）
Bacto TM酵母提取物（BD BioSciences ，目录号：212750）
氯化钠（Carl Roth，目录号：3957.1）
Bacto TM琼脂（BD Biosciences，目录号：214030）
质粒选择所需的抗生素。例如：氨苄青霉素矢量的pRSET -含B MatryoshCaMP6 （西格玛- Aldrich公司，目录号：69-53-4）
氢氧化钠（Sigma - Aldrich，目录号：1310-73-2）
氯化钙（Sigma - Aldrich，目录号：10043-52-4）
4 - 20％的Mini-PROTEAN ® TGX TM预制普罗特EIN凝胶，10孔，50微升（生物-R广告，目录号：4561094）
4个SDS样本缓冲区（MERK，目录号：70607-3）
PageRuler预染的蛋白梯（赛默飞世尔科技，目录号：26616）
Pierce TM 6xHis蛋白标签染色试剂组（Thermo Fisher Scientific，目录号：24570）
具有抗生素的溶源性肉汤（LB）液体培养基（请参阅食谱）
LB固体培养基（请参阅食谱）
自动诱导培养基（对于组合物和说明，请参见[R ecipes）
裂解缓冲液（请参见食谱）
洗涤缓冲液（请参见食谱）
洗脱缓冲液（请参见配方）
最终缓冲区（请参见食谱）
配体结合测定缓冲液（请参见食谱）
考马斯亮斑缓冲液（请参阅食谱）
羧苄青霉素的储备溶液（见配方）
运行缓冲区（请参见食谱）

设备

标准微量移液器或多通道（8或12通道）移液器（用于100 µl）（例如，Sartorius AG，目录号：725240）
pH计（InoLab ® pH值级别1，目录号：72.690.001）
声波发生器（Branson Sonifier细胞破坏器B15）
离心机（海蒂诗Rotanta 460 / 460R）
酶标仪具有可调节的带宽（火花® ，Tecan公司）
荧光体视显微镜用于大视野观察（蔡司，型号：Axio Zoom.V16）
的Eppendorf Thermomixer中® C（的Eppendorf，目录号：5382000015）
高压灭菌器（Systec G mbH，型号：Systec V-150）
迷你-PROTEAN ®利垂直电泳细胞（生物-R广告，目录号：1658004）
NanoDrop 2000（LabX ，目录号：LV40609601）
的Eppendorf Thermomixer中® C（Eppendor ˚F ，目录号：5382000015）
的Eppendorf热块SmartBlock TM 1.5米升（Eppendor ˚F ，目录号：5360000038）
Gel Doc XR +凝胶文档系统（Bio -R ad，目录号：1708195）

软件

Tecan公司相关的软件（星火® ，Tecan公司生命科学）
Excel（Microsoft，Microsoft Office Professional 2016）
MyCurveFit 2019（MyCurveFit ，MyAssays Limited）

程序

一种。纯化的制备ð比例荧光生物传感器

大肠杆菌的转化
解冻的DNA（携带生物传感器和阴性对照质粒微量制备物。例如，MatryoshCaMP6（阿斯特等人，2017）和矢量的pRSET -B ）上的冰和等分BL21 GOLD（DE3）感受态细胞的10分钟。
向细胞中加入10-50 ng质粒，并在冰上放置30分钟。
注意：可以使用NanoDrop设备进行DNA定量。

使用42°C的加热块进行45-60 s的热冲击。
放在冰上2分钟。
通过在37°C下以200 rpm摇动，用800 µl LB培养基恢复细胞1 h 。
注意：可以使用SOC（超级理想肉汤）培养基（一种富含营养的细菌生长培养基）代替LB培养基，以提高转化后的回收率。

以11,000 x g离心5-10 s。
除去大部分上清液，并保持约100-200 µl。
将沉淀的细胞在剩余的LB培养基中重悬，然后将平板稀释液稀释到含有相应抗生素（此处为羧苄青霉素100）的固态LB平板上（稀释取决于转化效率） μ克/毫升（见配方小号）。
注意：要优化菌落密度，可将不同体积（即30和170 µl）铺板或稀释。

使细菌在固体琼脂上于37°C过夜生长。
将板在4 °C下保存过夜以实现荧光团成熟。
克隆选择和细胞培养
可视化cpGFP结构荧光立体显微镜下的荧光，并挑选菌落明亮的（图1）。
注意：在LB固体板上观察到泄漏的表达。菌落的亮度可以用作评估传感器表达水平的标准。

图1.用空载体和GO-MatryoshCaMP6s在固体LB平板上转化的大肠杆菌细胞。AB 。用空载体转化后获得的菌落。Ç - d 。用GO-MatryoshCaMP6s传感器转化的细胞。所述的荧光的大肠杆菌细胞中使用ZEISS记录Axio上Zoom.V16荧光立体显微镜放大和GFP过滤器设置（λ EX四十○分之四百七nm和λ EM 50分之525纳米，与分束器在λ EM 495纳米）。使用明场照明（A，C）和GFP激发进行荧光检测（B，D）可视化菌落。比例尺s = 1毫米。

对于这3个生物学复制品中的每一个，请向5 ml的LB液体培养基（含用于选择质粒的抗生素）中接种1个独立的亮菌落，并在LB加抗生素的LB中于37°C和200 rpm摇动下生长过夜（图2）。
对于每个生物复制品，在一个大烧瓶中用5 ml预培养物接种200 ml含抗生素的自动诱导培养基（请参阅食谱），并在37°C的黑暗中于220 rpm的摇床上生长2 h （图2）。。使用剩余预培养物中的样品来产生甘油储备。
ñ OTES：

为了获得最佳的蛋白质产量并避免毒性，应使用自动诱导培养基（在此处提供详细信息）代替IPTG，表达生物传感器的细胞应在20°C而不是37°C下生长。自动诱导培养基用于获得乳糖诱导型表达系统的高水平重组蛋白表达。它不需要添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），并且避免了在确定IPTG补充时间时监测光密度（OD）的限制。培养基含有以不同速率代谢的葡萄糖和乳糖。葡萄糖最初是受欢迎的，并抑制启动子活性。一旦葡萄糖被消耗掉，抑制将被减轻，乳糖导致转录的诱导。
自动诱导培养基用于乳糖/ IPTG诱导表达系统，否则必须定制协议的这一部分。
甘油库存是通过将细胞培养物与含有50％w / v甘油的LB培养基1：1混合而产生的。
生长200 ml培养物时，培养瓶的容量应为1或2L 。烧瓶的装填量不要超过总体积的20％，以确保最佳的充氧效果。
在37°C的初始温育对于加快单个菌落中大型培养物的生长至关重要。不要延长孵育时间，因为稍后可能会导致可溶性生物传感器的数量减少和包涵体的出现增加。
转移培养至20℃和在黑暗中以220rpm生长48小时，以避免任何光漂白FP的小号（图2）。
离心培养物，通过使用高速50ml离心管30分钟，以20,000 X克于4 ℃，弃去上清液并在-20℃下过夜（图2）冻结沉淀的细胞。不要跳过此冷冻步骤，因为它有助于纯化过程。表达传感器的细胞应呈淡黄色沉淀物。
ñ OTE小号：

可以通过冷冻和解冻沉淀物来增加纯化蛋白的产量，这有助于破坏细胞。
应使用20,000 xg的高速离心管，以避免离心过程中管子破裂。可替换地：正常falcon管可以通过减小速度至17中使用，000 X克的方式，以防止任何泄漏。

图2. GO-Matryoshka生物传感器在大肠杆菌中的表达。W¯¯从殖民地的筛选，直到expresse的收获在实验开始的orkflow d生物传感器，亮黄色沉淀物。

生物传感器纯化
在冰上解冻沉淀。
通过在5 ml含蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液中上下吸液，立即重悬细胞。
在冰上将细胞悬浮液超声处理到试管中（10-15个循环，每个循环包括10秒钟的超声处理和10-15秒钟的休息）。在此步骤上要小心，因为重要的是最佳破碎细胞，同时防止样品过热，这可能导致蛋白质变性。此步骤对于蛋白质样品的质量至关重要。
注意：请勿加热样品（例如在超声处理过程中），这可能导致不希望的蛋白质变性和聚集。

离心升通过使用高速15ml离心管（4℃; 20000 ysate X克）为至少30分钟。
在离心过程中，通过将1-2 ml最终体积的Ni-NTA琼脂糖珠材料添加到色谱柱中（放置在其支架上）来准备色谱柱。
在室温下，通过向柱中添加5-10 ml洗涤缓冲液洗涤Ni-NTA珠子3次，然后使其在重力作用下流过。
将裂解液添加到该列中。允许裂解液通过重力流过。带His标签的生物传感器将与Ni-NTA磁珠结合。
用5-10 ml洗涤缓冲液在重力作用下洗涤3次。
通过重力流动用多达5个连续部分的300 µl洗脱缓冲液洗脱传感器，并在分析前于4°C的暗处保存至少24 h，然后进行分析，以使所有纯化的生物传感器成熟。或者：将洗脱液在37°C下孵育3小时。
注意：由于LSSmrange的成熟时间比衍生物长（Shcherbakova等人，2012），因此4度温育对于获得完全成熟的FP至关重要。

为了除去咪唑，盐污染物和结合的配体，可以使用Zeba TM Spin脱盐柱进一步纯化洗脱液，最终体积为130 µl（根据制造商的说明）。
纯化生物传感器的质量控制
根据制造商的方案进行Bradford分析以确定蛋白浓度。建议浓度至少约为1 mg / ml，否则建议以减少的洗脱体积重复纯化。

注意：生物传感器可以在黑暗中于4°C下存储几周。

B.将10-20 µg蛋白质样品装入SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）（图3）。

将样品与1x SDS样品缓冲液混合，加水至最终体积20-40 µl。
将样品在90°C下煮沸5分钟，以加快变性过程。
注意：变性后，样品可以保存在室温下直至上样。

将样品上样至SDS-PAGE凝胶孔中。
电泳后，根据制造商的说明进行6xHis亲和标签蛋白（Pierce 6xHis染色试剂组）的染色，并进行考马斯染色以进行总蛋白可视化。
通过使用可见光（库马西染色）和在280-310 nm波长的紫外光激发下进行蛋白质检测（6xHis亲和标记染色）。
注意：对6xHis亲和标记的蛋白进行染色需要每条带5.6 pmol His标记的蛋白才能用CCD相机检测，或者每条带57 pmol的His标记蛋白才能用UV透射仪检测。

图3.在大肠杆菌中表达的GO-MatryoshCaMP6s传感器的分离。实验的时间表是从沉淀的细胞开始，直到通过亲和色谱法洗脱生物传感器。样品负载编入SDS-PAGE凝胶是：MW（预染分子量标志物），CE（粗提取物），L （升ysate ），FT（˚F低通），W（洗涤），和E1-E5（洗脱液从分数1到5）。上凝胶板使用考马斯蓝染色缓冲液染色以进行总蛋白显像，下凝胶板用6xHis Protein Tag Stain Reagent Set（Thermo Fisher Scientific）染色。通过使用UV- ligt激发在280-310nm的波长下进行检测。

C.使用纯化的生物传感器进行体外结合测定

该优化在最终缓冲液（样品稀释即，20毫MOPS，pH 7.0的，见配方）和荧光读取参数
在本节中，协议用户将根据cpGFP和LSSmOrange各自使用各自的最大激发和发射波长的激发，确定每种纯化的生物传感器溶液所需的适当稀释度。用户还将识别出一个单一波长，该波长可同时最大程度地激发cpGFP和LSSmOrange 。

选择蛋白质含量最高的级分，并进行约40倍的预稀释，以获得约5-10 µM的最终浓度。
从预稀释的样品中，制备最终体积为200 µl的稀释系列（1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/10; 1/100），然后装入96 -Well板适用于读取荧光强度和光谱在酶标仪（见ñ OTE）。
注意：尽管使用黑色透明底部96孔板可获得最佳结果，但其成本相对较高。黑色塑料的使用有助于防止孔之间的信号污染，因此在需要精确测量时受到青睐。但是，为了进行初步的传感器表征，我们使用常规的非无菌96孔板将成本降至最低。或者，为了避免孔之间的发光污染，可以将空孔系统地放置在样品之间。

使用SPARKControl软件和以下参数，在酶标仪中测量cpGFP和LSSm稀释系列的橙色荧光强度：（1）cpGFP ：在480 nm激发，带宽为20 nm，在515 nm激发，带宽为15 nm。（2）LSSmOrange ：在440nm处以10nm的带宽激发，在570nm处以15nm的带宽激发。调整读数的增益和z位置，以使测量值大致落在检测器范围的中间。增益预计50-90之间的，而在Z位置时，使用200μl的情况下，在约预期d不应超过130 20000 μ米。
注意：虽然可以通过使用单个中间波长来激发两个FP来找到折衷方案，但是它们的激发最大值是截然不同的，因此对于在快速荧光计中进行体外表征，最好分别激发两个FP。

以440至480 nm之间的2 nm间隔执行激发扫描，以验证哪种激发波长在您的条件下为GFP和LSSmOrange发射提供最大的振幅（图4）。对于GO-Matryoshka生物传感器，通常约为455 nm。

图4.用于检测GO-Matryoshka传感器的激励参数。MatryoshCaMP6的发射光谱表明，将激发波长从440 nm增加到480 nm导致cpGFP发射的荧光强度增加，但稳定的参考LSSmOrange的发射减少。Au .：任意单位。

根据在S teps C1 c和C1 d中获得的发射强度选择最佳稀释系数。稀释系数取决于每台仪器，此处目标强度范围约为20,000个任意单位（au 。），以保持在检测器的最佳范围内而不会导致饱和。仪器的增益系数越低，产生的数据质量越高（噪声越小）。
结合测定
通过对每个生物传感器进行3次生物重复，包括技术重复和裂解物纯化，设计平板的样品加载模式。取决于预期的K d ，包括合适的配体浓度（例如，从0 mM到K d的5倍的稀释系列；使用足够的数据点以获得可靠的载脂蛋白和饱和态以及结合等温线的线性范围）。确保先前选择的稀释因子与此设计兼容，并包括仅包含用于测量背景的缓冲液的控制孔。
注意：添加的组件的顺序无关紧要。但是，我们建议首先添加体积最大的组件，即缓冲液，然后添加体积最小的组件，即生物传感器。根据您的加载方式加载96孔板。为三个殖民地的技术将一式三份从单一的预混（见加载ñ OTE小号）。确保按技术标准份量对4种反应的预混液进行缩放，以确保在移液一式三份时保持1次反应的余量。此外，即使配体浓度不同，也要确保每个孔的最终体积保持相同。应避免孔中有气泡，因为它们可能会影响读数。

注意小号：

由于分析是定量的，因此准确的移液至关重要。使用高精度，在移液和处理移液器时采用最佳实践，确保移液器处于良好状态，确保移液器的正确校准，准备预混液（即避免移取小体积），并缓慢移液以减少移液错误。请勿卡扣柱塞，切勿让任何液体进入轴。
建议孵育时间最少为5分钟。在进行读取之前，必须确保已达到结合平衡。通常需要花费几分钟的时间来准备96孔板。
建议包括纯缓冲孔和空白。
使用平板读数器如所描述的读出荧光在步骤C1 ，以获得三组数据的各孔：发射光谱和点测量为cpGFP结构和LSSmOrange的GO-俄罗斯套的最大强度的传感器（图5）。

图5. excel工作表的屏幕快照，显示来自一个结合测定实验的数据和参数的示例。三组数据被进行点测量和发射光谱后获得的扫描的GO- MatryoshCaMP6s在生物传感器结合测定。

分析每个生物重复的数据
设置默认ë Xcel公司工作表，它可被用作模板用于自动分析的前面部分中所获得的数据（图5）。这可以通过输入处理数据所需的公式并通过简单粘贴其原始值来从任何实验中生成图形来完成。该模板必须包括：
计算三次重复的平均值。
对于每种条件和每种数据类型（cpGFP和LSSmOrange强度以及发射光谱）减去缓冲液的背景荧光。
通过以图形方式将荧光强度表示为波长来绘制数据，并生成记录在不同配体浓度下的发射光谱，以量化响应分析物浓度的强度变化（Bermejo等人，2011）（图6）。

FIGUR Ë6.纯化，使用俄罗斯套（结合测定此处GO- MatryoshCaMP6s）生物传感器。A. 96孔板，带有GO- MatryoshCaMP6s和增加的钙浓度，颜色代码从绿色（无钙）到红色（钙为10 µM），一式三份。B. MatryoshCaMP6的光谱，在455 nm处激发。钙浓度的增加导致cpGFP发射的荧光强度增加，而参考LSSmOrange发射保持稳定（由于渗漏而略有增加）。[ au 。]：任意单位。数据表示为三个技术重复的平均值。

注意：观察到渗漏发生，并导致参考FP LSSmOrange的荧光强度轻微但明显的增加。^ h H但是，通过使用两个激发波长不同的点测量应该摆脱这种影响。

通过使用三个生物学重复来测量亲和力：
使用以下公式计算每种配体浓度在520 nm / 57 5 nm发射时的强度比（R）：
R = FI 520nm / FI 57 5 nm

计算的R 0是无底物的R的值。
计算 R的值[R在由R中减去特定的钙浓度0为如下：
R = R-R 0

计算R / R 0 。
通过使用暗算浓度数据例如，MyCurveFit 。
X轴使用对数刻度。
通过使用，应用的S形拟合例如，MyCurveFit ，并计算ķ d （图7）。

图7.纯化的GO-Matryoshka的体外饱和曲线。MatryoshCaMP6s的钙结合等温线。使用纯化的传感器对不同钙浓度下的传感器输出进行分析。如先前所述确定钙结合（Ast等人，2017）。数据表示为三个生物学重复的平均值（平均值± SEM ，来自n ＝ 3的生物学重复）。

菜谱

LB含抗生素的液体培养基
将10 g Bacto TM胰蛋白,、 10 g氯化钠和5 g Bacto TM酵母提取物溶于800 m l M illiQ水中
用NaOH调节至pH 7.0
调整最终体积至1L中号illiQ水
在121°C下高压灭菌20分钟
使用前，添加与选择所需的抗生素抗性相对应的抗生素
LB固体培养基（pH 7.0）
将10 g Bacto TM胰蛋白,、 10 g氯化钠和5 g Bacto TM酵母提取物和15 g琼脂溶解在800 ml M illiQ水中
用NaOH调节至pH 7.0
调整最终体积至1L中号illiQ水
在121°C下高压灭菌20分钟
让其冷却至约50-60°C，然后添加与选择所需的抗生素抗性相对应的抗生素
自动感应培养基（pH 7.0）
LB液体培养基

0.05％w / v D-葡萄糖

0.2％w / v乳糖

裂解缓冲液（pH 7.0）
20毫米MOPS

每50 ml溶液1个cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物

注意：缓冲区可以4度保存几个月。通过广泛涡旋溶解1片cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物。

洗涤缓冲液（pH 7.0）
20毫米MOPS

每50 ml溶液1个cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物

注意：缓冲区可以4度保存几个月。通过广泛涡旋溶解1片cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物。

洗脱缓冲液（pH 7.0）：
20 mM MOPS缓冲区

250 mM咪唑

每50 ml溶液1个cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物

注意：缓冲区可以4度存储。连续1个月的cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒通过广泛涡旋溶解。

最终缓冲液（pH 7.0）
20毫米MOPS

注意：缓冲区可以4度保存几个月。通过广泛涡旋溶解1片cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物。

配体结合测定缓冲液（pH 7.0）
20 mM MOPS和0至10-20 mM氯化钙

注意：缓冲区可以4度保存几个月。通过广泛涡旋溶解1片cOmplete TM ULTRA Tablet Mini蛋白酶抑制剂混合物。

考马斯染色缓冲液
考马斯亮蓝R250染色剂

10％v / v乙酸

50％v / v甲醇

羧苄青霉素原液：
D在9.5 ml M illiQ水中溶解1 g羧苄青霉素二钠
调整最终体积至10毫升
˚F ILTER-除菌通过使用0.22微米的过滤器
注意：小号羧苄青霉素的滴答溶液可以储存在- 20 ℃下。

运行缓冲区
25 mM Tris

192 mM甘氨酸

0.1％（w / v）的SDS

致谢

作者非常感谢来自德国赠款支持研究联合会在德国（DFG，德国研究基金会）“的精妙战略-EXC-2048 / 1-项目ID 390686111，和亚历山大·冯·洪堡教授到WBF。非常感谢CEA增强的欧洲人才计划和ANR-19-CE13-0007“ PHLOWZ”的支持（HJ）。

利益争夺

WBF是Matryoshka技术的专利（美国申请号15 / 438,078）的作者。在剩余的作者有没有CON佛罗里达州的利益ICT或竞争的利益申报。

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