材料和试剂

5 ml聚苯乙烯圆底管（Falcon，目录号：352054）
5 ml聚苯乙烯圆底管，带有细胞过滤器卡扣盖（猎鹰，目录号：352235）
BD 10毫升注射器鲁尔笔尖（BD，目录号：309604）
Millex -HV针筒过滤器单元，0.45 -µ m （Millipore，目录号：SLHVM33RS）
100 x 15毫米磅LB + 100微克/毫升氨苄青霉素培养板（VWR，目录号25384-342）
标准组织培养板（建议使用6和12孔板）
的One Shot Stbl3化学感受E. Ç OLI （Invitrogen公司，目录号：C737303）
HEK293T细胞（ATCC ，目录号：CRL-3216）
收件人癌细胞系（来自ATCC或其他来源）
LentiV-Cas9-Puro质粒（Addgene ，目录号：108100）
psPAX2.0质粒（Addgene ，目录号：12260）
VSVG质粒（Addgene ，目录号：98286）
Lenti -X TM qRT -PCR滴定试剂盒（Takara，目录号：631235）
gRNA质粒骨架（小号EE表1 中建议的质粒和它们各自的Addgene公司号码）

表1. 建议的CRISPR质粒

名称

描述

Addgene 目录号

LRG2.1

编码sgRNA和GFP

108098

LentiV_Cas9_puro

编码Cas9和Puro

108100

LRG2.1-m樱桃

编码sgRNA 和mCherry

108099

LRG2.1-BFP

编码sgRNA 和eBFP

120577

LRG2.1-标签BFP2

编码sgRNA和TagBFP2

124773

LRG2.1-莫兰

编码sgRNA 和mOrange

124772

LRG2.1-CyOFP1

编码sgRNA和CyOFP1

124771

LB + 100 µg / ml氨苄青霉素培养基（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
DMEM培养基中添加了10％FBS，1％Pen / Strep和谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：11995-073）
适用于目标癌细胞系的合适细胞培养基
50％（v / v）甘油
抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich，目录号：F1804）
2 M氯化钙2
2 x HEPES缓冲盐水
100 mM氯喹（Cayman Chemical，目录号：14194）
聚烯烃（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-134220）
嘌呤霉素（Gibco，目录号：A11138-03）
带NEB缓冲液3.1的BsmBI 限制性核酸内切酶（NEB，目录号：R0580）
碱性磷酸酶，小腿肠（CIP）储备液（10,000 U / ml; NEB，目录号：M0290）
100 µM gRNA寡核苷酸（IDT或首选的寡核苷酸合成供应商）
T4多核苷酸激酶（NEB，目录号：M0201）
带T4 DNA连接酶缓冲液的T4 DNA连接酶（NEB，目录号：M0202）

设备

移液器
Pipetman P10（Gilson，目录号：F144802）
Pipetman P20（Gilson，目录号：F123600）
Pipetman P200（Gilson，目录号：F123601）
Pipetman P1000（Gilson，目录号：F123602）
哺乳动物细胞培养设备
CO 2 培养箱
层流柜
荧光显微镜
热循环仪
-20 °C冰柜
-80 °C冷冻室
Miltenyi Biotec MACSquant VYB流式细胞仪（Miltenyi Biotech，目录号：130-096-116）
替代品：Luminex Guava easyCyte 或同类流式细胞仪，能够测量GFP荧光

软件

基准测试（https://www.benchling.com/）
Microsoft Excel
棱镜8

程序

注意：在本节中，我们将Cas9转基因引入目标细胞系。如果研究人员已经有稳定的Cas9表达细胞系，则可以直接进行步骤B。

表达Cas9的细胞系的产生
选择一个Cas9表达载体
我们建议使用LentiV-Cas9-Puro（Addgene ）将Cas9引入目标细胞系，尽管任何具有哺乳动物选择标记的组成型SpCas9表达载体都足够。

产生Cas9病毒
我们建议使用慢病毒包装质粒psPAX2和VSVG（Addgene ）。
我们在下面提供了慢病毒生产的简要概述。我们的实验室为此过程提供了更详细的协议，可以在Giuliano 等人的文章中找到。（2019）。
磷酸钙用LentiV-Cas9-Puro，psPAX2和VSVG转染HEK293T包装细胞。
转染后约8-14小时，用新鲜培养基替换包装细胞上的培养基。
转染后24小时收获病毒。我们建议使用0.45 µM过滤器过滤上清液以分离细胞碎片。在转染后72小时内，该病毒最多可收集3次。
该病毒可立即使用或在-80 °C下保存。
转导感兴趣的细胞系
平板细胞在约50％汇合处。
将病毒上清液与新鲜培养基以1：1的比例混合。
将聚乙烯加入稀释的病毒上清液中至终浓度为8 µg / ml。我们发现该浓度提高了我们实验室常用的几乎所有细胞系的转导效率。但是，可以根据需要调整该浓度。
用含聚乙烯的病毒上清液替换要转导的细胞上的培养基。
转导后24小时，用新鲜培养基更换转导细胞上的培养基。
选择表达Cas9的细胞
我们实验室中使用的Cas9表达载体（LentiV-Cas9-Puro）含有抗嘌呤霉素标记。嘌呤霉素的理想选择浓度取决于细胞系，应在实验开始前对其进行优化。
为了优化嘌呤霉素的选择浓度，我们建议在6或12孔板上以约50％汇合度铺板野生型细胞。
在细胞与含有嘌呤霉素以一定范围的媒体24个小时后更换介质的1 -4微克/毫升。我们通常以0.5的增量进行测试 μ克/米升，每孔含有嘌呤霉素的浓度不同。
选择药物后3-5天评估细胞存活率。嘌呤霉素的最佳浓度是没有存活细胞的最低浓度。对于贴壁细胞系，死亡/垂死的细胞通常会从板上脱落，这有助于鉴定存活的细胞。为此，悬浮细胞系可能需要活性染料。
虽然嘌呤霉素的浓度范围对于大多数细胞系已经足够，但有些细胞可能需要更高的工作浓度。在这种情况下，请测试最高10 µg / ml的其他浓度。
转导后48 h，用含嘌呤霉素的浓度为1-4 µg / ml或确定为对目标细胞系最佳的培养基替换转导细胞上的培养基。
保持选择，直到稳定表达Cas9。我们发现，对于大多数细胞系而言，只有一轮转导，然后进行3至5天的嘌呤霉素选择，足以产生稳定的Cas9表达。但是，某些细胞系可能需要一轮以上的转导和/或更长的选择时间。
验证Cas9表达
研究人员可以利用多种方法来验证Cas9的表达，包括：
定量PCR（qPCR）。通过使用靶向Cas9 mRNA转录物的PCR引物，可以确认Cas9核酸酶的表达。所述的qPCR引物我们实验室利用用于检测Cas9表达是正向：5 ' GGCCTACCACGAGAAGTACC 3 ' 和反向：5 ' CTGGCGTTGATGGGGTTTTC 3 ' 。
西方印迹。我们实验室中使用的Cas9表达载体（LentiV-Cas9-Puro）包含一个FLAG表位标签，该标签与Cas9的N端融合。这样，研究人员可以根据需要使用抗FLAG抗体代替Cas9特异性抗体。我们实验室使用的抗FLAG抗体可在“材料和试剂”部分（Sigma-Aldrich）中找到。
使用针对必需基因的指南进行转导。虽然这可能不适合您进行的第一次GFP竞争测定，但我们的实验室会常规执行带有几个阳性和阴性对照指南的对照竞争测定（如本协议后面所述），以验证目标细胞系中的Cas9功能。
值得注意的是，针对Cas9的qPCR和Western blotting可以确认Cas9的表达，但不能确认其功能。用具有已知生物活性的向导进行的转导可以用来确认Cas9的功能。由于这些原因，我们建议使用这些方法的组合来验证您生成的任何表达Cas9的细胞系中的Cas9表达和功能。

注意：在本节中，我们将设计针对目标基因的指南，并将这些指南以及适当的阳性和阴性对照指南克隆到用于sgRNA和荧光蛋白表达的指南质粒中。我们讨论了理想指导设计的注意事项，并提供了由我们的实验室和质粒克隆方法广泛验证的控制指南。

sgRNA和指导质粒的设计
确定目标基因内的靶位点
使用在线工具（例如“ 基准测试” （https://www.benchling.com/））设计针对目标基因的合适指南。
对于此协议，我们使用与目标序列具有20个碱基对同源性的单向导，因为这最适合CRISPR敲除。
PAM序列应在指导序列的3 '侧为NGG ，因为我们使用的Cas9菌株是SpCas9。PAM序列是Cas9介导的DNA切割所必需的，并且在切割位点下游有3-4个碱基对。
靶向功能蛋白结构域的指南可产生最有效的靶基因敲除作用。因此，我们强烈建议交叉引用带有蛋白质结构域的外显子，以确定哪些指南最适合破坏蛋白质功能，因为仅针对第一个外显子的指南会导致假阴性（图2A）（Shi 等人，2015））。
此外，我们建议为每个基因设计3个或更多的指导，理想地针对不同的外显子。
通过IDT或您首选的DNA合成商业来源订购寡核苷酸。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902956--1438 JasonSheltzer 492105 \图jpg \图2.jpg

图2.竞争测定的示例实验设计和数据分析。A.示例指南RNA设计。AURKB（Aurora B）编码一种在有丝分裂中起关键作用的激酶。显示了针对Aurora B激酶域内多个外显子的指南。B.示例辍学数据。被转导的群体的相对丰度由％GFP表示，并且在五次传代的过程中显示了计算的倍数缺失。C.示例辍学图。每个指南显示了五个通道的折痕。可以看出，针对Rosa26的阴性对照指南显示出最小的消耗，而针对RPA3的阳性对照指南在最终时间点显示出超过十倍的缺失。与现有知识一致，这些结果证实了AURKB是癌细胞依赖性的。

确定合适的正面和负面对照指南
阴性对照指南应针对非编码基因座或可用于细胞适应性的基因，例如Rosa26或AAVS1。这些基因座被认为是规范的安全港位点，因此在这些基因座上引入插入缺失将对癌细胞的适应性影响最小。
阳性对照指南应靶向必需基因，例如PCNA或RPA3。这些基因对于DNA复制至关重要，因此在这些基因座处引入插入缺失将对癌细胞的健康有害。
我们在表2中提供了我们的控制指南。
注意：提供的序列是20 bp的间隔子序列，不包括用于克隆到指导载体中的4-5 bp的衔接子序列。我们的指导载体的衔接子是CACC，如果间隔序列的第一个核苷酸不是鸟嘌呤，则必须添加G。例如，下面列出的带有添加的适配器的Rosa26 g1的完整指导序列是：5'- CACCG ACAGCAAGTTGTCTAACCCG （粗体适配器）。

表2.建议的控制指南

指南

序列

罗莎26 g1

ACAGCAAGTTGTCTAACCCG

罗莎26 g2

CCGAAAGATTGGACACCCC

AAVS g1

ACTGTTGACGGCGGCGATGT

AAVS g2

GCTGATACCGTCGGCGTTGG

PCNA g1

CTACCGCTGCGACCGCAACC

PCNA g2

加加特AAAATTGCGGATAT

RPA3 g1

CCCAGGTCGCGCATCAACGC

RPA3 g2

GGTTGGAAGAGTATACGCGCCA

将sgRNA克隆到指导载体中
我们建议使用慢病毒GFP sgRNA表达载体（Addgene ），尽管任何具有荧光标记的可比性sgRNA表达载体均适用于该测定。此外，我们的实验室已经开发并验证了具有不同荧光蛋白标记的sgRNA表达载体的几种衍生物，可以在需要时使用。
我们在下面提供了指南克隆过程的简要概述。我们的实验室为此过程提供了更详细的协议，可以在Giuliano 等人的文章中找到。（2019）。
用BsmBI 摘要线性化引导载体主链。
用T4 PNK退火和磷酸化引导寡核苷酸。
将经过退火和磷酸化的向导连接到向导载体主链中。
将连接产物转化为感受态细胞。
使用U6引物（5序列-验证所述引导质粒' - GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC）。

注意：在本节中，我们将把编码sgRNA和荧光蛋白的指导质粒引入表达Cas9的细胞系。我们讨论了慢病毒生产，病毒滴定的方法，以及竞争分析设置的一些注意事项。

用指导质粒转导表达Cas9的细胞系
用指导质粒生产慢病毒
有关病毒产生过程的简要概述，请参阅步骤A2，或者请参阅Giuliano 等人的更全面的病毒产生方案。（2019）。

确定病毒滴度
由于此测定法中使用的指导质粒编码荧光蛋白，因此可以通过转导不同病毒量的细胞并在转导后三天测量显示荧光的细胞百分比来估算病毒滴度。
研究人员还可以利用基于定量PCR的方法来确定病毒滴度，如果他们愿意（例如，伦蒂-X TM 的qRT -PCR滴定套件[宝] ，小号EE制造商的详细信息协议）。虽然这种方法可以提供关于每微升上清液中病毒颗粒数量的更明确的答案，但我们发现通过测量显示荧光的细胞百分比提供的近似值足以进行此分析。
用滴定的病毒上清液转导表达Cas9的细胞系。
理想的转换效率为50％。然而，该测定法在其要求上是灵活的，使得10-80％范围内的转导效率适用于该测定法。
有关病毒转导过程的简要概述，请参见步骤A3。
我们建议在12或24孔板上进行此测定。如果需要，可以放大或缩小此测定。通常，在较大的平板上进行此测定可减少背景变化，但是如果有限制因素起作用（即病毒不足），则也可以在48孔或96孔板上进行该测定。

注意：在本节中，我们将采用竞争分析的第一个时间点。我们讨论了通过流式细胞仪测量表达GFP标记的细胞百分比的方法，以及进行竞争分析的注意事项。

开始竞争分析
收获细胞
通常，我们将第一个时间点设置为转导后三天，以便为转基因表达提供充足的时间。

种子细胞在适当的汇合度下一次传代
根据细胞系的增殖能力，进行适当的细胞分裂（即1：2至1：10）。
根据细胞系的选择及其倍增时间，研究人员可能选择每三或四天通过一次细胞。
例如，我们通常每三天分裂一次乳腺癌细胞系MDA-MB-231 1：4。
通过流式细胞仪测量GFP表达
铺板细胞用于下一次传代后，准备剩下的样品用于流式细胞仪。我们建议在进行流量分析之前，先将细胞通过单个细胞过滤器（Falcon）。不必使用任何流式细胞仪特异的重悬缓冲液，因为细胞培养基应足以进行该实验。
运行控制GFP细胞，为前向散射和侧向散射激光设置适当的电压。
运行对照GFP细胞和GFP +细胞，以调节流量参数并确定表达GFP的细胞的门。
运行实验样品。研究人员的目标应该是运行样本体积的至少10％（即，如果收获1毫升细胞从一个12 - 孔平板中，运行至少100微升）。如果可能，我们建议运行约25％的样品，因为较大的样品将产生更准确的GFP表达测量值。
记录所有样品的GFP％。
为了确保实验的一致性，我们建议使用您的激光电压和分析模板保存一个程序，以用于成功的时间点。

注意：在本节中，我们将继续完成竞争分析。

竞争分析的连续时间点
收获细胞
种子细胞在适当的汇合下进行下传代。
在第五个时间点，测定已完成，无需重新铺板细胞用于下一次传代。

通过流式细胞仪测量GFP表达。

数据分析

注意：在本节中，我们将从每个时间点将表达GFP的百分比细胞的测量值转换为倍数变化值。然后可以将来自各个指南的这些倍数变化值相互比较，并与阳性和阴性对照进行比较，以得出有关所测试细胞系中目标基因的必要性的结论。

确定倍数变化
在该测定中，倍数变化定义为（第1代GFP％）/（第X代GFP％）。
因此，通道1的倍数变化应为1。这些计算的示例可以在图2B中看到。

准备分组图
我们建议使用Prism，但是任何可以绘制数值数据图表的软件（即Excel）都足够（图2C）。

设置辍学阈值
该阈值应大于阴性对照的倍数变化，因为这些指南的目标是可用于癌细胞适应性的基因座。
我们的实验室使用2.5倍变化阈值来确定依赖性，因为我们发现该阈值始终高于用阴性对照指南观察到的耗竭水平。
可以根据需要根据细胞系进行调整，因为倍数变化的动态范围取决于多种因素，包括Cas9表达，细胞类型差异和传代1时的GFP％。
如果靶向该基因的多个向导在背景水平以上表现出最小的缺失，则该基因不太可能成为所测试细胞系的遗传依赖性。
如果靶向基因的多个向导在背景水平以上均表现出一致的缺失，则表明该基因对该细胞系具有依赖性。

记事簿

该协议为研究人员提供了一种简化的方法来探测癌细胞系中的个体遗传依赖性。它已被广泛用于识别白血病，小细胞肺癌，胰腺癌中的新依赖性，并在临床试验中询问其他几个目标（Shi 等人，2015; Lin 等人，2017和2019; Huang 等人。；，2018 ；Somerville 等，2018； Tarumoto 等，2018）。此外，我们的实验室会定期部署这种方法的变体，以探究其他情况下的遗传依赖性。例如，可以对该测定法进行修改以探测两个基因（即基因A和基因B）之间的合成致死关系。如果针对每个基因的指南分别表现出最小的缺失，但研究人员有证据表明这些基因具有一定程度的功能冗余，则可以进行双竞争分析。在此实验中，研究人员可以与两种表达不同荧光蛋白标记的向导共转导靶细胞（表1 ），其中向导1靶向基因A，向导2靶向基因B。通过测量单个荧光蛋白的表达以及在每次传代中同时表达两种荧光蛋白的细胞百分比，研究人员可以深入了解潜在的合成致死关系。如果双阳性人群表现出一致的耗竭，而单阳性人群则没有，这表明基因A和B之间可能存在潜在的合成致死关系。
用于转录调控的其他CRISPR工具的开发为研究人员提供了其他可能的探索遗传依赖性的方法。CRISPR干扰（CRISPRi ）系统将无催化作用的Cas9（dCas9）与Krüppel 相关框（KRAB）域融合，使研究人员能够抑制靶基因表达而不会形成双链断裂（Gilbert 等。，2013）。由此产生的部分功能丧失表型为研究人员研究潜在的药物靶标提供了另一个背景。这种正交方法的使用补充了CRISPR / Cas9标准产生的总功能丧失表型。诸如CRISPRi之类的部分功能丧失方法提供的遗传扰动模型更类似于靶向疗法的效果，因为任何潜在遗传依赖性的药理抑制作用都不是绝对的。通过使用dCas9-KRAB表达载体代替Cas9表达载体（Addgene ＃85969），以及通过使用靶向启动子而非功能外显子的向导，可以轻松地将该竞争测定法调整为CRISPRi 方法。我们的实验室定期进行此类测定，我们发现这种改良方法的结果与传统的Cas9筛查基本一致（Lin 等人，2019）。
尽管CRISPR / Cas9系统在研究遗传依赖性方面具有优于RNAi的众多优势，但仍需考虑一些限制。通常，Cas9核酸酶被用于在靶位点产生各种各样的插入缺失，并且认为所得的过早终止密码子导致突变体mRNA的无义介导的衰变（NMD）。但是，插入缺失的产生并不一定导致靶基因产物的消融。CRISPR诱导的遗传损伤可通过替代剪接和下游转录起始来绕过（Lalonde 等，2017; Sharpe and Cooper，2017）。另外，CRISPR诱导的敲除的意想不到的结果可能是功能未知的异常蛋白质产物的产生（Tuladhar 等，2019）。为了减轻这些因素的潜在混淆作用，我们强烈建议针对跨多个外显子的功能性蛋白结构域使用几种指南。此外，我们建议通过蛋白质印迹验证蛋白质消融。
突变mRNA NMD本身的过程也可能产生意想不到的后果。已知NMD是许多细胞类型（包括肝和骨髓细胞）的mRNA调节机制（Lykke-Andersen和Jensen，2015）。最近的一项研究表明，CRISPR诱导的NMD导致靶基因同源物的补偿性上调，这可能会掩盖CRISPR敲除的真实作用（El-Brolosy 等，2019）。但是，我们实验室进行的实验表明，这种补偿性上调在癌细胞中可能很少发生或不存在（Lin 等人，2019）。如果研究人员担心潜在的CRISPR诱导的同源基因上调，我们建议与竞争分析同时进行基因表达分析，以排除这种可能的混淆因素。值得注意的是，迄今为止描述的局限性是Cas9诱导的遗传损伤的后果。因此，可以通过使用不切割DNA的替代系统来扰动这些限制，例如CRISPR干扰。
除了CRISPR系统本身的局限性外，重要的是要注意，这种GFP竞争测定的结果决不能决定在其他情况下对于细胞适应性而言必不可少的基因状态。尽管在多个试验和细胞系中始终缺乏针对基因的指南的缺失，表明目标基因对于体外细胞自主生长是必不可少的，但该基因仍然有可能在其他细胞环境中具有依赖性，例如与锚定无关增长，低氧气条件下，在化学治疗剂的存在下，在体内，等因此，通过该测定不得分为遗传依赖性的基因仍可为抗癌治疗提供有价值的药物靶标。另一方面，如果研究人员发现针对基因的指南的一致性下降，则有力证据表明该基因具有遗传依赖性。应通过正交方法进一步研究此类结果。
我们相信这种测定方法将为研究人员提供一种有价值的方法来研究推定的癌症依赖性。我们实验室的结果表明，该测定法的发现是可靠的，并且其相对简单性使得研究人员可以在多种细胞类型中同时进行该测定法。最好将该方法用作首过方法，并辅之以对任何假定的癌症依赖性的彻底，深入的研究。

致谢

Sheltzer 实验室的研究得到了NIH早期独立奖（1DP5OD021385），Damon Runyon- Rachleff 创新奖，盖茨基金会创新技术解决方案基金和CSHL-Northwell转化癌症研究基金的支持。在CSHL流式细胞术共享资源的协助下进行了细胞分选，该资源得到了CSHL癌症中心支持赠款5P30CA045508的支持。该协议借鉴了Shi 等人发表的原始著作。（2015 ），Lin 等。（2017 和2019）和Giuliano 等人。（2019 ）。

利益争夺

JMS是Tyra Biosciences顾问委员会的成员，并已从Ono Pharmaceutical Co.收取咨询费。和默克

参考资料

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