材料和试剂

1. 戊酸F-127（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：P3000MP）

DMSO中20％（w / v）的库存。一种两亲的温和洗涤剂，促进Fura-2 AM增溶。

2. 丙磺舒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：P36400）

抑制剂的阴离子转运改善细胞内荧光团的积累。

3. Fura-2乙酰氧基甲酯（Fura-2 AM）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：F1225）

4. Digitonin（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：300410）

5. EGTA（亚乙基双（氧亚乙基）二胺四乙酸）（默克，西格玛奥德Aldrich公司TM ，目录号：E3889）

6. 氯化钙（CaCl 2 ）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：C1016）

7. 氯化钾（KCl ）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：P9333）

8. 磷酸氢二钾（KH 2 PO 4 ）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：P0662）

9. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：S0876）

10. 硫酸镁（MgSO 4 ）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：M7506）

11. 氯化钠（NaCl）（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：S7653）

12. HEPES（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：H0887）

13. 葡萄糖（Merck，Sigma- Aldrich TM ，目录号：G8270）

14. 改良的Tyrode的上样缓冲液（MTLB）（pH 7.4）（请参阅配方）

15. 无Ca 2+ （pH 7.4）的MTLB （请参阅食谱）

设备

纽鲍尔室
具有快速过滤器附件的荧光分光光度计（PerkinElmer，型号：LS-55）或荧光分光光度计HITACHI DW 7000
台式离心机（Eppendorf，型号：5415D）
石英SUPRASIL Macro / Semi-micro Cell（PerkinElmer，目录号：B0631132）

软件

FL WinLab （珀金埃尔默）
Excel中® （微软）
OriginPro 6（OriginLab Corporation，https : //www.originlab.com/ ）

程序
储备溶液/缓冲液
5 mM 蒸馏水中的Digitonin （MW：1229.3 g / mol）储备液。
蒸馏水中500 mM （pH 8）的EGTA（MW：380.35 g / mol）储备液。
DMSO中1 mM的Fura-2 AM（MW：1001.86 g / mol）储备液。
修改过的Tyrode的加载缓冲区（MTLB）（请参见食谱）。
没有Ca 2 +的MTLB （请参阅食谱）。
在DMSO中以1 M的丙磺舒（MW：285.36 g / mol）储备液。
帕拉斯ITE装载带fura-2 AM
使用Neubauer箱计数寄生虫并计算标题。
通过以600 xg离心2.5分钟，在指数期收集1 x 10 8个寄生虫，并弃去上清液。
在29°C下用500μlMTLB洗涤两次，并弃去上清液。
重悬寄生虫在500μ 升MTLB并添加1μ 升的Fura-2 AM （1：1000 FR OM库存到最终浓度为1μM ），1.2微升丙磺舒（3：1250）从库存到终浓度2.4毫摩尔），和1.25 μ lpluronic 酸（1：400°F RO 米库存到最终浓度0.05％）。
在连续搅拌下于黑暗中于29° C下孵育寄生虫2小时。
在存在或不存在Ca 2+的情况下，用500 µl 加载缓冲液洗涤Fura-2加载的寄生虫。
将500 µl 的寄生虫悬浮液转移到石英比色皿中，然后将其放入分光光度计中，在29°C下缓慢搅拌。
将分光荧光计调整在340和380 nm处进行激发（Ex），并在510 nm处进行发射（Em ）。
使用FL WinLab 软件开始测量。

控制项
要结束实验，请添加以下试剂（它们产生的数据是分析结果所必需的）：

当监测迹线稳定（斜率恒定）时，意味着Ca 2+ 不变，进一步添加30 µM的洋地黄皂苷以获得最大荧光比（R max ）。
等待直到监视器迹线再次稳定，然后添加10 mM的EGTA，以获得最小的荧光比（R min ）。

数据分析
每个实验必须至少一式三份进行。
[（Ca 2 + ）i ]的评估如Grynkiewicz 等人所述。（1985 ）通过应用以下等式：
[Ca 2 + ] i = K d × （R – R min / R max – R）× F min / F max
K d ：Fura-2的解离常数（244 nM ）。

R ：在给定的实验条件下，通过快速滤光片附件在340 nm和380 nm之间交替激发而获得的510 nm荧光发射率。

R max ：在饱和Ca 2+ 浓度下（在洋地黄素存在以使寄生虫质膜透化的情况下）在340 nm和380 nm之间交替激发所得到的510 nm荧光发射率。

R min ：在不存在Ca 2+ 的情况下（在洋地黄素存在和EGTA存在下螯合任何剩余的Ca 2+ ），在340 nm和380 nm之间交替激发后获得的510 nm荧光发射率。

F max ：饱和Ca 2+ 浓度下Fura-2在380 nm处的荧光

F min ：在不存在Ca 2+ 的情况下Fura-2在380 nm处的荧光

加入30 µM洋地黄皂苷后可获得最大值和最小值，这可使Ca 2+ 流入细胞内部，因此Fura-2将显示出最大的荧光。然后，添加10 mM EGT 以将所有Ca 2+ 螯合至标称0水平（最小荧光）。

交的采集数据必须转换为用于Excel的适当格式® ，然后将这些行和列应在被复制OriginPro 软件和被绘制成一个XY图，其中的X是时间值和Y 340/380关系值或细胞内Ca 2+ 浓度（nM ）。

笔记

1. 强烈建议使用最近（最多1个月）从小鼠身上分离的寄生虫，而不是经过多次培养后的寄生虫。Fura-2 AM必须裂解为Fura-2，并且这种裂解是通过未指定的细胞内酯酶进行的。与许多传代后的寄生虫相比，最近从感染小鼠（或感染的巨噬细胞）中获得的寄生虫具有更高水平的酯酶，因为这些酶在频繁通过的寄生虫培养中因选择而丢失。

2. 成功寄生虫的潜伏时间可能会非常不同，具体取决于给定时刻寄生虫种群中存在的酯酶的数量，这是非常可变的。在某些情况下，2小时的孵育就足够了，但在其他情况下，加载时间甚至需要6小时。甚至在某些情况下，由于在该特定批次中完全缺乏酯酶，在某些情况下可能无法实现Fura 2的上样。

3. 由于Fura-2 AM是感光性的，因此强烈建议用铝箔纸覆盖等分试样。

4. 这是众所周知的是的Fura-2 AM等acetoximethyl 从其他荧光钙酯2+ 指标（如RHOD 2-AM和的Fluo 3-AM）可以是accumu 迟来和TRA nsformed到内部像面内质网的细胞器的荧光物质，线粒体和细胞核。就这一点而言，必须考虑用于加载荧光探针的孵育时间和温度的组合以避免这种现象。另一方面，这仍然可以构成很大的优势，因为可以通过控制孵育时间和温度合理地用于将这些荧光探针加载到这些细胞器中，从而完成研究线粒体和内质中Ca 2+ 运动的艰巨任务。网状结构，否则很难测量（例如，参见Benaim 等人，2006）。

[R ecipes

改良的Tyrode上样缓冲液（MTLB）（pH 7.4）
137毫米氯化钠

4毫米氯化钾

1.5毫米KH 2 PO 4

8.5 mM的Na 2 HPO

11 mM葡萄糖

1毫米CaCl 2

0.8毫米MgSO 4

20毫米HEPES-NaOH

无Ca 2+ （pH 7.4）的MTLB
137毫米氯化钠

4毫米氯化钾

1.5毫米KH 2 PO 4

8.5毫米Na 2 HPO 4

11 mM葡萄糖

0.8毫米MgSO 4

100 µM EGTA

20毫米HEPES-NaOH

致谢

由委内瑞拉国家技术创新基金会（FONACIT）（拨款2017000274和2018000010）以及委内瑞拉中央人民大学和委内瑞拉中央大学（CDCH-UCV）资助PG-03-8728-2013 / 2 GB该协议实质上是从Benaim 等人提取的。（2014）和Rodriguez - Duran 等。（2019年）

利益争夺
没有利益冲突或利益冲突。

参考文献
Barreto-Chang，OL和Dolmetsch ，RE（2009年）。使用Fura-2 AM对皮质神经元进行钙成像。Ĵ显示精通（23）：e1067。
Benaim，G.，Casanova，P.，Hernandez-Rodriguez，V.，Mujica-Gonzalez，S.，Parra-Gimenez，N.，Plaza-Rojas，L.，Concepcion，JL，Liu，YL，Oldfield，E. ，Paniz-Mondolfi，A.和Suarez，AI（2014）。决奈达隆，一种胺碘酮类似物，具有改进的抗墨西哥利什曼原虫功效。抗微生物剂Chemother 58（4）：2295-2303。
Benaim，B.和García ，CR（2011）。靶向钙稳态作为南美锥虫病和利什曼病的治疗方法-综述。生物医学杂志28（3）：471-481。
Benaim，G.，Garcia-Marchan，Y.，Reyes，C.，Uzcanga，G.和Figarella，K.（2013）。墨西哥利什曼原虫质膜中鞘氨醇敏感的Ca 2+ 通道的鉴定。Biochem Biophys Res Commun 430（3）：1091-1096。
Benaim，G.，Paniz-Mondolfi ，AE，Sordillo ，EM和Martinez- 索蒂略，N。（2020）。破坏细胞内钙稳态作为治疗克氏锥虫的靶点。前细胞感染微生物10：46 。
Benaim，G.，桑德斯，JM，加西亚Marchan ，Y.，科利纳，C.，里拉，R.，火山口AR，Payares ，G.，Sanoja ，C.，布尔戈斯，JM，Leon- 罗塞尔，A.， Concepcion，JL，Schijman ，AG，Levin，M.，Oldfield，E。和Urbina，JA（2006）。胺碘酮具有内在的抗克氏锥虫活性，并与泊沙康唑协同作用。医学化学杂志49（3）：892-899。
Burza ，S.，Croft，SL和Boelaert ，M.（2018）。利什曼病。柳叶刀392（10151）：951-970。
García-García ，V.，Oldfield，E.和Benaim，G.（2016年）。结核病药物SQ109 对Leishmaniamexicana 生长的抑制作用。抗微生物剂Chemother 60（10）：6386-6389。
Gil，Z.，Martinez- Sotillo ，N.，Pinto-Martinez，A.，Mejias ，F.，Martinez，JC，Galindo，I.，Oldfield，E.和Benaim，G.（2020年）。的SQ109抑制增殖Leishmaniadonovani 通过细胞内Ca的破坏2+ 稳态，崩线粒体电化学势（ΔΨ 米）和影响acidocalcisomes。Parasitol Res 119（2）：649-657。
Grynkiewicz ，G.，Poenie ，M。和Tsien ，RY（1985）。新一代Ca 2+ 指示剂具有大大改善的荧光特性。生物化学杂志260（6）：3440-3450。
莫雷诺（SN），席尔瓦（Silva），维尔西（AE）和多坎波（1994）。克鲁氏锥虫无细胞溶质的钙升高是细胞入侵所必需的。J Exp Med 180（4）：1535-1540。
Patel，A.，Hirst，RA，Harrison，C.，Hirota ，K. and Lambert，DG（2012）。使用Fura-2 测量全细胞悬液中的[（Ca 2+ ）] i 。方法分子生物学937：37-47。
Rodriguez-Duran，J.，Pinto-Martinez，A.，Castillo，C.和Benaim，G.（2019）。克氏锥虫鞘氨醇依赖的质膜Ca 2+ 通道的鉴定和电生理特性。FEBS J 286（19）：3909-3925。
Santos，SS，de Araujo，RV，Giarolla，J.，Seoud，OE和Ferreira，EI（2020）。寻找查加斯病，利什曼病和血吸虫病的药物：综述。Int J 抗微生物剂55（4）：105906。