材料和试剂

1尼龙膜注射器过滤器0.21尼龙膜注射器过滤器0.2μm孔径，25 mm直径，无菌（康宁，目录号：CLS431224）

2. HiLoad Superdex 200 16/600列（GE Healthcare，目录号：GE28-9893-35）

3. 无菌移液管头，10-200µl（Greiner Bio，目录号：739290）

4. 无菌吸管头，200-1000µl（Greiner Bio，目录号：740290）

5. 无菌培养管（Sigma-Aldrich，目录号：C1048-72EA）

6. 培养管无菌瓶塞（Sigma-Aldrich，目录号：C1298-100EA）

7. 无菌离心管1.5 ml（Eppendorf，目录号：616201）

8. 无菌猎鹰试管15毫升（Greiner Bio，目录号：188271）

9. 无菌Falcon试管50毫升（Greiner Bio，目录号：227261）

10. 半微量反应杯（Greiner，目录号：613101）

11. 聚丙烯离心瓶，500毫升（Celltreat，目录号：229468）

12. 聚碳酸酯超离心瓶，3毫升（贝克曼，目录号：355618）

13. 聚丙烯色谱柱，5ml（皮尔斯，目录号：29922）

14. Amicon®Ultra-15离心过滤装置（默克公司，产品目录号：UFC901024）

15. 96孔黑色荧光测量板（Greiner，F-bottom，目录号：655076）

16. 聚偏氟乙烯（PVDF）膜（默克公司，产品目录号：IPVH00010）

17. 大肠杆菌SuptoxD细胞

基因型：F-λ-Δ（ara leu）7697[araD139]B/rΔ（codB-lacI）3 galK16 galE15 e14-mcrA0 relA1 rpsL150（StrR）spoT1 mcrB1 hsdR2（r-m+）pSuptoxD

注：大肠杆菌SuptoxD携带pSuptoxD或pSuptoxD[未标记]质粒（见下文）。

18. 大肠杆菌SuptoxR细胞

基因型：F-λ-Δ（ara leu）7697[araD139]B/rΔ（codB-lacI）3 galK16 galE15 e14-mcrA0 relA1 rpsL150（StrR）spoT1 mcrB1 hsdR2（r-m+）pSuptoxR

注：大肠杆菌SuptoxR携带pSuptoxR或pSuptoxR[untagged]质粒（见下文）。

19. 大肠杆菌MC1061细胞（大肠杆菌基因储备中心，目录号：6649）

基因型：F-λ-Δ（ara leu）7697[araD139]B/rΔ（codB-lacI）3 galK16 galE15 e14-mcrA0 relA1 rpsL150（StrR）spoT1 mcrB1 hsdR2（r-m+）

注：我们已将大肠杆菌MC1061作为背景宿主，用于共表达djlA和rraA效应基因，并广泛而成功地评价了SuptoxD和SuptoxR的性能。然而，我们发现，DjlA和RrraA对MP生产力的有益影响独立于MC1061的使用，其他大肠杆菌K-12和B菌株也可作为背景宿主使用（Gialama等人，2017a）。

20. 质粒pASK-MP

笔记：

a。这种质粒可以通过将编码原核或真核MP的基因克隆到pASK75载体主干（Biometra，Göttingen）来生成（Skerra，1994）。我们建议在XbaI和质粒多克隆位点（MCS）的任何一个剩余限制位点之间侧翼MP序列，以去除OmpA信号序列。

b。为了便于通过固定化金属亲和层析（IMAC）纯化MP，我们建议在表达的MP框架中插入一个聚组氨酸标签。然而，其他的标签和MP净化的方法可以根据用户的特殊偏好和需求使用。

c。为了便于监测MP的产生，我们建议融合相关MP下游的GFP报告蛋白（Drew等人，2001年和2008年）。

d。我们已经广泛地使用载体pASK-MP在大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR中生产各种重组MPs。然而，我们发现这些菌株对MP生产力的有益影响与使用pASK75的tet启动子无关（Gialama等人，2017a）。因此，重组多磺酸粘多糖可以在这些菌株中使用其他类型的启动子和质粒过度表达。

21. pSuptoxD[未标记]

注：这个质粒结束了在L（+）-阿拉伯糖诱导下，表达编码大肠杆菌膜结合DnaK辅伴侣djlA的基因djlA。

22. pSuptoxD公司

笔记：

a。这个质粒结束了在L（+）-阿拉伯糖诱导下，表达编码大肠杆菌膜结合DnaK辅伴侣djlA的基因djlA，其C端带有聚组氨酸标签.

b。过度表达根据标准方案，SuptoxD系统可通过免疫印迹法使用抗His抗体进行监测。表达的蛋白质，即DjlA-His6的分子量为~32kda。

c。由于我们发现聚组氨酸标签的存在不会影响DjlA的活性，我们建议使用未标记的pSuptoxD版本，即pSuptoxD[未标记]，用于通过IMAC纯化MP。

23. pSuptoxR[未标记]

注：这个质粒结束了在L（+）-阿拉伯糖诱导下表达rraA，编码大肠杆菌RNase E rraA抑制剂的基因.

24. pSuptoxR公司

笔记：

a。这个质粒结束了在L（+）-阿拉伯糖诱导下，表达编码大肠杆菌核糖核酸酶E rraA抑制剂的基因rraA，其C端带有一个聚组氨酸标签.

b。过度表达根据标准方案，SuptoxR系统可通过免疫印迹法使用抗His抗体进行监测。表达的蛋白质，即RraA-His6的分子量约为20kda。

c。由于我们发现聚组氨酸标签的存在不会影响RraA的活性，我们建议使用未标记的pSuptoxR，即pSuptoxR[未标记]，通过IMAC进行MP纯化。

25. 分析用氯化钠，ACS，ISO（Applichem，目录号：131659）

26胰蛋白胨生化26胰蛋白胨生化BC（Applichem，目录号：A1553）

27酵母抽提物生化27酵母抽提物生化BC（Applichem，目录号：A1552）

28. BC级琼脂细菌学（Applichem，目录号：A0949）

29. 氨苄西林钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）

30. 氯霉素（Sigma-Aldrich，目录号：C0378）

31. L（+）-阿拉伯糖（Applichem，目录号：A9728）

32. 盐酸脱水四环素（Sigma-Aldrich，目录号：37919）

33. 氢氧化钠（NaOH）

34. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）

35. 磷酸二钠（Na2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：S7907）

36. 无水磷酸二氢钠（Chemlab，目录号：CL00.1496）

37. 磷酸二氢钾（KH2PO4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）

38. Tris Base（Fisher，目录号：BP154-1）

39. 吐温20（费希尔，目录号：BP337）

40. Mini-PROTEAN TGX预制4-20%分辨率凝胶（Bio-Rad，目录号：456-1094）

41. 脱脂奶粉（Sigma-Aldrich，目录号：M7409）

42. 小鼠抗多组氨酸过氧化物酶单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A7058）

43. 皮尔斯ECL western-blotting基板试剂盒（赛默飞世尔科技公司，目录号：32106）

44. 正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM）（甘醇生化制品，目录号：D97002）

45. 甘油（Fisher，目录号：G/0650/21）

46. 咪唑（Applichem，目录号：A1073）

47. β-巯基乙醇（Sigma，目录号：M6250）

48. 苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录编号：P7626)

49. Ni-NTA琼脂糖（Qiagen，目录号：30230）

50. 无水乙醇（ACROS Organics，目录号：448450025）

51. 鲁里亚贝塔尼肉汤（LB）（见食谱）

52. 抗生素（见处方）

53. 蛋白质生产诱导剂（见配方）

54. 溶解缓冲液（见配方）

55. 洗涤缓冲液（见配方）

56. 洗脱缓冲液（见配方）

57. 十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（6x）（见配方）

58. Tris缓冲盐水与吐温-20（TBST）（见配方）

59. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）

60. DDM增溶缓冲液（见配方）

61. 大小排除缓冲区（见配方）

设备

1. 微型离心机（Eppendorf，Mini-Spin，目录号：545200018）

2. 高速冷冻离心机（Kubota，目录号：7780）

3. 超离心机（Beckman Coulter，型号：Optima LE-80K）

4. 摇动培养箱（Eppendorf，型号：New BrunswickTM Innova®44，目录号：M1282-0006）

5. 辊式搅拌机（Kisker，目录号：L005-SLN）

6. 微板阅读器（帝肯，型号：Safire II）

7. 电泳电源（Consort，目录号：EV231）

8. DNA和蛋白质分析成像系统（ChemiDoc-It2成像系统（UVP））

9. 配备3 mm直径探头的声波仪（Qsonica，目录号：Q125-110）

10. 紫外可见分光光度计（日立，型号：U2000）

11. 微型蛋白四垂直电泳池（Bio-Rad，目录号：1658005）

12. 70Ti型固定角钛转子（Beckman，目录号：337922）

13. Olr1，均质机型号：

程序

工程大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR用于高水平生产重组多磺酸粘多糖的用途如图1所示。

图1。大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR系统概述。大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR的毒性抑制和促进细胞生产的能力使各种重组多磺酸粘多糖的体积产量显著提高，这分别基于大肠杆菌基因djlA或rraA的过度表达。在araBAD启动子及其诱导物L（+）-阿拉伯糖的控制下，载体pSuptoxD和pSuptoxR的效应基因过度表达。为了在这些菌株中生产重组多磺酸粘多糖，我们通常在tet启动子及其诱导子aTc（pASK-MP载体）的控制下使用基于pASK75的质粒。

重组MP的生产和纯化程序如图2所示。

图2。利用大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR菌株生产和纯化重组MP的方法综述。A、用编码MP的质粒转化SuptoxD或SuptoxR菌株。B、在25°C下，使用适当的诱导剂，将感兴趣的MP与pSuptoxD或pSuptoxR系统一起过度表达16小时。C、用超声波溶解细胞。D、离心总细胞裂解物并将可溶性上清液转移到超速离心管中。E、用超速离心法将可溶性细胞溶解并收集成膜。F、使用均质器在DDM溶解缓冲液中机械地再悬浮膜。G、在4℃下旋转至少1h。超速离心并收集含有溶解膜的上清液。I-J.用IMAC和SEC纯化增溶膜。

A、 MP在摇瓶中的过度表达（无菌条件下）

1. 用pASK-MP载体和平板在含有100μg/ml氨苄西林和40μg/ml氯霉素的LB琼脂上转化（化学或电）有能力的SuptoxD或SuptoxR细胞。

笔记：

a。当第一次进行特定MP的重组生产时，我们建议同时使用SuptoxD和SuptoxR菌株，以确定产生更高水平MP的特定菌株。

b。对于以极低的产量积累的剧毒或其他难以表达的MPs的表达，我们强烈建议以分离形式使用pSuptoxD或pSuptoxR质粒，并使用帕斯克MP质粒在新鲜大肠杆菌MC1061细胞中的表达。其他大肠杆菌也可作为pSuptox载体的宿主。

c。我们广泛使用了pASK75载体主干来表达感兴趣的MP。然而，也可以使用其他表达载体，只要它们与pSuptoxD/R系统兼容（氯霉素抗性，p15A复制起源，araBAD启动子），并且最好包含具有严格调控的n诱导启动子。

2. 选择一个转化菌群，接种液体LB培养液，添加100μg/ml氨苄西林和40μg/ml氯霉素，以维持pASK-MP和SuptoxD/R系统。以220-200转/分恒速振荡培养16小时。摄氏度

笔记：

a。我们强烈建议在所有MP生产实验中使用新转化的大肠杆菌细胞，以获得最大的蛋白质产量。

b。LB培养物的体积应足够第二天接种。

3. 第二天在新鲜LB中准备2%的亚培养基，并添加适当的抗生素，以及0.01%或0.2%（w/v）L（+）-阿拉伯糖，分别用于诱导SuptoxD和SuptoxR系统。在30°C下摇动培养，直到600 nm（OD600）的光密度为0.5。

笔记：

a。已使用以下推荐的Michou/supl模型测定了重组MPs（+）的浓度。然而，其他多磺酸粘多糖可能需要其他浓度才能达到最佳积累。

b。阿拉伯糖（20%）储备液以避免污染。

4. 通过添加0.2μg/ml酸酐四环素（aTc）来启动靶点MP的过度表达，并在25℃下摇床培养过夜。

笔记：

a。我们强烈建议使用新制备的光保护aTc。

b。我们强烈建议在OD600精确到0.5开始MP过度表达，因为我们发现偏差会导致蛋白质产量降低。

c。我们建议尽量减少MP/h基因突变的产生。

d。T他推荐的aTc浓度是在使用某些模型重组MPs在SuptoxD/R中优化表达后确定的（Michou等人，2019年）。然而，其他多磺酸粘多糖可能需要其他浓度才能达到最佳积累。

5. 通过在4000 x g下在4°C下离心10分钟来收获细胞。

6. 根据标准方案，用免疫印迹法或活性分析法检查是否有MP产生。

笔记：

a。由于MP引起的毒性，因此基因组/质粒突变以积累和绕过MP的过量生产。ODMP高产栽培可提高产量。因此，在继续进行MP净化之前，应始终检查MP的生产情况。

b。当MP-GFP融合蛋白过度表达时，细菌荧光可作为蛋白质产生的指标。在这种情况下，对应于OD600=1的单元应在100内重新悬浮微升应测量PBS和荧光：

一。在488激发后，在510 nm处使用96孔板阅读器。

二。使用配备的流式细胞仪具有488nm固体激光器激发，530/30nm带通滤波器检测。在这种情况下，事件应首先在前向散射（FSC）与侧面散射（SSC）图中选通以消除非细胞事件，然后绘制FITC（异硫氰酸荧光素）通道光电倍增管（PMT）检测到的荧光强度与事件数的直方图中，为了估计群体的平均荧光。

B、细菌膜分离与MP提取

1. 将1L培养物中的细胞颗粒重新悬浮在10 ml冰冷裂解缓冲液中。

2. 在冰上用超声波溶解细胞4 x 25 s，每次超声间隔1分钟。

3. 离心总细胞裂解物（10000 x g，15 min，4°C），并小心地将可溶上清液转移到超速离心管中。

4. 使用70 Ti转子在4°C下以130000 x g的速度将可溶部分超速离心1小时，以使细菌膜颗粒化。

5. 使用抹刀收集颗粒膜，并使用均质器机械地将其重新悬浮在5 ml冰镇DDM溶解缓冲液中。匀浆中不应含有可见颗粒。

注意：收集膜时应小心，因为它们会形成一个非常粘且难以处理的颗粒。

6. 在4°C下以180 rpm转速旋转再悬浮至少1小时，以便进行MP提取。

注：为了确定MP提取的最佳条件，应测试一系列不同的DDM浓度和孵育期。当使用某些含荧光素的荧光素或紫红质时s（Michou等人，2019年），这一程序可以很容易地优化通过定期离心和监测荧光水平或脱色，得到的小球。

7. 以130000 x g在4°C下超离心1h，并收集含有提取MP的上清液。

8. 根据标准方案，通过western印迹法或活性分析法检查是否成功提取MP。

注：当过度表达MP-GFP融合时，我们强烈建议使用凝胶内荧光分析作为提取折叠良好且活性MP的质量控制（Geertsma等人，2008年）. 在这种情况下，应遵循以下程序：

a、将100μl含有提取MP的上清液与20μl 6x SDS负载染料混合。

b、在4-20%的预制聚丙烯酰胺凝胶上加载50μl样品，无需事先煮沸样品，并在80 V的恒定电压下运行凝胶。

c、在曝光约3秒后，在成像系统上显示MP-GFP荧光带，例如ChemiDoc-It2成像系统，配备CCD摄像头和GFP过滤器。

d、根据标准方案对分析的蛋白质进行Western blotting分析后，应能观察到MP的双带迁移，较低的带对应于荧光和折叠良好的MP-GFP融合，而上带对应于非荧光和错误折叠的MP-GFP融合（Drew et al.，2008；Geertsma et al。，2008年）。

e、同一样品煮沸10min后用SDS-PAGE和western印迹分析，融合完全变性，单带迁移，缺乏荧光。

9. 将上清液储存在冰上，直到进一步使用或净化。

C、使用固定化金属亲和层析（IMAC）和大小排阻色谱法（SEC）进行初步研究的小规模两步MP纯化（所有步骤均应在4℃下进行）

1. 将1ml Ni-NTA琼脂糖树脂转移至15ml试管中，在低速（1000xg，1min）短暂离心后去除上清液。在2ml溶解缓冲液中再悬浮，轻轻翻转混合。

2. 将含有提取的MP的上清液与上述步骤中的平衡树脂在4°C下在滚筒式混合器上混合1h。

3. 使5ml聚丙烯色谱柱与1柱体积（CV）的裂解缓冲液平衡，并将混合物加载到平衡柱上。

4. 收集流经的液体，并将其重新加载到柱上。重复5-6次。

注：该步骤应重复多次，以确保MP与镍树脂完全结合。当使用MP-GFP熔丝或含有MPs的生色团时，应重复此步骤，直到收集到非荧光或无色的流动。

5. 用40ml洗涤缓冲液洗涤柱结合蛋白。

6. 用6毫升洗脱缓冲液洗脱MP。

7. 使用离心过滤器将洗脱液浓缩至约500μl的最终体积。

8. 以1ml/min的速度使Superdex 200色谱柱与2 CV大小的排阻缓冲液平衡，确保压力不超过0.3MPa的最大限值。

9. 将浓缩样品注入柱上，在收集洗脱部分的同时，将1cv大小的排除缓冲液通过系统。

10. 把对应于议员峰值的分数集中起来。

11. 通过计算积分峰面积280 nm处的吸光度并使用MP的消光系数（ε280）来量化纯化MP的量。

注：通过遵循此方案，并使用SuptoxD菌株，我们获得了每升1毫克的纯化人缓激肽受体2（BR2）的细菌培养物，在正常条件下，当在大肠杆菌中过度表达时，该受体表现出非常高的毒性和较低的产量（Michou等人，2019年）。这一数量是野生型大肠杆菌相应产量的14倍。使用SuptoxR过度表达大细菌机械敏感离子通道（MscL）也获得了类似的结果，在这种情况下，我们分离出0.33 mg/L的细菌摇瓶培养物，产量比野生型大肠杆菌提高了10倍以上（Michou等人，2019年）。然而，根据用户的特殊喜好和需要，也可以使用其他MP净化方法。

12. 通过SDS-PAGE分析和考马斯染色评价MP纯度。

注：对于高浓度MP组分，我们建议在非常低的恒流下运行凝胶，例如12-13 mA。

食谱

1. 鲁里亚贝塔尼肉汤（磅）

10 g/L胰蛋白酶

5g/L酵母抽提物

10 g/L氯化钠

用5 N NaOH将pH调至7.0

高压灭菌器，在15 psi下灭菌20分钟

2. 抗生素

a、 40 mg/ml氯霉素，含99.8%乙醇，-20°C保存

b、 100 mg/ml氨苄西林溶于MilliQ水中，使用0.22μm注射器过滤器对溶液进行消毒，并在-20°C下储存

3. 蛋白质生产诱导因子

a、 20%w/v L（+）-阿拉伯糖溶于MilliQ水中，使用0.22μm注射器过滤器对溶液进行消毒，并在室温下储存

b、 20 mg/L无水四环素（aTc）溶于99.8%的乙醇中，-20°C保存

4. 裂解缓冲液

300毫米氯化钠

50毫米NaH2PO4

15%甘油

5毫米二硫苏糖醇（使用前立即添加）

0.1 mM PMSF（使用前立即添加）

将pH调至7.5

储存于4°C

5. 冲洗缓冲液

20毫米咪唑

300毫米氯化钠

50毫米NaH2PO4

将pH调至8

添加0.1%w/v DDM（使用前立即添加）

储存于4°C

6. 洗脱液

250毫米咪唑

300毫米氯化钠

50毫米NaH2PO4

将pH调至8

添加0.1%w/v DDM（使用前立即添加）

储存于4°C

7. 十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液（6x）

6%w/v十二烷基硫酸钠

300毫米Tris

15%v/v甘油

0.01%w/v溴酚蓝

10%v/vβ-巯基乙醇

将pH调至6.8

8. Tris缓冲盐水与吐温-20（TBST）

20毫米Tris底座

150毫米氯化钠

将pH调至7.5

0.1%v/v吐温-20

9. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）

137毫米氯化钠

2.7毫米氯化钾

10毫米Na2HPO4

1.8毫米KH2PO4

将pH调至7.4

高压灭菌器，在15 psi下灭菌20分钟

10. DDM增溶缓冲液

裂解缓冲液

2.5%w/v DDM（使用前立即添加）

11. 缓冲区大小排除

这个缓冲区应该根据感兴趣的MP的特性来选择。一些例子包括：

0.05%氯化钠或0.0%氯化钠水溶液或0.0%氯化钠水溶液

致谢

这项工作得到了以下方面的资助：（i）希腊国家奖学金基金会（Idrima Kratikon Ypotrofion–IKY）奖学金，由合作协议“开发人类潜力”的“通过博士研究加强人类研究潜力”行动提供资金，“教育和终身学习”，2014-2020年（赠款编号：MIS 5000432），由欧洲结构和投资基金（ESIF）和希腊政府共同出资，（ii）欧洲研究理事会（ERC）根据欧盟地平线2020研究和创新计划（“ProMiDis”项目；赠款协议编号819934）。

相互竞争的利益

GS是大肠杆菌SuptoxD和SuptoxR专利申请的发明人（PCT/EP2017/025168）。作者声明没有其他利益冲突。

工具书类

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