材料和试剂

6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：130184）
12孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：130185）
HEK293细胞（ATCC，目录号：CRL-1573）
NG108-15细胞（ATCC，目录号：HB-12317）
MCF-7电池（ATCC，目录号：HTB-22）
[6,7- 3 H（N）]-RX821002（PerkinElmer，目录号：NET1153250UC）
[7-甲氧基-3 H]-哌唑嗪（PerkinElmer，目录号：NET823025UC）
[5,7- 3 H] -CGP12177（PerkinElmer，目录号：NET 1061250UC）
[ 125 I]-血管紧张素II，[ 125 I]-血管紧张素II（PerkinElmer，目录号：NEX105050UC）
[N-甲基-3 H]-东pol碱氯甲烷，[ 3 H] -NMS（PerkinElmer，目录号：NET636250UC）
盐酸苯酚胺（西格玛，目录号：P7547）
盐酸劳沃斯辛（ T oc ris ，目录号：0891）
盐酸烯丙诺尔（Sigma，目录号：A8676）
血管紧张素II，血管紧张素II（Calbiochem ，目录号：05-23-0101）
阿托品（西格玛，目录号：A0132）
盐酸多西环素（Sigma，目录号：D9891）
Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM（Sigma，目录号：D6429-500ML）
胎牛血清FBS（HyClone ，目录号：SH30396.03）
青霉素-链霉素溶液（HyClone ，目录号：SH40003.01）
次黄嘌呤（Sigma，目录号：H9377）
氨基蝶呤（Sigma，目录号：A3411）
胸苷（Sigma，目录号：T9250）
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（Sigma，目录号：P1274）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％）（Sigma，目录号：T4049-100ML）
Opti-MEM（Gibco，目录号：31985-070）
Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668-019）
10×磷酸盐缓冲液，10×PBS（Sigma，目录号：P5493-4L）
NaOH（Sigma，目录号：S5881-500G）
闪烁溶液，ScintiVerse TM BD鸡尾酒（Fisher C hemical，目录号：SX18-4）
高密度聚乙烯小瓶，容量20毫升（RPI，目录号：121043）
聚-L-赖氨酸（请参阅食谱）
NG108-15生长培养基（请参阅食谱）
DMEM完全培养基（请参阅食谱）
3 H-RX821002绑定解决方案（请参阅食谱）
3 H-RX821002结合溶液，其中含有10 µM 鼠李糖苷（请参见食谱）

设备

低速轨道振动筛（西南科学，目录号：SBT30）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）
细胞培养培养箱（Thermo Scientific ，Forma II系列水套式CO 2 培养箱）
组织培养显微镜（Nikon，型号：Eclipse TS100）
闪烁计数器（日立，型号：AccuFLEX LSC- 8000c）

软件

微软Ë Xcel公司

程序

内源性的量化α 2B -AR 在细胞表面
有三种不同的α 2种-AR亚型：α 2A -AR，α 2B -AR和α 2C -AR。NG108-15 神经母细胞瘤，神经胶质瘤细胞仅表达α 2B -AR但不是α 2A -AR和α 2C -AR，而MCF-7乳腺癌细胞小号同时表达α 2B -AR和α 2C -AR但不是α 2A -AR 。
细胞培养
要预涂6孔板，请在每孔中加入2 ml聚L-赖氨酸（R e cipe 1）并在37°C下孵育15分钟。洗板两次，每次用1 ml无菌MilliQ- 水冲洗。
将NG108-15或MCF-7细胞接种在6孔板上，每孔总共 5 × 10 5个细胞。每个实验总共需要6口井。3个孔用于测量总放射性配体结合，另外3个孔用于测量非特异性放射性配体结合。
在37°C 下在95％空气和5％CO 2 下的NG108-15生长培养基（R e cipe 2）中培养NG108-15 细胞。
培养MCF-7细胞在DMEM完全培养基（R ë CIPE 3）下95％空气和5％CO 2 在37 ℃。
当细胞变为70-90％融合时，进行放射性配体结合。
放射性配体结合
完全吸出生长培养基。
为了测量总放射性配体结合，加入500微升3 的浓度2 H-RX821002 nM的在DMEM中稀释（R Ë CIPE 4）。
为了测量非特异性放射性配体结合，加入500μl的3 在2 H-RX821002 nM的含非放射性的[R auwolscine 在10 μ中号（R Ë CIPE 5）。
在低速轨道振荡器上以20-40 rpm恒定摇动在室温（RT）下孵育细胞90分钟。
吸出放射性配体结合溶液并洗涤细胞两次，每次用1 ml 1×PBS（10×PBS用的MilliQ -水）在RT 5分钟振摇以除去过量的放射性配体。
移去PBS，加入500 µl 1 M NaOH，在室温摇动下消化细胞2小时。
向每个高密度聚乙烯小瓶中加入4 ml闪烁溶液，将细胞裂解液转移到小瓶中，并通过颠倒试管或涡旋剧烈混合。
在闪烁计数器中计数放射性。
在另一个小瓶中，加入4 ml闪烁溶液和5 µl放射性配体结合溶液，混合并计算放射性。该数字将用作计算受体编号的输入。

瞬时表达的定量α 2B -AR在细胞表面
细胞培养
将HEK293细胞接种到预先涂有聚L-赖氨酸的6孔板中，每孔总共5 × 10 5个细胞，然后培养细胞在DMEM完全培养基中于37°C过夜。
在组织培养显微镜下检查细胞密度。当细胞变为70-90％汇合时，吸出培养基并加入1.8 ml DMEM。
瞬时转染
α 2B -AR质粒在任何哺乳动物表达载体都可以使用。例如，我们已经使用pEGFP-N1载体在C端生成用GFP标记的α2B -AR（Dong 等，2010 a和2010b ）。根据我们的经验，α为1μg转染2B 中的每个-AR质粒孔的6孔平板是足以实现最大受体表达。
在Eppendorf管中，加入125微升无血清的Opti-MEM和α1微克2B -AR质粒，轻轻混匀，并在室温下孵育5分钟。
在另一管中，添加125μ的Opti-MEM的升和2.5微升脂质体2000的，混合并在室温下孵育5分钟。
合并两种溶液，通过移液3-4次轻轻混合，然后在室温下再孵育20分钟。
将混合物缓慢添加到在1.8 ml DMEM中培养的细胞中，轻轻混合，然后在37°C下培养6 h。
除去细胞培养基，并用1 ml无菌1x PBS洗涤细胞一次。
在37°C下用100μl胰蛋白酶-EDTA处理细胞2分钟，然后加入1 ml DMEM完全培养基。
将细胞从6孔板的每个孔中分成预涂有聚L-赖氨酸（每个孔0.27 ml）的12孔板的四个孔。两个孔用于测量总放射性配体结合，另外两个孔用于测量非特异性放射性配体结合。
在DMEM完全培养基中于37°C下培养细胞24-36 h。
放射性配体结合
完全吸出生长培养基。
为了测量总放射性配体结合，在细胞中加入200 µl 在DMEM中稀释的20 nM 3 H-RX821002 （配方4）稀释
对于非特异性的测定放射性配体结合，加入200微升的3 在20 H-RX821002 nM的加- [R auwolscine 在10 μ 中号（配方5）1 n要细胞。
在室温下以20-40 rpm恒定摇动孵育细胞90分钟。
吸出放射性配体结合溶液并洗涤细胞两次，每次均用0.5 ml的1x PBS在室温摇动5分钟。
移去PBS，加入500 µl 1 M NaOH，在室温摇动下消化细胞2小时。
将细胞裂解液转移到装有4 ml闪烁溶液的小瓶中，充分混合并在闪烁计数器中计数放射性。
向小瓶中加入5 µl放射性配体结合溶液和4 ml闪烁溶液，混合并计数放射性。该数字将用作计算受体编号的输入。

的定量诱导性地表达α 2B -AR 在细胞表面
稳定的HEK293细胞诱导表达α2B -AR的产生通过使用tet开启3G四环素诱导型基因表达系统如所述的p reviously （ż 挂起等人，2016a和2016B ）。
以每孔2 ×10 5个细胞的密度将细胞接种到预先涂有聚L-赖氨酸的12孔板中，并在37°C下于DMEM完全培养基中培养细胞过夜。
要测量强力霉素对α2B -AR表达的剂量依赖性诱导，将强力霉素添加至终浓度为0、2.5、5、7.5、10、20、40、60、80和100 ng / ml，并在37℃孵育24小时℃。
要测量α2B -AR表达的时间依赖性诱导，以40 ng / ml的终浓度添加强力霉素，并将细胞孵育2、4、6、8、10、12、14、16、20、24和36 H。
按照步骤B中所述进行放射性配体结合。

测量其他GPCR的细胞表面表达
在过去几年中，我们已经使用完整的活细胞配体结合测定来量化的几个家族A的GPCR，包括在细胞表面表达α 1A -AR ，α 1B -AR，α 2A -AR，α 2B -AR，α 2C - AR，β 1 - AR，β 2 - AR，血管紧张素Ⅱ型1（AT1R）和2型（AT2R）受体，和M3-muscarinc受体（M3-MR）使用不同的放射性配体（表1）。ø 与完整细胞相关NE问题放射性配体结合测定法是，标记的配体可以是能够诱导受体内在化。例如，Ang II是AT1R 的激动剂，因此与125 I- Ang II 孵育可能诱导AT1R从细胞表面到内体区室的内在化。限制与放射性标记的激动剂一起温育期间受体内化的一种策略是在低温下进行配体结合测定（Filipeanu 等，2004）。

表1.通过完整的细胞配体结合测定法测量GPCR的表面表达
受体
放射性配体
参考文献
α 1 -AR
（α 1A -和α 1B -AR）
[ 3 H]-哌唑嗪
（酚妥拉明）

Duvernay，2009a 和2009b；张等。，2011；Li 等。，2017
α 2 -AR
（α 2A - ，α 2B -和α 2C -AR）

[ 3 小时] -RX821002
（Rauwolscine ）

董和吴，2007; 董等。，2008；Duvernay 2009a和2009b；董等。，2010 a和2010 b ; 张等。，2011；Filipeanu 等。，2015；Li 等。，2017; Wei 等。，2019
β受体
（β 1 -和β 2 -AR）

[ 3 H] -CGP12177
（普萘洛尔）
董和吴，2007; 董等。，2008；Duvernay 2009a和2009b；董等。，2010 a和2010 b ; 张等。，2011；Filipeanu 等。，2015；Li 等。，2017; Wei 等。，2019
AT1R和AT2R
[ 125 I] -Ang II
（Ang II）
Filipeanu 等。，2004；董和吴，2007; 董等。，2008；Duvernay 等。，2009a和2009b；董等。，2010b ; 张等。，2011
M3-MR
[ 3 H] -NMS
（阿托品）
董等。，2010b
（）中指示的药物用于测量非特异性放射性配体结合。

数据分析
使用每分钟崩解值（DPM）计算特定的放射性配体与受体的结合：

特定绑定（DPM）=总绑定（DPM）-非特定绑定（DPM）

计算每个细胞的表面受体数量
为了计算每个细胞表面的受体数目，需要确定用于配体结合测定的总细胞数目。这可以通过以与配体结合完全相同的方式制备细胞培养物来完成，并使用血细胞计数器对每个孔中的细胞数进行计数。
内源性受体

详细计算：
输入配体数（摩尔）=输入配体浓度×输入配体体积
= 2 nM的×5 μ 升= 2×10 -9 M×5×10 -6 L = 10 -14

每DPM的配体数（摩尔）=输入配体（摩尔）÷输入DPM
= 10 -14 摩尔÷输入DPM

每孔样品配体数（摩尔）=样品DPM× 每DPM的配体数
=样品DPM ×10 -14 摩尔÷输入DPM
当1摩尔= 6.02×10 23 分子时，
小号每孔（分子）充足的配体数
=样品DPM× 10 -14 摩尔×6.02×10 23 ÷输入DPM
=样本DPM ×6.02×10 9 ÷总输入DPM
每个细胞的样本配体数量（分子）
=样本DPM ×6.02×10 9 ÷总输入DPM÷单元格数
过表达的受体

实验结果
的表面表达的诱导型表达α 2B -AR
通过使用完整的活细胞的放射性配体如在部分C中所述结合测定法，我们已经测量了α的表面表达2B -AR在稳定的HEK293细胞系，其可诱导地表达α 2B -AR 。我们的数据表明，强力霉素孵育可诱导α2B -AR在细胞表面表达，呈剂量依赖性（图1A）和时间依赖性（见图1B）。多西环素诱导的α 2B -AR表达在约40的浓度达到平稳纳克/毫升（图1A）和诱导20小时（图1B），从而导致共后8.5 × 10 5 α 2B -AR 在所述表面每细胞（张等人升。，2016a和2016B ）。

图1. 强力霉素在HEK293细胞中在细胞表面诱导α2B -AR表达的剂量（A）和时间依赖性（B）。显示的数据是从用100 ng / ml d 土霉素处理的细胞中或诱导36小时后的细胞中获得的特异性结合的百分比（B）（Zhang et al。，2016 a和2016b ）。

的结构决定α 2B -AR 运输到细胞表面
在过去的几十年中，大多数有关GPCR转运的研究都集中在涉及从细胞表面到内体区室的受体内在化以及内在化的受体再循环回到细胞表面的事件（Tan 等，2004； Hanyaloglu和von Zastrow， 2008； Marchese 等，2008； Kang 等，2014）。相反，关于新合成的受体沿着生物合成途径的细胞表面运输的分子机制尚不清楚。通过使用完整的活细胞放射性配体结合测定法d 旁切上面，我们已经成功地确定了一些这对于受体运输到细胞表面或者从内质网（ER）或从高尔基体必需的基序或特定的残基。例如，我们证明了N末端的Y12 / S13残基，第一个细胞内环的L48残基以及C末端的I443 / F444和F436残基的突变显着降低了α2B -AR 的细胞表面表达（图2）（Dong和Wu，2006； Duvernay，Dong 等，2009a和2009b），表明这些残基在α2B -AR生物合成中的重要作用。

图2.抑制的细胞表面运输的α 2B 通过突变残基Y12 / S13，L48，F436和I443 / L444 -AR。野生型和突变的α 2B -AR在HEK293细胞中瞬时表达，并通过使用放射性配体[完整的活细胞的结合测定它们的表面表达3 H] -RX821002。

识别α 2B -AR 表面运输调节
我们还采用完整的活细胞放射配寻找调节蛋白结合试验α 2B -AR 细胞表面的运输。例如，在最近的研究中，我们已经调查了函数48个的Rab GTP酶（李等人，2017 ）和44推定的Rab GTP酶激活蛋白（GAP）（韦等人，2019）中的细胞表面运输α 2B -AR。在这些实验中，从个人拉布突变体或拉布的GAP在表达稳定HEK293细胞中瞬时表达α 2B -AR和其上的细胞表面表达的影响α 2B -AR通过放射性配体如上文所述完整的活细胞的结合测定。我们的研究结果已经表明，Rab43突变体和表达6含有TBC域的蛋白质，即TBC1D5，TBC1D6，TBC1D8B，TBC1D20，TBC1D22A和RN- 特雷显著降低的细胞表面编号α 2B -AR （图3）（李等等人，2017 ；Wei 等人，2019）。这些结果证明了Rab43和6种TBC蛋白在新生GPCR的正向贩运中的重要功能，并揭示了GPCR靶向功能靶点的新型调控机制。

图3的细胞表面运输的抑制α 2B 通过突变Rab43和含有TBC域的蛋白-AR。的Rab43突变体或单独的TBC蛋白在HEK293细胞中瞬时表达稳定表达α 2B -AR和α 2B -AR在表面表达通过完整细胞测定配体使用[结合3 H] -RX821002。

菜谱

聚赖氨酸
溶解聚-L-赖氨酸氢溴酸盐灭菌的 Milli-Q水中的终浓度为25μg / ml
NG108-15生长培养基
DMDM
10％FBS
100单位/毫升尼西林
100 μ 克/ ml链霉素
100 μ 中号次黄嘌呤
0.4 μ 中号氨基
16 μ 中号胸苷
DMEM完全培养基
记忆体
10％FBS
100单位/毫升尼西林
100 μ 克/ ml链霉素
3 H-RX821002装订溶液
由于3 H-RX821002 的浓度在不同批次中有所不同，以下仅是在总体积为250 µl ，比活为63.9 Ci / mmol的含有250 µCi 的小瓶中放射性配体浓度计算的一个示例。

将DMEM中的3 H-RX821002 稀释至2 nM 以测量内源性受体，或稀释至20 nM 以测量过表达的受体。
3 H-RX821002含10 µM r auwolscine的结合溶液
要制备5 mM的狼疮素原液，请将19 mg 盐酸狼疮素溶解在10 ml Milli-Q水中
用配方4制备的放射性配体结合溶液将生黄狼鱼原液稀释至10 µM

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院R35GM136397的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Dong，C.，Nichols，CD，Guo，J.，Huang，W.，Lambert，NA and Wu，G.（2012）。三重基序ARG介导α 2B -肾上腺素能受体与Sec24C / d和出口的相互作用。交通13（6）：857-868。
Dong C.和Wu，G.（2006）。N末端在多个细胞内区室对α2-肾上腺素受体的顺行转运的调节。生物化学杂志281（50）：38543-38554。
Dong C.和Wu，G.（2007）。Rab2和Rab6 GTPases调节肾上腺素和血管紧张素II受体的顺行转运。细胞信号19（11）：2388-2399。
Dong，C.，Yang，L.，Zhang，X.，Gu，H.，Lam，ML，Claycomb，WC，Xia，H. and Wu，G.（2010 a ）。在不同的基序Rab8相互作用α 2B -和β 2 -肾上腺素能受体和差异调节它们的运输。生物化学杂志285（26）：20369-20380。
Dong，C.，Zhang，X.，Zhou，F.，Dou，H.，Duvernay，MT，Zhang，P.和Wu，G. （2010 b ）。ADP-核糖基化因子调节G蛋白偶联受体的细胞表面转运。Pharmacol Exp Ther 333（1）：174-183。
Dong，C.，Zhou，F.，Fugetta，EK，Filipeanu，CM和Wu，G.（2008）。肾上腺素和血管紧张素II受体的内质网输出受Sar1 GTPase的差异调节。细胞信号20（6）：1035-1043。
Dunham，JH，Meyer，RC，Garcia，EL和Hall，RA（2009）。GPR37表面表达通过N末端截短或蛋白质-蛋白质相互作用而增强。生物化学48（43）：10286-10297。
Duvernay，MT，Dong，C.，Zhang，X.，Robitaille，M.，Hebert，TE和Wu，G.（2009 a ）。在第一个细胞内环上的单个保守的亮氨酸残基调节G蛋白偶联受体的ER出口。交通10（5）：552-566。
Duvernay，MT，Dong，C.，Zhang，X.，Zhou，F.，Nichols，CD and Wu，G.（2009b）。G蛋白偶联受体的顺行贩运：内质网出口中的C端F（X）6 LL母题的功能。Mol Pharmacol 75（4）：751-761。
Duvernay，MT，Wang，H.，Dong，C.，Guidry，JJ，Sackett，DL and Wu，G.（2011）。Alpha2B-肾上腺素受体与微管蛋白的相互作用控制了其从内质网到细胞表面的转运。生物化学杂志286（16）：14080-14089。
范Y，李成，郭洁，胡光和吴光（2012）。第一个细胞内环上的单个lys残基可调节内质网输出和α2A-肾上腺素受体的细胞表面表达。PLoS One 7（12）：e50416。
Filipeanu，CM，Zhou，F.，Claycomb，WC和Wu，G.（2004）。Rab1介导的内质网向高尔基体转运在心肌细胞中调节细胞表面表达和血管紧张素II 1型受体的功能。生物化学杂志279（39）：41077-41084。
Hanyaloglu，AC和von Zastrow，M.（2008）。内吞膜运输对GPCR的调控及其潜在意义。Annu Rev Pharmacol Toxicol 48：537-568。
豪瑟（AS），密西西比州阿特伍德（Attwood），密西西比州拉斯克-安德森（Rask-Andersen），希尔伯特（HB）和特拉华州格洛里亚姆（2017）。GPCR药物发现的趋势：新药，靶标和适应症。Nat Rev Drug Discov 16（12）：829-842。
Hilger，D.，Masureel，M.和BK Kobilka（2018）。GPCR信号复合物的结构和动力学。自然结构分子生物学25（1）：4-12。
Kang，DS，Tian，X. and Benovic，JL（2014）。β-抑制蛋白和抑制蛋白域蛋白在G蛋白偶联受体运输中的作用。Curr Opin Cell Biol 27：63-71。
Li C.，Fan Y.，Lan，TH，Lambert，NA and Wu，G.（2012）。Rab26调节高尔基体中α2-肾上腺素能受体的细胞表面转运。生物化学杂志287（51）：42784-42794。
Li C.，Wei Z.，Fan Y.，Huang，W.，Su，Y.，Li H.，Dong，Z.，Fukuda，M.，Khater，M. and Wu，G.（ 2017）。GTPase Rab43控制顺行性ER-高尔基体的运输和GPCR的分类。Cell Rep 21（4）：1089-1101。
Marchese，A.，Paing，MM，Temple，BR和Trejo，J.（2008）。G蛋白偶联受体分选到内体和溶酶体。Annu Rev Pharmacol Toxicol 48：601-629。
Qin，K.，Dong，C.，Wu，G. and Lambert，NA（2011）。G q 偶联受体和G q 异三聚体的非活性状态预装配。Nat Chem Biol 7（10）：740-747。
Shiwarski，DJ，Crilly，SE，Dates，A.和Puthenveedu，MA（2019）。双重RXR基序可调节神经生长因子介导的δ阿片受体的细胞内滞留。分子生物学细胞30（5）：680-690。
Shiwarski，DJ，Darr，M.，特尔默，CA，Bruchez，MP和Puthenveedu，MA（2017）。PI3K 类IIα调节反式高尔基体网络中的δ阿片受体输出。分子生物学细胞28（16）：2202-2219。
Tan，CM，Brady，AE，Nickols，HH，Wang，Q.和Lembird，LE（2004）。G蛋白偶联受体的膜运输。Annu Rev Pharmacol Toxicol 44：559-609。
魏中，张明，李成，黄伟，范Fan，郭健，卡特·明，福田明，董中，胡广和Wu，G.（2019年）。含有特定TBC结构域的蛋白质控制GPCR的ER-高尔基体质膜运输。Cell Rep 28（2）：554-566 e554。
Zin的Weinberg和MA的Puthenveedu（2019）。G蛋白偶联受体信号通过质膜组织和内吞作用的调节。交通20（2）：121-129。
Zhang，M.，Davis，JE，Li，C.，Gao，J.，Huang，W.，Lambert，NA，Terry，AV，Jr. and Wu，G. （2016 a ）。GGA3与G蛋白偶联受体相互作用，并调节其细胞表面输出。分子细胞生物学36（7）：1152-1163。
Zhang，M.，Huang，W.，Gao，J.，Terry，AV and Wu，G.（2016年b ）。GGA1和GGA2调节alpha2B-肾上腺素能受体细胞表面转运。科学代表6：37921。
Zhang M.和Wu G.（2019）。GPCR顺行转运的机制：通过相互作用的蛋白质和基序调节AT1R转运。交通20（2）：110-120。
Zhang，M.，Xu，X.，Li，C.，Huang，W.，Xu，N. and Wu，G.（2019）。GGA1的天然剪接变体抑制α2B 肾上腺素受体的顺行高尔基体运输。科学9（1）：10378。
Zhang，X.，Dong，C.，Wu，QJ，Balch，WE and Wu，G.（2011）。膜远端C末端的双酸性基序可调节血管紧张素II受体从内质网到细胞表面的转运。生物化学杂志286（23）：20525-20535。
Zhu，S.，Zhang，M.，Davis，JE，Wu，WH，Surrao，K.，Wang，H.和Wu，G.（2015）。螺旋8中的单个突变增强了血管紧张素II 1a型受体的转运和信号传导。细胞信号27（12）：2371-2379。