材料和试剂

1.7 ml Popsi-click离心管（Denville，目录号：C2170）
U型底96孔板（Falcon，目录号：353077）
48孔板（Costar，目录号：3548）
24孔板Nunclon三角表面（Thermo Scientific，目录号142475）
6孔板（CytoOne，目录号：CC7682）
P1000移液器吸头（Denville，目录号：1159M42）
P200移液器吸头（Denville，目录号：1159M40）
P20移液器吸头（Denville，目录号：1159M43）
1 ml一次性注射器（BD，货号：309659）
25G x 5/8英寸PrecisionGlide针（BD，目录号305122）
细胞过滤器，40μm尼龙网（Fisherbrand，目录号：22363547）
15 ml锥形管（Falcon，目录号：352096）
无菌500 ml真空过滤系统（0.22μm，PES膜;康宁，目录号：431097）
250 ml无菌无菌过滤系统（0.22μm，PES膜;康宁，目录号：431096）
无菌50 ml真空过滤系统（0.22μm; Millipore，目录号：SCGP00525）
基质胶基质（Corning，目录号：354234）
胎牛血清（FBS; HyClone，目录号：SH30396.03）
LWRN 电池（ATCC，目录号：CRL-3276）
先进的DMEM / F-12（Invitrogen，目录号：12634-028）
N-2介质补充（Invitrogen，目录号：17502-048）
磷酸盐缓冲盐水（PBS -/- ; Gibco，目录号：10010-023）
含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS + / + ; Gibco，目录号：14040-133）
HEPES（1 M ; Invitrogen，货号：15630-080）
5000单位/ ml青霉素/链霉素（Invitrogen，目录号：15070-063）
遗传霉素G418（Gibco，目录号：10131-035）
潮霉素B（Invitrogen，目录号：10687010）
嘌呤霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P8833）
GlutaMax （Invitrogen，目录号：17504-044）
B-27补充剂减去维生素A （Invitrogen，目录号：17504-044）
N-乙酰基-L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9165-5G）
小鼠EGF（Invitrogen，目录号：PMG8043）
SB202190（Sigma-Aldrich，目录号：S7067）
A83-01（Tocris，目录号：2939）
烟酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：N0636）
Leu15-Gastrin I（Sigma-Aldrich，目录号：G9145）
Y-27632（Sigma-Aldrich，目录号：Y0503）
人胶原IV（Sigma，目录号：C5533）
猪胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：T-0303）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Gibco，目录号：25300-054）
回收细胞培养冷冻培养基（Gibco，目录号：12648-010）
冰醋酸（Thermo Scientific，目录号：A38-211）
UltraPure蒸馏水（Invitrogen，目录号：10977-015）
二甲基亚砜（DMSO; Sigma，目录号：D2650）
Accumax（STEMCELL技术，目录号：07921）
LIVE / DEAD固定式水性死细胞染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：L34957）
固定/透化浓缩液（eBioscience，目录号：00-5123-43）
生物素偶联的初级dsRNA（J2; Scicons，目录号：10010200）
兔抗ZO1一抗（Thermo Fisher Scientific，目录号：61-7300）
小鼠抗VA1多克隆血清（一抗；由我们实验室制造）
次要抗兔AlexaFluor 594（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32740）
次级抗小鼠AlexaFluor 647（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32728）
与FITC偶联的欧洲无花果凝集素1（UEA-1）凝集素（Thermo Fisher Scientific，目录号：L32476）
4'，6-Diamidino-2-phenylindole（DAPI; Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
ProLong金抗褪色试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36930）
Transwell渗透性支撑物（Costar，目录号：3413）
储备溶液（请参阅食谱）
500 mM N-乙酰半胱氨酸

50μg/ ml小鼠EGF

500毫米A-83-01

10毫米SB202190

1 M烟酰胺

10μMLeu15-胃泌素

10毫米Y-27632

媒体（请参阅食谱）
先进的DMEM-20

LWRN条件培养基

头蛋白条件培养基

LWRN - 媒体

LWRN + （具有增长因子）

分化培养基

设备

37°C恒温箱（Thermo Scientific Heracell 150i CO 2 恒温箱）
37°C水浴（Thermo Electron Corporation）
-80°C冷冻室
台式离心机（Sorval legend RT）
血细胞计数器是（Reichert）
P1000移液器（Eppendorf Research）
P200移液器（Eppendorf Research）
P20移液器（Eppendorf Research）
真空吸尘器
生物安全罩（SterilGARD ® III超前）
光学显微镜（Fisher Scientific）
细胞计数器

程序

从液氮储存中恢复肠溶
将Matrigel等分试样在4°C过夜解冻。
加入10 mL的LWRN - 入15ml锥形管中，并置于冰上。
转移FROZ 从液氮含有烯小瓶enteroids下在室温下流动的自来水（冷冻瓶通常含有约150 - 200 enteroids）。
传送内容到含有LWRN的15ml锥形管- 。
在4°C下以80 xg 的冷藏离心机离心细胞5分钟。
吸出培养基并在Matrigel中悬浮沉淀（根据将要接种小肠的孔的总数计算所需的Matrigel体积）。
在24孔板中的10滴Matl Matrigel滴液中接种小肠类固醇，每孔滴加4滴（从一个500μl的冷冻管中接种4滴液的3孔）。
使Matrigel在37°C的培养箱中固化10分钟。
向每个含有悬浮在Matrigel中的类肠素的孔中加入1 ml LWRN + 培养基。
在37°C，5％CO 2 下孵育。
每两天更换一次培养基，直到6到7天后可以通过类固醇（图1，左）。

传代和维持小肠类固醇（1至10孔的程序）
准备：开始之前，将移液器吸头在冰箱中放置约30分钟。预热盘子。
小心地从孔中吸出培养基，而不会干扰基质胶。
加入500 OFL冷LWRN的- 每个孔中，机械吹打向上和向下的3-5倍与P1000移液器向上突破基底膜。优化每个肠溶样线的移液水平。
使用带有25G x 5/8 英寸针头的1 ml注射器，每孔将破碎的Matrigel推入和推出3-4次，将孔中的内容物转移到15 ml锥形管中（细胞不会被针头损坏；如果同一肠样线有多个孔，则在同一管中合并多达10个孔）。
添加另一个500 OFL冷LWRN的- 每个孔中，将内容传送到15ml管中与注射器。将至少5 ml总体积添加到15 ml管中。
在4x的80xg 的冷冻离心机中离心细胞5分钟。
小心除去并丢弃上清液，并将肠溶小丸保持在冰上。
在冰上的Matrigel中悬浮肠溶小丸。基质胶必须保持低温以避免固化。
使用冷的P20移液器吸头，在24孔板中以10滴Matl Matrigel滴剂将小肠板滴定，每孔4滴。
将板转移到37°C的培养箱中，让Matrigel放置10分钟。
向每个孔中加入500 升的室温LWRN + ，并在37 °C，5％CO 2的培养箱中培养
每两天更换一次培养基，直到准备好通过类固醇（通常在6或7天后）为止（图1，左）。

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图1. 3D和2D人肠小肠样物。胎儿回肠系在LWRN + 培养基中放置4天（左； 3D）或接种在48孔板中，并在分化培养基中放置6天（右； 2D）

在Transwell和48孔板上制备和维持2D肠溶单层
准备胶原蛋白IV储备溶液（在100 mM冰醋酸中为1 mg / ml）。
通过添加60微升制备的100mM的乙酸的100 ％乙酸至10毫升无菌水中。
将1 mg胶原蛋白IV悬浮在1 ml 100 mM乙酸中，制成胶原蛋白IV储备液并涡旋混合。
分装在500 andl中，并储存在-20°C。
在冷的无菌水中准备胶原蛋白IV储备溶液的1:30稀释液。
向每个Transwell培养基中加入100毫升的冷稀释胶原IV溶液，或向48孔板的每个孔中加入200微升，并在37°C下孵育2小时以使胶原蛋白凝固。
从孔中取出培养基，并通过加入500 / l /孔的冷0.5 mM EDTA洗涤溶液（通过将10 µl 500 mM EDTA稀释至10 ml PBS -/- 制成）并上下吸液5次，将肠溶质分开。。
将肠溶溶液转移到无菌的15 ml管中。
向每个孔中再添加500 / l /孔的0.5 mM EDTA冷冲洗溶液，并转移到15 ml试管中。将至少5 ml总体积添加到15 ml管中。
在4°C下以300 xg 旋转5分钟以沉淀细胞（如果沉淀不是紧密的，则重新旋转）。
用10毫升移液器小心地移出并丢弃上清液。少量残留液体也可以。
在移液器向上并用P1000向下（500μl的胰蛋白酶1 5000升0.05％胰蛋白酶重悬沉淀- 5口井组合或1 ml胰蛋白酶6 - 10个孔enteroids的）。
孵育在37℃下进行4 - 6分钟（优化的温育时间对于每个enteroid线）。
通过加入1ml的LWRN灭活胰蛋白酶- 介质含有10％FBS。
通过使用P1000移液器剧烈上下吸打40 至50次来分离小肠（优化每个小肠管线的特定次数；避免通过吸向管壁形成气泡）。
在40毫升锥形管上放置40毫升细胞过滤器。
通过使1毫升LWRN预润湿过滤器- 介质补充有10％FBS。
将细胞添加到过滤器上，并使细胞在重力作用下流过。
冲洗用额外1毫升LWRN过滤- 。
通过在4°C下以400 xg离心5分钟来沉淀细胞悬液。
用10 ml移液器除去并丢弃上清液，并用P200移液器小心除去残留的液体，而不会干扰沉淀。
暂停在100细胞沉淀- 1000微升LWRN + 含有10μMY-27632平台。取一小份细胞，用血细胞计数器计数。
从Transwell或板上除去胶原蛋白涂层溶液。
将1 x 10 5个细胞逐滴添加到胶原蛋白包被的Transwell或平板中间（每Transwell 100毫升或200（每48孔1升））。细胞会散开并覆盖孔，因此请勿旋转或旋转接种板。
在Transwell的下部隔室中加入600毫升的LWRN + 培养基，其中含有10μMY -27632。
第二天，除去LWRN + 含有10μMY-27632培养基并用LWRN替换+ 只有平台。
更换介质每2天直到enteroids准备感染（通常是当细胞约80 - 90％汇合）。
如果有必要，以感染分化的细胞，分化培养基添加到上部（100微升）和降低（600微升）跨孔的隔室或200μl到48孔板来区分2D enteroids当井80 - 90％汇合。
每两天更换一次分化培养基，直到准备好被感染为止（通常在3 至7天后）（图1，右）。

人类星形病毒感染肠溶二维单层
在室温下解冻HAstV1，MLB1，VA1和模拟细胞裂解物以及HAstV5阳性粪便滤液（在Caco-2细胞中扩增HAstV1和VA1;在Huh7.5细胞中扩增MLB1;冷冻并裂解被感染的细胞以产生病毒原液;过滤HAstV5 -通过AMES缓冲液中0.22 µm收集的大便粪便样品；通过RT-qPCR滴定病毒库以确定基因组拷贝。
稀MLB1和VA1 10 5 每100微升LWRN的基因组拷贝- 仅在HAstV1和HAstV5稀释剂应含有5μg/ ml的猪胰蛋白酶平台。
将上述胰蛋白酶溶液中的HAstV1和HAstV5在37°C，5％CO 2 下孵育1小时。
冲洗enteroid单层一旦与冷LWRN - 媒介。
除去培养基，然后轻轻加入100稀稀释的病毒。
将感染的细胞在37°C，5％CO 2 下孵育1小时。
取出接种，并轻轻地用LWRN洗一次单层- 媒介。
将装有少量感染HIE的孔的平板在0 h - 80°C下保存，以测量初始接种物。
将200 µl（在Transwell插入物中为100 µl）LWRN + 或分化培养基添加到其余的孔中（±2 µg / ml猪胰蛋白酶），并在37°C，5％CO 2 下孵育以收获。
收获期间分别收集上清液和细胞。
收获期间储存在-80°C直至分析。

在Transwells上感染星状病毒的二维肠样单层的免疫荧光染色
从顶部和底部室的孔中取出培养基。
用温热的100 DPl DPBS + / + 清洗一次。
在-20°C的顶部和底部隔室中用100％甲醇固定细胞15分钟。
吸出固定液并用100/500 µl（根尖/基尖）DPBS + / + 清洗两次。
用含有0.1％T riton-X100和3％BSA的DPBS ++ 封闭1小时。
添加100 DPl DPBS + / +于0.1 °C过夜在4°C过夜的0.1％T riton-X100，3％BSA和适当的一抗（一抗体的例子包括病毒的VA1，紧密连接的ZO1，UEA- 1用于多个肠细胞，DAPI用于细胞核）。将阻塞缓冲区保留在基础组件中。
吸抗体和洗涤两次各用100 DPL DPBS + / + 。
在室温和避光下，加入100 DPl DPBS + / +，含0.1％T riton-X100、3％BSA和适当的二抗，持续1 h。
用DPBS + / + 洗涤三次。
在室温下添加100 DPl DPBS + / + 含有适量的DAPI 5分钟。
用DPBS + / + 洗涤三次。
小心地从Transwell上切下膜，并将其顶侧朝上放在显微镜载玻片上。
在膜上滴一滴Prolong金（不含DAPI），并盖上盖玻片以覆盖细胞。
延长多余的时间并用指甲油密封。
用共聚焦显微镜成像之前，让细胞在室温下干燥过夜，并放置在4℃下（图2）。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1903063--1450 Abimbola Kolawole 846760 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2.分化的胚胎回肠2D enteroid 小号被感染HAstV-VA1用于免疫前5天。细胞用FITC偶联的UEA-1（绿色；多个肠细胞），ZO1（红色；紧密连接），DAPI（灰色；细胞核）和VA1（蓝色；病毒）抗体固定。用共聚焦显微镜采集图像。Z堆栈：最大强度投影（左）和正交视图（右）。

星状病毒感染的二维肠样单层细胞的流式细胞仪分析
从井中抽吸培养基。
加入100 Acl Accumax，并在37°C下孵育5分钟。
在冰上的1.7 ml离心管中收集细胞，如果细胞未分离，则重复S tep F 2 。
加入500的L1 LWRN - 辅以EDTA的2 mM和吸管向上和向下突破大细胞聚集。
在4°C下以400 xg 离心细胞5分钟。
将沉淀重悬于100 Ll LWRN -- EDTA中，并转移至圆底96孔板中。通过在4°C下以400 xg离心5分钟来沉淀细胞。
在室温下，添加100份含有活/死固色剂的LWRN -- EDTA，持续15分钟。
在4°C下以400 xg 旋转细胞5分钟，并用LWRN -- EDTA 洗涤两次。
在黑暗中于室温添加100 µl 含0.5％BSA的LWRN -- EDTA和选定的表面标记20分钟（示例； UEA-1用于多种肠细胞类型）。
用100的L1 LWRN洗涤两次- - EDTA 每个。
修复细胞与固定/ permeabiliza 吨离子缓冲液，在室温RT 20分钟。
洗两次各用100μl透化缓冲液并留下至少3小时将细胞在4 ℃下
在室温下添加一抗（通透缓冲液中的抗dsRNA作为病毒标记）20分钟。
洗两次各用100 perl的透化缓冲液。
在室温下，将其重新悬浮在含有适当荧光团标记的二抗的100μl通透缓冲液中20分钟。
洗两次各瓦特第i 100 perl的透化缓冲液。
悬浮在500μl通透缓冲液中。保留在管中进行流式细胞仪分析（图3）。

图3.感染的HIE的流式细胞仪数据。以3 dpi制备感染了HAstV-VA1的胎儿回肠肠质的单细胞悬液。感染的细胞用dsRNA（病毒复制中间体）染色以检测细胞内病毒。存活的总细胞数量的代表性流程图（模拟，黑色； VA1感染，蓝色）。

菜谱

工作环境

所有准备工作和程序必须在生物安全柜的无菌条件下进行。
必须穿戴适当的个人防护设备。
将所有废物转移到生物安全柜中的生物危害袋中。在处理之前，用10 ％的漂白剂喷洒袋子，然后转移到第二个生物危害袋子中。用10 ％的漂白剂喷洒生物安全柜的内部以及实验中使用的所有设备。用纸巾擦拭干净。喷洒无菌水以去除残留的漂白剂并擦去。用90％乙醇喷洒并使其干燥。关闭窗扇，并打开紫外线30分钟，以完全灭活病毒。

储备溶液

试剂溶剂STOC ķ 浓度工作浓度

N-乙酰半胱氨酸ddH 2 O 500 mM 1 mM

小鼠EGF PBS 50μg/ ml 50 ng / ml

A-83-01 DMSO 500毫米500μM

SB202190 DMSO 10毫米10μM

烟酰胺ddH 2 O 1 M 1 mM

Leu15-胃泌素PBS 10μM 10nM的

Y-27632 ddH 2 O 10毫米10μM

媒体

先进的DMEM-20
该介质用于生成条件介质。

将125 ml FBS添加到500 ml Advanced DMEM / F-12中
添加6.25毫升5,000单位/毫升的笔/链球菌（抗生素）
加入6.25毫升GlutaMax
轻轻颠倒三次即可混合
适当贴标签容器并在4°C下存储介质。介质可以在4°C下保持1个月
LWRN条件培养基
LWRN细胞用于产生条件培养基，其中包含L-Wnt3a，R-spondin 1和头蛋白，用于适当地维持人肠小肠（HIE）。这些细胞是Dr. Dr. 杰森·斯彭斯（Jason Spence）（密西根大学，也可从ATCC获得）。LWRN条件培养基也可以直接从美国密歇根州安阿伯市密歇根大学医学院的转化组织建模实验室购买。

准备双重选择培养基（DMEM-20中的G418和潮霉素均为0.5 mg / ml）
在室温下在自来水下在液氮中解冻LWRN细胞
将内容物转移到装有9 ml Advanced DMEM / F12 的15 ml管中，并在4°C下以100 xg离心5分钟以沉淀细胞
将细胞悬浮在1 ml双重选择培养基中，并转移到包含19 ml双重选择培养基的15 cm组织培养处理过的培养皿中
在37°C，5％CO 2 下孵育直到约90％融合（通常〜5 天）
将细胞以1:10的比例分成新的组织培养皿，用20 ml Advanced DMEM-20孵育，然后孵育
在细胞汇合率为80％时，通过倒出细胞培养基收获LWRN上清液，用20 ml新鲜的Advanced DMEM-20代替并孵育。将此收获视为第0天。
用0.22 µm过滤系统对收获的LWRN上清液进行过滤灭菌。在锥形管中制成50毫升等分试样，并储存在-80°C
收获上清液，每2天更换培养基，最多12天（约7次收获）。每次收获后重复步骤h
头蛋白条件培养基
头蛋白是HIE分化所需的分化培养基的重要组成部分。Dr. Dr. Nessen提供了表达Fc标签头蛋白的HEK293细胞。玛丽·埃斯蒂斯（玛丽·埃斯蒂斯）（美国德克萨斯州贝勒学院）。

准备单一选择培养基（Advanced DMEM-20中的10 µg / ml嘌呤霉素）
解冻的HEK293 细胞表达Fc标记的Noggin在室温下在自来水中储存在液氮中
将内容物转移到装有9 ml Advanced DMEM / F12 的15 ml管中，并在4°C下以100 xg离心5分钟以沉淀细胞
将细胞悬浮在1 ml单一选择培养基中，并转移到含有9 ml Advanced DMEM-20 的10 cm组织培养处理过的培养皿中
在37°C，5％CO 2 下孵育直至板融合
以1:10的比例将细胞分成新的，用15 ml Advanced DMEM-20进行10 ml组织培养处理的培养皿并孵育
在细胞汇合率为80％的情况下，去除细胞中的旧培养基并将其丢弃，并用新鲜的Advanced DMEM-20代替。
5天后一次收集上清液，用0.22 µm过滤系统过滤除菌并保存在-80°C
LWRN - 媒体
这是用来洗涤类固醇的基础培养基。

向500 ml Advanced DMEM / F-12中添加以下内容
5毫升GlutaMax

5毫升HEPES

5毫升5000单位/毫升笔/链球菌

轻轻颠倒三次即可混合
适当贴标签容器并在4°C下存储介质。在4°C下储存的培养基最长可保存4周
LWRN + （具有增长因子）
这是具有生长因子的完整培养基，可用于维持类固醇。

要准备100毫升培养基，请从储备溶液中添加以下物质：
50 ml LWRN条件培养基

2毫升B27补品

1毫升N2补充剂

200μlN-乙酰半胱氨酸

100 EGl EGF

100 Lel Leu15-胃泌素

100年7月100日A83-01

100 SBl SB202190

1毫升烟酰胺

45.6毫升LWRN -

轻轻颠倒混合
使用0.22 µm过滤系统进行过滤消毒
适当贴标签容器并在4°C下存储介质。在4°C下储存的培养基最多可保存2周
分化培养基
这用于区分培养中的2D单层肠溶样从隐窝样到绒毛样细胞群。

要准备50毫升培养基，请从储备溶液中添加以下物质：
2.5 ml头蛋白条件培养基

1毫升B27补品

500 Nl N2补充剂

100μlN-乙酰半胱氨酸

50 EGl EGF

50 Lel Leu15-胃泌素

A83-01 7月50日

45.75毫升LWRN -

轻轻颠倒混合
用50 ml 0.22 µm过滤系统进行过滤灭菌
适当贴标签容器并在4°C下存储介质。在4°C下储存的培养基最多可保存2周

已确认发言：

该协议改编自Kolawole 等人的出版物。（2019）。密歇根医学转化组织建模实验室提供了肠道小肠样物质。该研究的资金由NIH R21-AI141835支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考资料

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Janowski，AB，Bauer，IK，Holtz，LR和Wang，D.（2017年）。星状病毒VA1（一种人类嗜神经性星状病毒）在细胞培养中的繁殖。J Virol 91（19）。
Janowski，AB，Klein，RS和Wang，D.（2019）。星状病毒对神经细胞的体外差异感染。mBio 10（4）。
Kolawole，AO，Mirabelli，C.，希尔，DR，Svoboda，SA，Janowski，AB，Passalacqua，KD，Rodriguez，BN，Dame，MK，Freiden，P.，Berger，RP，Vu，DL，Hosmillo，M. ，O’Riordan，MXD，Schultz-Cherry，S.，Guix，S.，Spence，JR，Wang，D。和Wobus，CE（2019年）。星状病毒在人肠小肠中的复制显示多细胞嗜性和复杂的宿主先天免疫状况。PLoS Pathog 15（10）：e1008057。
Kolawole，AO和Wobus，CE（2020年）。胃肠类器官技术促进了肠病毒生物学的研究。PLoS Pathog 16（1）：e1008212。
马德利（Madeley），CR和科斯格罗夫（Cosgrove），BP（1975）。信函：婴儿胃肠炎中的病毒。柳叶刀2（7925）：124。
Vu，DL，Bosch，A.，Pinto，RM，Ribes，E.和Guix，S.（2019）。人类星状病毒MLB 体外复制：在肠外细胞系中持续存在。J病毒93（13）。