材料和试剂

胶带（3M; RS组件，目录号：124-0913）
蝴蝶针（27G；全球医疗用品，目录号：91508T）
异氟烷（VCA ISO 250毫升）
氯胺酮/赛拉嗪（100毫克/千克/ 10 毫克/千克）
强力胶（乐泰，3 克）
碳源（将95％O 2中的5％CO 2 混合；中银澳大利亚）
N-甲基D- 葡糖胺（NMDG; Sigma ，目录号：M2004-500G），在室温下保存
氯化钾（西格玛（Sigma），目录号：P9333-1KG），储存在室温下
NaH 2 PO 4 一元水合物（Sigma ，目录号：S9638-25G），在室温下保存
NaHCO 3 （Sigma ，目录号：S5761-1KG），在室温下保存
D-葡萄糖（Sigma ，目录号：G5767-500G），在室温下保存
MgSO 4 （Sigma ，目录号：M7506-500G），室温保存
CaCl 2 （Sigma ，目录号：223506-500G），在室温下保存
HEPES（Sigma ，目录号：H3375-250G），存储在室温下
硫脲（Sigma ，目录号：T7875-100G），储存在4°C
L-抗坏血酸钠（Sigma ，目录号：4034-100G），储存于4°C
丙酮酸钠（Sigma ，目录号：P2256-25G），储存于4°C
NaCl（Sigma ，目录号：S5886-1KG），储存在室温下
MgCl 2 （Sigma ，目录号：M8266-100G ），在室温下储存
灌注aCSF （请参阅食谱）
孵化aCSF （请参阅食谱）

设备

麻醉剂我nduction室（d arwall ，目录号：1859）
30 x 30厘米的聚苯乙烯块（定制）
大型金属剪刀（精细科学工具，目录号：14001-18）
手术刀（精细科学工具，目录号：10004-13）
手术刀刀片（精细科学工具，目录号：10022-00）
小剪刀（精细科学工具，目录号：14088-10）
镊子（精细科学工具，目录号：11271-30）
铲（精细科学工具，目录号：10090-13）
Hemostat（精细科学工具，目录号：13007-12）
烧杯（250 ml; Labdirect ，目录号：355.018.250）
弧菌（Leica Biosystems ，型号：VT1200S）
软性艺术家画笔（大小2； Bunnings ，目录号：1660207）
巴斯德移液器（Labdirect ，目录号：88336）
Braincubator TM （Paya Scientific Pty Ltd; http://braincubator.com.au）
蠕动泵（Masterflex ，目录号：EW-77122-20）
Masterflex 泵管（Coleparmer ，目录号：EW-06508-15）
小啮齿动物断头台（WPI）

程序

切片前心脏灌注
该穿心灌注诱导快速低温，从而减少片恶化。此步骤在成年动物（> 3个月）中特别重要，但是适用于1个月以上的啮齿动物。

对于300毫升冰镇（4 ℃下）灌注溶液（见ř ecipe 1）放入烧杯中，并应用Ç arbogen流动。碳素是95％O 2 和5％CO 2 的气体混合物。它提供了足够水平的神经元消耗的氧气，并需要维持7.4的稳定pH值。设置蠕动泵（流速为20 ml / min）以使溶液在烧杯和心脏之间循环（步骤A5）。
使用29G注射器腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（100 mg / kg / 10 mg / kg ）的混合物麻醉动物。一旦对动物进行了深度麻醉（没有用镊子捏住爪子或尾巴的反应），将动物仰卧，并用美纹纸胶带将四肢固定在聚苯乙烯块上。
使用镊子，从剑突中提起皮肤，并用钝剪刀将皮肤切开至体腔，露出胸骨（图1A 和1B）。
取下肋骨并露出心脏（图1C）。在此步骤中，握住胸骨并在侧面切开以切穿隔膜。然后，您可以用剪刀剪下并取下肋骨笼，以清楚地看到心脏。注意不要损坏内部器官或主要血管。
停止carbogenation 冰冷灌注的aCSF中溶液，以避免在管道的气泡。这一步是必要的，因为Ç arbogen在管道系统气泡可以到达所有血管流入的血液循环并阻断灌注溶液。如果发现管路系统中有气泡，请在继续操作之前尝试将其从管路中冲洗掉。启动灌注泵（流速为20 ml / min），以溶液充满管道，直到几滴液滴不断流过与管道相连的蝶形针，并停止灌注。用钝镊子握住心脏，然后将针头轻轻放入左心室，注意不要将针头穿过心脏（图1C）。用止血剂将针固定到位，避免溢出，并以20 ml / min的流速启动灌注泵。
在操作泵之后，立即用细剪刀剪掉右心房，使溶液流过并排出循环系统（图1D）。保持灌注2-3分钟，直到您注意到鼻子，肝脏和尾巴变色。从心房流出的清澈溶液将表明大多数血液已被灌注溶液替代，因此灌注成功。
经心脏灌注后，用啮齿动物断头台或大剪刀将动物断头。

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图1. 经心灌注的主要阶段。A 和B。去除皮肤以暴露体腔。C.取下肋骨使心脏暴露，并向左心室插入蝴蝶针（绿色）。蝶形针连接到由蠕动泵驱动的灌注系统。D.在右心房做一个小切口，以降低血压并使灌注溶液从体内冲洗掉。

使用手术刀，通过从鼻骨到枕骨表面进行正中切口来暴露骨骼（图2A）。然后清洁剩余肌肉的宫颈部分（图2B）。
骨骼暴露后，使用剪刀轻轻地将其从枕骨中部沿矢状缝合线抬起并切至鼻骨。对于骨骼较粗的老动物，在颅骨的侧面再做一些切口，以帮助去除骨骼（图2C）。
用镊子从两侧轻轻取出顶骨和顶骨；因此，大脑背表面变得可见（图2D）。取出骨头时要格外小心，不要用镊子损坏组织。
轻轻地将硬脑膜从大脑中分离出来，以免将来对组织造成损害。
使用弯曲的刮铲sc起大脑，然后将其移至冰冷的碳饱和灌注aCSF中。大脑必须小心除去，以避免到组织机械损伤，并迅速向米尼米Ž È缺氧。

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图2.去除大脑的主要步骤。A.用手术刀做内侧切口以暴露骨骼。B.从表面清洁宫颈肌肉。C.沿矢状缝合线切下顶骨，并用镊子轻轻将其去除。D.暴露大脑并用弯曲的刮铲将其sc出。

切片
在冷灌注aCSF 中将整个大脑孵育30-60 s，以进行深低温治疗。然后，用刮铲取出大脑，并通过切开正中线（分开半球）或去除大脑的背侧部分（取决于所需的切片）来准备平坦的表面（图3A）。平坦的表面对于增加粘合组织的表面积并因此在切片过程中增强结构稳定性至关重要。
使用强力胶将大脑的平坦侧放在切割台上（图3B）。注重大脑和引用振动刀的方向，因为这将决定切片和结构将保持不变的方向（冠状VS 。矢状切面）。
放置在切割阶段到振动切片机的冷冻室（预填充用冰冷的灌注aCSF中的溶液）并切成300 微米在包括感兴趣的区域的优选取向厚的脑切片。在切片之前，请调整刀片的振动幅度（0.85至1 mm）和速度（0.15至0.23 mm / s），以确保切割整洁（图3C）。整个切片过程应在10-15分钟内完成（图3D）。

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图3.切片过程。A.用手术刀切开大脑的尾部，准备平坦的表面。B.在切片阶段涂上强力胶，然后将大脑放在适当位置的平坦表面上。C.将载物台放入切片机冷却室中。D.用震动刀切成300 µm的切片。

切片后
将切片转移到定制的培养系统（Braincubator TM ）中，该系统包含用于测量pH值（7.2-7.4），碳源流量和温度的探针，如先前所述（Breen and Buskila ，2014; Buskila et al。，2014; Cameron et al。等人，2017）。在将切片放入Braincubator TM 的主腔室之前，您应准备在主腔室中培养ACS F 的预设条件（所需温度，碳源流量，pH）。

倾200毫升温育后切片aCSF中进入的主室Braincubator TM 和激活它们。将温度设置为32 ° C，并将碳原流向慢中值范围，以允许适当的碳共生（pH应为7.2-7.4）。打开蠕动泵，使aCSF （通过12 UV / min的流速）通过定期暴露于1.1W UVC光的二级UVC腔室（图4A）。此步骤将根除漂浮在aCSF中的细菌。
使用截止的塑料巴斯德移液器（内径1厘米）将切片转移到Braincubator TM 主腔室中的适当切片架中（图4B）。
在最初的孵育期间，也可以将切片转移到装有灌注aCSF 的小室中，在32-34 ° C下放置12分钟，如之前（Ting 等，2014）所述，然后放入Braincubator TM中，孵育aCSF （图4C）。
在32 ° C 的温度下10分钟后，将温度降低至15 ° C，让切片在使用前再静置45分钟（图4C）。

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图4。切片后的孵育。答：准备好大脑培养箱。将200 ml培养液aCSF 倒入主腔室，并开始在主腔室和次要腔室之间循环。将温度设置为32 ° C 。B.将切片放在主室的网格上，孵育12分钟。C.将温度降低到15 ° C，并在使用前孵育至少45分钟。

记事簿

必须确保UVC腔室是“不透光的” ，因为紫外线可能会对人体组织造成危害，并可能损坏切片。
通过使用随机功能的可编程计时器控制UVC照明时间，该功能每15-30分钟在15到26分钟之间变化一次，以免aCSF 过热。
从主腔室的网状切片固定器中去除碳素泡沫，因为它们会导致脂质过氧化和切片变质。

菜谱

P erfusion 学联
NMDG 92 毫米

盐酸20毫升

氯化钾2.5 mM

NaH 2 PO 4 （一水合物）1.2 mM

NaHCO 3 25 毫米

氯化钙2 0.5 mM

D-葡萄糖25 mM

HEPES 20 毫米

硫脲2 mM

抗坏血酸钠5 mM

丙酮酸钠3 mM

硫酸镁4 10 mM

pH值7.2

储存温度（4℃）

渗透压300-310 mOsm

孵化学联
氯化钾2.5 mM

NaH 2 PO 4 （一水合物）1.25 mM

NaHCO 3 25 毫米

氯化钙2 2 mM

氯化钠125 mM

氯化镁2 1 mM

D-葡萄糖15 mM

硫脲2 mM

抗坏血酸钠5 mM

丙酮酸钠3 mM

pH值7.4

储存温度（4℃）

渗透压300-310 mOsm

致谢

这项工作得到了种子基金（WSU）的资助，YBOK和Ainsworth医学研究创新基金得到了WSU 研究生奖学金（UWSPRA）的支持。

该协议源自先前的出版物（Cameron 等，2017; Buskila 等，2020）。

利益争夺

博士Buskila 宣称他是PAYO科技私人有限公司，公司SPECIALI董事ž 建设孵化系统急性神经组织编辑。Kekesi 博士声明不存在利益冲突。

伦理

本研究中涉及动物的所有程序均符合进行该研究的西悉尼大学的伦理标准（动物研究局，目录号：A11199）。本文不包含任何作者对人类参与者进行的任何研究。

参考小号

Breen，PP和Buskila ，Y.（2014年）。Braincubator：用于延长脑片寿命的孵化系统，用于神经生理学。在：IEEE医学与生物学工程学会第36 届年度国际会议上。EMBC，2014年，第2页。4864-4867。
Y. Buskila ，Y.，Bellot-Saez ，A.，Kékesi ，O.，Cameron ，M.和Morley ，J.（2020）延长急性神经元组织的寿命，用于成像和电生理研究。于：N. Wright （Ed。）。基本神经生物学技术。Neuromethods ，第152 卷。Humana，纽约，纽约。
Buskila ，Y.，Breen，PP，Tapson ，J.，van Schaik，A.，Barton，M.和Morley，JW（2014）。扩展急性脑切片的生存能力。科学代表4：5309。
卡梅伦，M.，Kekesi ，O.，莫利，JW，Tapson ，J.，布林，PP，面包车范斯海克，A。和Buskila ，Y。（2016）。在急性神经元组织中长期孵育后，AM染料的钙成像。PLoS One 11（5）：e0155468。
Cameron，MA，Kekesi ，O.，Morley，JW，Bellot-Saez ，A.，Kueh，S.，Breen，P.，van Schaik，A.，Tapson ，J.和Buskila ，Y.（2017）。急性神经元组织的长时间孵育可用于电生理学和钙成像。J Vis Exp 15 （120）。
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Reid，KH，Edmonds，HL，Jr.，Schurr ，A.，Tseng，MT和West，CA（1988）。使用脑片的陷阱。Prog Neurobiol 31（1）：1-18。
Ting，JT，Daigle，TL，Chen Q.和Feng G.（2014）。成年和衰老动物的急性脑切片方法：靶向膜片钳分析和光遗传学的应用。方法分子生物学1183：221-242。