材料和试剂

10毫升玻璃瓶
50毫升玻璃烧杯
500万升玻璃移液器（Corning，目录号：7077-5N）
毛细管微量移液器（Drummond Scientific Company，目录号：5-000-2005）
6厘米长的盘子（Corning，货号：430166）
10 ml和50 ml带过滤器的无菌塑料移液器（Corning，目录号s ：4488、4490）
无菌细胞移位机（Corning，目录号：3008）
1.5 ml微量离心管（Fisherbrand ，目录号05-408-129）
1.5毫升一次性比色皿（品牌，目录号：759076D）
STC-1细胞系（ATCC，目录号：CRL-3254 TM ）
磷酸盐缓冲盐水（Sigma，目录号：D8537）
胰蛋白酶（Corning，目录号：25-053-CI）
DMEM，高葡萄糖（Hyclone ，目录号：SH30022.02）
胎牛血清（Gibco，目录号：35050-061）
恩诺沙星（Sigma，目录号：17849-5G-F）
二十二碳六烯酸DHA（Nu-chek-policy，U-84-A DHA，1GM ），DHA作为解决方案
纯乙醇（Pharmco 产品，目录号：111000200C1GL）
氮气
HEPES（Sigma，目录号：H3375）
NaCl（Fisher Scientific，目录号BP358-10）
氯化钾（Sigma，目录号：P9333）
CaCl 2 （Sigma，目录号：C1016）
MgCl 2 （Sigma，目录号：M8266）
EDTA（OmniPur ，目录号：4050）
海卫一X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
Tris-base（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
PMSF（MP生物医学，目录号：195381）
Halt TM 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（100x ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：78444）
无菌水
蛋白质测定染料试剂浓缩液（Bio-Rad，目录号：5000006）
高灵敏度类胰高血糖素样肽（GLP-1）活性化学发光ELISA试剂盒（Millipore，目录号：EZGLPHS-35K）
10 mg / ml DHA储备溶液（请参阅食谱）
HEPES缓冲区（请参阅食谱）
100 DM DHA刺激缓冲液（请参阅食谱）
细胞裂解缓冲液（请参阅食谱）
100 mM PMSF储备溶液（请参阅配方）

设备

便携式吸取急救® XP移液器控制器（德拉蒙德小号系统求解Ç ompany，目录号：4-000-101）
组织培养培养箱
冷冻微量离心机（Eppendorf ，型号：5424R）
超声波仪（Branson 250 Sonifier ）
ELISA酶标仪（TECAN，日出吸光度酶标仪）

程序

准备10 mg / ml二十二碳六烯酸（DHA）储备溶液（请参阅配方）
用纯乙醇以10 mg / ml 稀释D HA溶液。
注意：DHA会粘在塑料上。处理脂肪酸时，请务必记住使用玻璃移液器。

等分试样DHA储备液分成小玻璃瓶10 米升每。
溶液上方的环境空气应排空，以避免DHA氧化，方法是在关闭容器之前在溶液表面上灌注纯氮气，以注入纯净的氮气。
储存在-20°C。

DHA刺激测定
实验前两天，将2 x 10 6 STC-1细胞接种在6厘米长的培养皿中，一式两份。使用含10％FBS和20 ng / ml恩诺沙星的DMEM 在37°C，5％CO 2的组织培养培养箱中培养细胞。
在实验当天，细胞应达到80％融合。
吸出培养基并用3 ml HEPES缓冲液洗涤细胞两次。
在每个培养皿中加入3 ml HEPES缓冲液。
将细胞放回组织培养箱30分钟。缓冲液中缺乏营养素意味着在营养素刺激之前处于“饥饿”时期。
准备100μMDHA刺激缓冲液。
a。要准备20 ml的100μMDHA刺激缓冲液，请使用玻璃毛细管微量移液器将66μl的10 mg / ml DHA（30.4 mM）储备溶液添加到玻璃烧杯中。然后加入20 ml HEPES缓冲液。

b。在刺激前立即以输出量5和恒定占空比对溶液进行超声处理3分钟，以防止DHA沉淀。如果使用其他超声仪，则将幅度设置为40％。超声处理后，溶液应澄清，且起泡最少。

注意：使用前，请务必重新准备此DHA解决方案。

轻轻抽吸HEPES缓冲液。然后在每个对照皿中添加1ml HEPES缓冲液，在每个刺激皿中添加1ml DHA刺激缓冲液。将所有盘子放回组织培养箱中15分钟。
从每个培养皿中收集600 µl培养基，并放入新的1.5 ml微量离心管中，然后将其置于冰上。
将0.6 ofl的100 mM PMSF（请参阅食谱）以600 µM的终浓度添加到600 Ml的培养基中。
在4°C下以850 x g 旋转微量离心管5分钟。
将500毫升的介质转移到新的试管中。
注意：现在可以将样品用于ELISA测量了。一个人还可以将样品在-80°C下保存最多两周。

根据制造商的说明，通过ELISA试剂盒测量样品中GLP-1的浓度。确保按照制造商的建议设置标准。

裂解培养物中的细胞，并通过Bradford分析法测量所有培养皿中的蛋白质浓度
注意：这是为了说明这些实验中每个培养皿中细胞数量的差异。

小心除去每个培养皿中任何残留的HEPES缓冲液。
在每个培养皿中加入1 ml冷PBS。
使用细胞举升机非常小心地刮下细胞。
将细胞收集到1.5 ml微量离心管中并置于冰上。
在4°C下以850 xg 旋转试管5分钟。
吸出上清液，然后加入50微升细胞裂解缓冲液，轻轻上下吸管匀浆。将试管放在冰上。
裂解细胞20分钟。每5分钟涡旋一次。
在4°C下以21,130 xg f 或15分钟旋转试管。
将上清液转移到新管中。
根据制造商的说明，使用蛋白质测定染料试剂浓缩液测量蛋白质浓度。

数据分析

从三个独立的实验中适当计算出每个样品的GLP-1浓度，每个实验重复两次。然后将该值归一化为通过Brad ford测定法测量的其相应的蛋白质浓度值（表1）。使用任何具有4参数逻辑回归的软件包进行ELISA分析。

表1. 调整后的GLP-1浓度

调整后的GLP-1

实验

无FA（平均GLP-1）

54.63834

没有FA父母

56.75393031

1个

DHA（平均GLP-1）

492.2011

没有FA父母

55.23913626

2

没有FA父母

51.92193876

3

没有FA

DHA

DHA 100家长

439.799523

1个

标清

2.471388

137.8699

DHA 100家长

388.2149664

2

扫描电镜

1.426856

79.5992

DHA 100家长

648.5889426

3

P 值

0.005341

笔记

使用健康的细胞对于进行实验至关重要。应该定期检查细胞生长状况和支原体。始终记得在氮气中填充DHA储备溶液，并在使用前新鲜准备刺激缓冲液。如果将样品在-80°C下冷冻，请勿重复冷冻和融化。

菜谱

10 mg / ml DHA储备溶液
来自制造商的600升DHA液体（1克，总计1.2毫升）
49.4毫升100％纯乙醇
分装到小玻璃瓶中，并充入氮气。储存在-20°C
HEPES缓冲液
20 mM HEPES，pH 7.9

140 毫米氯化钠

4.5 毫米氯化钾

1.2 毫米CaCl 2

1.2 毫米MgCl 2

100μMDHA刺激缓冲液
66 of 10 mg / ml DHA储备液

20 ml HEPES缓冲液

在使用前以5级恒定占空比对溶液进行超声处理3分钟

细胞裂解缓冲液
25 mM HEPES，pH 7.9

100 毫米氯化钠

1 毫米EDTA

10％甘油

1％的Triton X-100

100 mM PMSF储备溶液
174.2毫克PMSF

10 米升100％乙醇

致谢

这项工作是通过以下来源向LS-D资助的：NIH 5 K12 HD-068369-05和儿童健康临床研究咨询委员会：CCRAC 195。

该协议改编自平泽等。（2005）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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