材料和试剂

250 微升尖端EzMate （KLBiotech ，目录号：FX-250-R）
96针微孔板复制器（Violet BioScience ，目录号：VIO-T96）
移液器吸头盒（Labcon ，目录号1055-965-018）
96孔微孔板，平底（Basic Life，目录号：BL6052）
96孔微孔板，U底（基本寿命，目录号：BL6031）
96孔盖（Basic Life，货号：BL6171）
2.2毫升96 深孔微孔板（基本寿命，目录号：BL6038）
试管，16 x 125 mm（派热克斯（Pyrex），目录号：9820）
试管盖（Kimble，目录号：KIM-KAP 73660）
移液器（基本寿命，目录号：BL6233）
根癌农杆菌C58野生型（WT）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S5016）
NZ-案例®另外，酪蛋白酶水解物（Sigma-Aldrich公司，目录号：N4642）
Bacto TM 酵母提取物（BD，目录号：212750）
K 2 HPO 4 （默克密理博（Merck Millipore），目录号：7758-11-4）
MgSO 4 ·7H 2 O（Merck Millipore，目录号：10034-99-8）
LB汤，米勒（BD，目录号：244620）
NaH 2 PO 4 ·2H 2 O （默克密理博，目录号：10028-24-7）
NH 4 Cl（默克密理博，目录号：017-014-00-8）
氯化钾（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
MES（Bio Basic，目录号：145224-94-8）
Bacto TM 琼脂（BD，目录号214010）
95％乙醇（TaiSugar ，目录号：18L乙醇）
6％漂白剂（LCY Chemical，目录号：bleach-4L）
硫酸卡那霉素（BioBasic ，目录号：KB0285-5g）
HCl（Honeywell，目录号：30721-2.5L-GL）
523汤（见食谱）
LB汤（请参阅食谱）
含20μg / ml卡那霉素的LB琼脂（请参见食谱）
AK肉汤（请参阅食谱）
AK琼脂，新鲜准备（请参阅食谱）
70％ë THANOL（见配方）
0.6％漂白剂（请参阅食谱）

设备

自动移液系统（KLBiotech ，型号：EzMate TM 401）
移液器（吉尔森，型号：移液器P2，P20，P200，P1000，8 𝗑 20 ）
-80 °C 冷冻室
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
离心转子（Eppendorf，型号：A-4-62 ）
轨道振动培养箱（TKS，型号：OSI-500R）
高压灭菌器（LUXLEY，型号：HL-326）
微波炉（Panasonic，型号：NN-ST651）
500 ml PYREX锥形瓶（Corning，目录号：4980-500）
酒精燃烧器（DG Life，目录号：D92J-119250）

软件

EzStarter v4.0.0.87（Arise Biotech）

程序

第一天：预培养攻击细胞和受体细胞
预培养攻击细胞。
选择的一个单菌落根癌农杆菌生长在523琼脂C58野生型（WT）和生长它在一个测试在25用5ml 523培养基的管℃下，220rpm下过夜。
预培养对照受体细胞。
选择的单个菌落的大肠杆菌BW25113 WT携带PRL-的nptII 质粒和生长它在一个测试用5ml的LB培养基中20管微克/ ml卡那霉素。在37 °C ，220 rpm下培养细胞过夜。

注意：pRL-nptII 为BW25113 WT提供了卡那霉素抗性，因此在与根癌农杆菌共孵育后可以选择性生长。

消毒的96针米icroplate复制器。
将酒精燃烧器放在左侧。拿一个200μl的烙铁头盒，拆下烙铁头支架内部，压平烙铁头盒，然后将其放在燃烧器的右侧。用0.6％的漂白剂填充扁平盒的左孔，并用无菌水填充右孔（图1）。
用70％的乙醇填充96针微孔板复制器支架，并将其放在无菌含水孔的右侧（图1）。
注意：请勿将70％含乙醇的复制器支架放在乙醇燃烧器旁边。

图1. 用于对微孔板复制器进行灭菌的设置。从左至右：酒精燃烧器，0.6％的漂白剂，无菌水和70％的乙醇。将酒精燃烧器放在70％乙醇的远端，以免发生事故。

将96针mi 作物复制器的针依次浸入0.6％的漂白剂，无菌水和70％的乙醇中。让复制器在每个解决方案中停留10 s。
用酒精燃烧器消毒复制器（图2），并将复制器冷却10 s至室温。灭菌的复制子已准备好传代大肠杆菌突变体。
注意：处理酒精燃烧器时要非常小心。

图2. 用火焰消毒微孔板复制器。将96针微孔板复制器浸入酒精燃烧器顶部的70％乙醇中后进行灭菌，然后将其放置。将复制器绕着火焰移动，以确保每个针脚上的酒精都已耗尽，然后在室温下将复制器冷却10 s。灭菌的复制子已准备好传代大肠杆菌突变体。

从Keio文库中预培养用作受体细胞的大肠杆菌突变体。
成U形底96孔微量培养板和填充每个孔用100 微升含20 LB培养基微克/ ml卡那霉素。
取出的大肠杆菌庆应义塾突变体板，其被存储为甘油贮存在一个2.2毫升的96深孔格式在- 80 ℃的冰箱中。将灭菌的复制子应用于冷冻的大肠杆菌原种。
注意：确保每个复制器销钉都接触甘油原液的表面。

在步骤A4a中准备的96孔微孔板的每个孔中，将含细菌的复制子标记到LB培养基上，并搅动液体，使细菌彻底重悬浮（图3）。
注意：确保每个复制器引脚都与9个6孔板的每个孔中的LB介质接触。

图3. 预培养的大肠杆菌中号从庆应义塾库utants。将含细菌的复制子盖在96孔微孔板的每个孔中的LB培养基上，并搅动液体以彻底重悬细菌。

再密封并返回大肠杆菌庆应义塾突变体板回- 80℃并放置复制在步骤A3A制备的0.6％的漂白剂。
在装有大肠杆菌的U型底96孔微孔板上添加96孔盖，并在37°C，220 rpm下孵育16小时（图4）。
注意：可通过在常规培养箱中添加防滑垫来实现培养。

图4.孵育所E. 大肠杆菌含U型底96孔微量培养板在培养箱中。取下一些烧瓶架，并用防滑垫替换空间。用螺钉固定防滑垫。包含防滑液的区域已准备就绪，可以孵育96孔微孔板。

消毒9 6针微孔板replicato R（步骤小号A3C 到A3D）。

第2天：传代攻击细胞和受体细胞的继代培养
注意：此步骤将BW25113（pRL-nptII ）掺入含Keio突变体的微孔板中，并使它们的生长同步。

传代攻击细胞。
在500 ml烧瓶中将1 ml 来自步骤A1a的根癌农杆菌C58 WT与100 ml 523培养基进行亚培养，准备两次培养（总共200 ml）。使细菌在25 °C ，220 rpm下过夜培养。

传代受体细胞。
成U形底96孔微量培养板和填充每个孔用100 微升含20 LB培养基微克/ ml卡那霉素。使用8通道移液器在含有LB的U底96孔微孔板中传代培养自步骤A4e的2μl 大肠杆菌突变体，但将空白孔留作对照菌株BW25113（pRL-nptII ）（图5）。
注意：在进行亚培养时，请从8道移液器上取下适当的吸头，以使孔留空以用于对照菌株。

子培养2 微升BW25113（PRL-的nptII ）从步骤A2到步骤B2a的空孔中（在图5中WT标签）。
生长的子CU ltured 大肠杆菌菌株在37 ℃下，220rpm下，过夜。

图5.传代大肠杆菌Keio突变体和BW25113（pRL-nptII ）。使用8通道移液器将2μl 从步骤A4e 过夜培养的大肠杆菌突变体传代到装有100μl 含20μg / ml卡那霉素的LB培养基的新板中。不要亚文化的BW25113（预留井PRL-的nptII ）的控制（例如，那么小号3C，D8，D10，而在这种情况下，F12）。子培养2 微升过夜培养BW25113（PRL-的nptII ）插入所述空孔作为对照（例如，孔标记的WT）。

第3天：共同孵育攻击细胞和受体细胞以实现细菌间竞争
准备比赛场地。
将25毫升融化的AK琼脂倒在层流中的96孔盖上，并使其干燥45-60分钟。
注意：固定干燥时间至关重要，因为表面干燥会影响比赛结果。

调整攻击细胞的OD 600 。
将200 ml培养的根癌农杆菌C58 WT以8,000 xg离心10分钟。丢弃上清液，并用20 ml的0.9％NaCl重悬细胞沉淀。
以5,000 xg 离心根癌农杆菌细胞5分钟。丢弃上清液，并用10 ml的0.9％NaCl重悬细胞沉淀。
测量洗涤过的根癌农杆菌细胞的OD 600 ，并用0.9％NaCl 调节至OD 600 = 3.0 。
甲liquot攻击者的细胞到2.2毫升96深孔微孔板使用自动移液系统。
打开自动移液系统和控制EzMate 自动移液系统操作的EzStarter 软件。软件设置为等分试样150 微升的样品中的块R1到A座的每个孔的; 重复该过程一次，因此，每个孔中含有300 微升的液体（图6A）。
分配将50ml的OD 600 -adjusted 根瘤农杆菌到移液贮存器，并放置在块R1中的贮存器，灭菌2.2毫升96深孔微孔板中嵌段A，和一箱EzMate 250 微升在块d尖端（图6B）。
使用自动移液系统，以等分试样150个微升根瘤农杆菌到每个孔中的2.2毫升的96深孔微孔板的。重复循环一次，以便使每孔含有300个微升根瘤农杆菌（图6C）。

图6.将攻击者细胞（根癌农杆菌）分装到2.2 ml 96深孔微孔板中。A. 设置EzStarter 程序用于分配150 微升每孔A座在块R1的液体的两倍。B. 设立的工作站通过将根癌农杆菌在块R1含移液贮存器，一个2.2毫升96深孔微孔板中块A，和一箱EzMate 250 微升尖端块D. C. 该自动移液系统将根癌农杆菌分配给A 区。

混合攻击者细胞和受体细胞，并将混合物置于AK琼脂中，开始细菌间竞争。
设置自动移液系统。
取出根癌农杆菌从块R1含移液贮存器，并让用300个2.2毫升96深孔微孔板微升根瘤农杆菌在每个孔（来自步骤体C3c）留在块A.取出overnight- 传代培养E.大肠杆菌板（来自步骤B2C）在块B.将一箱充满并将其放置在块C.将竞争表面（来自步骤C1）250 微升尖端EzMate （图7A）在块d。
使用自动移液系统将10μl 过夜培养的大肠杆菌（C区）添加到含有2.2 ml 96孔96孔微孔板的A. tumefaciens中。将细菌悬浮液混合10次，然后将10μl 混合物滴到AK板上（B块）（视频1）。

视频1 。混合攻击者细胞和受体细胞，并将混合物置于AK琼脂上。使用自动移液系统将10μl 过夜培养的大肠杆菌（右上块C）添加到含有2.2 ml 96孔96孔微孔板（左上块A）的根癌农杆菌中。将细菌悬浮液混合10次，然后将10μl 混合物滴到AK板上（左下方的方框B）。

重复每一列，直到混合并分配所有96孔（图7B）。

图7.混合攻击细胞和受体细胞，并将混合物置于竞争表面（AK琼脂）上。A. 设置工作站。嵌段A包含用300个2.2毫升96深孔微孔板微升根瘤农杆菌在每个孔（来自步骤体C3c），块C对右上包含overnight- 传代培养的大肠杆菌（来自步骤B2C），B座上左下包含竞争表面（来自步骤C1），和块d包含的完整框250 微升尖端EzMate 。B. 分配10μl 进攻者/接受者混合物后的比赛表面。确保所有液体混合物均已干燥，然后在25 °C下孵育16小时。

以层流干燥含细菌的AK琼脂，直到所有竞争点都干燥（约15 m 英寸）。用另一个96孔盖覆盖干燥的AK琼脂。将板在25°C下放置16 h，以进行竞争（图8）。
注意：所有液体在放入培养箱之前必须先干燥。每个比赛板的干燥时间应相同。

图8.孵育16小时后的竞争面

第四天：恢复比赛点
准备回收板。在层流中将
装有20μg / ml卡那霉素的25 ml熔化的LB琼脂倒入96孔盖中的层流中，使其干燥45-60分钟。
注意：此过程与步骤C1相同，但使用的介质不同。

准备回收液。
用200填充每个孔的U底96孔板的微升0.9％NaCl中的。
与步骤A3一样，对96针微孔板复制器进行灭菌。
从竞争点恢复细菌细胞。
将灭菌的复制器放在比赛表面上（图9A）。
注意：确保每个引脚都接触一个竞争点。

提起复制器（图9B），并将销钉浸入在步骤D2中准备的回收液中。旋转并搅动液体，使细菌细胞完全重悬浮（图9C）。

图9.从AK琼脂中回收细菌竞争的细菌细胞。A. 通过灭菌的酶标仪复制细菌混合物。B.冲压后，含细菌的AK琼脂在每个斑点上应有一个明显的孔。C.将细菌混合物重悬于200μl 的0.9％NaCl中。

小号罐回收的细菌混合物到LB琼脂用20 微克/ ml卡那霉素。
设置自动移液系统，如图10所示。
将包含细菌的U型96孔板（来自步骤D4b）放置在A块中，将回收板（来自D1步骤）放置在B块中，并用250 图D中EzMate的微升针尖（图10）。

图10.设置用于将回收的细菌点到含有20μg / ml卡那霉素的LB琼脂上。放置含细菌马蹄形96孔板（来自步骤D4B）B1中OCK 在块B a，回收板（来自步骤D1），并填充的盒与250 微升尖端EzMate 在块D.

使用自动移液系统将回收的细菌混合物混合10次（方框A），然后将10μl 的回收细菌混合物（方框A）转移到回收板（方框B）中（视频2）。

视频2.将10μl 的回收细菌转移到回收板上。将回收的细菌悬浮液混合10次（方框A），然后将10 µl 的回收细菌混合物（方框A）转移到回收板中（方框B）。重复每列，直到所有96孔混合并分配为止。

重复每一列，直到所有96 孔混合并分配为止。
选择性生长受体细胞。
层流干燥板，直到所有斑点干燥（大约需要15分钟）。用另一个96孔盖覆盖干燥的板。将板置于37 °C 过夜，以使受体细胞生长。
注意：所有液体在放入培养箱之前必须先干燥。每块板的干燥时间应相同。

第5天：计数存活的受体细胞的集落形成单位（CFU）。
拍摄平板以保存数据。以BW25113（pRL-nptII ）作为受体细胞的孔应不产生或仅产生1-2个菌落。因此，具有多个菌落的孔是不易受根癌农杆菌T6SS攻击的大肠杆菌突变体候选物。

数据分析

检查每个孔中大肠杆菌BW25113 （pRL-nptII ）对照菌株的存活率（绿色圆圈，图11 ），并且所有对照孔中的菌落不得超过2个。
通过拍摄回收板的照片来记录数据。
无需任何设备或软件即可直接观察存活的菌落数量。具有多个菌落的孔（橙色圆圈，图11 ）是大肠杆菌Keio突变体，对突变根癌农杆菌的杀菌作用较不敏感。
注意：菌落超过7个的孔被认为是较不敏感的候选物，并被选作抗性候选物以进行进一步验证。

图11 。回收板读数。带有绿色圆圈的孔带有对照受体细胞（带有pRL-nptII的大肠杆菌BW25113 WT ）。带有橙色圆圈的孔是对根癌农杆菌抗菌杀伤较不敏感的候选菌株。

笔记

该协议描述了一种高通量的筛选系统，以鉴定影响T6SS介导的细菌竞争结果的受体细胞的遗传因素。但是，该方法可以适用于任何依赖接触的细菌竞争系统。
该协议中使用的自动移液系统为EzMate401，但可以使用任何自动移液系统，甚至可以通过8通道移液器进行调整。

菜谱

523 汤
溶解10克蔗糖，将8g酪蛋白酶水解物，4克酵母提取物，3gķ 2 HPO 4 和0.3g硫酸镁4 · 6H 2 ö在800毫升蒸馏水水
用HCl将pH调节至7.0，然后用蒸馏水将体积调至1,000 ml
在121°C下高压灭菌溶液20分钟
将灭菌过的523肉汤在室温下保存
LB肉汤
将25克LB粉溶解在1000毫升蒸馏水中
在121°C下高压灭菌溶液20分钟
在室温下保存高压灭菌的LB肉汤
LB琼脂含20μg / ml 纳霉素
将1.5 g琼脂溶解在100 ml LB肉汤中
在121°C下高压灭菌溶液20分钟
冷却高压灭菌的培养基，并添加卡那霉素至终浓度为20μg / ml
需要25毫升培养基的使用25毫升PIP ETTE和倾20毫升成96 - 孔盖
均匀分散琼脂，等待琼脂凝固
将高压灭菌的LB琼脂保存在4°C
AK汤
将3 g K 2 HPO 4，1 g NaH 2 PO 4，1 g NH 4 Cl，0.15 g KCl 和9.76 g MES溶解在900 ml蒸馏水中
用NaOH调节pH值到5.5，然后用蒸馏水调节到1,000 ml
在121°C下高压灭菌溶液20分钟
在室温下保存高压灭菌的AK肉汤
AK琼脂，新鲜准备
将2 g琼脂溶于100 ml AK肉汤中
微波融化琼脂以加热溶液，直到所有琼脂溶解
混合均匀，在室温下冷却2分钟
使用25毫升移液器吸取25毫升热介质，然后将20毫升倒入96孔盖中
均匀地分散琼脂，等待1小时，琼脂凝固并干燥表面
70％Ë THANOL
将737毫升95％的乙醇与263毫升无菌水混合
室温保存
0.6％漂白剂
将10毫升的6％漂白剂与100毫升的无菌水混合
存放于室温下，避免光线接触

致谢

作者感谢Jem al Ali，Hagos Mohammedseid Juhar 和Maria Karmella Apaya认真阅读了此协议。这项工作报告了一个详细的协议，该协议用于识别与增强根癌农杆菌C58 的T6SS活性有关的大肠杆菌受体因子（Lin 等人，2020）。该项目的资金由台湾科学技术部提供的（MOST）（批准号：104-2311-B-001-025-MY3）和中国科学院报研究者奖（批准号：AS-IA-107- L01）到E-ML。该大肠杆菌庆应义塾集合库通过提供国家生物资源：项目（NIG，日本）的大肠杆菌。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Aoki，SK，Pamma ，R.，Hernday ，AD，Bickham，JE，Braaten，BA and Low，DA（2005）。接触依赖性抑制大肠杆菌的生长。科学309（5738）：1245-1248。
Cao，Z.，Casabona ，MG，Kneuper ，H.，Chalmers，JD和Palmer，T.（2016）。金黄色葡萄球菌的VII型分泌系统分泌靶向竞争细菌的核酸酶毒素。Nat Microbiol 2（1）：16183。
加西亚巴约纳，L.，过，MS和劳布，MT（2017）。新月藻通过与细胞表面相关的甘氨酸拉链蛋白的接触依赖性杀伤。eLife 6：24869。
格拉纳托（ET），梅勒- 勒格兰（TA）和福斯特（KR）（2019）。细菌战的演变和生态学。Curr Biol 29（11）：R521-R537。
Hood，RD，Singh，P.，Hsu，F.，Güvener ，T.，Carl，MA，Trinidad，RR，Silverman，JM，Ohlson，BB，Hicks，KG，Plemel ，RL，Li，M.，Schwarz， S.，Wang，WY，Merz，AJ，Goodlett，DR和Mougous ，JD（2010）。铜绿假单胞菌的VI型分泌系统将毒素靶向细菌。细胞宿主和微生物7（1）：25-37。
Lin H.-H.，Yu，M.，Sriramoju ，MK，Hsu，S.-TD，Liu C. 和赖E.-M. （2020）。高通量细菌间竞争筛选可确定ClpAP在增强受体对根癌农杆菌介导的VI型分泌系统介导的攻击的敏感性。前微生物10（3077）。
Souza的，DP，奥卡，GU，Alvarez的-Martinez的，CE，比森-Filho的，AW，Dunger ，G.，胡贝卡，L.，卡瓦尔坎特，NS，阿莱格里亚，MC，巴博萨，LRS，萨利纳斯，RK，古佐，CR和Farah，CS（2015年）。通过IV型分泌系统杀死细菌。Nat Commun 6（1）：6453。