设备

具有Intel Core i7 2600处理器（3.40 GHz ，8 Mb，4核，8线程，视频和Turboboost ）的台式计算机；英特尔DH67BL主板，LGA 1155插槽; 具有7.1 + 2声音；1 Gb网络；RAID 0.1.5年10; 和四个Kingston 1.333 Mhz DDR3 4 GB内存

软件

Ubuntu 18.0 4.3 LTS（Ubuntu，https: //ubuntu.com/#download ），最后一次访问于11/9/2019
BLAST（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/），blast-2.2.25 +上次访问时间为2013年2月7日
Ñ OTE ：FASTA程序（FASTA DNA：DNA 和FASTX）也可用于同源性搜索。尽管如此，当将高通量数据集与蛋白质数据库进行比对时，BLAST和FASTA程序仍然是主要的计算瓶颈，并且最近开发了各种工具来提高性能。特别是DIAMOND是一种用于蛋白质和翻译后的DNA搜索的开源序列比对器，其执行速度为BLAST的500x-20,000x，适用于在标准台式机和笔记本电脑上运行，并提供各种输出格式以及分类学分类（ Buchfink 等，201 5 ）。因此，当使用有限的计算资源将大型数据集与蛋白质数据库对齐时，我们建议使用Diamond。

MEGAN6（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6/）；MEGAN_Community_windows-x64_6_17_0版本最后访问于18/9/2019
在本教程中，MEGAN用于处理同源性搜索输出文件，然后提取分类和功能信息。要下载和安装此软件：

转到MEGAN网站（http://ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan6），然后下载与您的操作系统匹配的MEGAN6版本以及相应的映射文件。
运行安装程序
SQLite数据库浏览器（DB4S）（https://sqlitebrowser.org/）; DB.Browser.for.SQLite-3.11.2-win64版本最后访问日期为5/9/2019
用于SQLite的数据库浏览器（DB4S）是一种高质量，可视化的开源工具，用于创建，设计和编辑与SQLite兼容的数据库文件。它使用类似电子表格的界面，不需要学习复杂的SQL命令。在我们的工作流程中，我们使用DB4S创建一个本地数据库，其中包含数据集中每个序列的所有可用信息。然后将所有这些数据用于定义样品的分类和功能概况。要下载和安装此软件：

从网站上下载与您的操作系统匹配的DB4S 版本（ https://sqlitebrowser.org/）
运行安装程序

程序

注意：本教程介绍了用于分析环境样品中高通量元转录组序列的全局过程，并着重于如何以可靠可靠的方式定义其分类学和功能概况。

它不包括对从环境样品中获得的高通量序列的预处理的详细说明（为此，请参见Kim 等，2013；Aguiar-Pulido 等，2016 ），也不包括如何使用MEGAN。（为此，请参阅Huson 等人[ 2007 和2011 ] 和MEGAN用户手册）。

下面，我们提供详细的教程来展示HoSeIn的工作原理，以我们的一个样本为例，该序列是从鳞翅目幼虫的肠道中获得的序列数据集。该数据集的转录组学部分的分析最近被接受发表（Rozadilla 等，2020）。由于这类分析通常是由实验目标决定的（Shakya et al。，2019），因此有几句话解释了该特定样品及其后续分析的某些独特特征。夜蛾（Spodoptera frugiperda）（鳞翅目：夜蛾科）是一种经济上重要的农业害虫，原产于美洲大陆。分析该害虫的目的是描述幼虫肠道转录组和相关的转录组的分类和功能概况，以鉴定新的害虫防治目标。为此，从第五龄幼虫胆中提取总RNA，进行一步一步逆转录和PCR序列独立扩增程序，然后进行焦磷酸测序（McCarthy 等人，2015）；高通量的读段随后被组装成重叠群（Rozadilla 等，2020）。由于我们对鉴定，区分和鉴定宿主（S. frugiperda ）肠道转录组及其相关的元转录组感兴趣，因此我们下载了以下NCBI数据库，以便在本地进行同源性搜索（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih .GOV /爆炸/ DB /）（download_db.mp4 ，一个视频教程是介绍如何从NCBI下载不同类型的数据库文件，并download_db.sh ，一个bash脚本即自动下载这些数据库文件一个接一个，提供一个s 补充材料1）：

1）核浪潮：

- “ 非冗余”核苷酸序列（nt ）

- 16S rRNA基因（16S）

- 鳞翅目全基因组shot弹枪（Lep ）项目在分析时完成。

然后使用适当的BLAST +应用程序（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/）将nt ，16S和Nice的序列合并到一个数据库中（DB：nt16SLep ）（blast_tutorial.mp4 ，一个视频教程其显示了如何构建和组合不同的数据库和如何使用BLAST本地运行的同源性检索，并blast_commands.txt ，其包含在第使用的命令ë 教程，如提供补充材料2）。组合核苷酸数据库中的Lep 序列简化了宿主序列（代表大多数）的鉴定，而nt 和16S数据库使相关的转录组（以及宿主序列）的鉴定成为可能。

2）蛋白质：

- 非冗余蛋白序列（nr）

下面概述了工作流中包含的主要步骤（图2；有关详细信息，请参见教程）：

分析用序列升OCAL 小号层序一ligners ：重叠群被局部比组合（使用核苷酸数据库（nt16SLep）BLASTN Altschul 等人，1990）与1E-50 截止E值，并且对蛋白质数据库（NR）使用BLASTX（Altschul 等人，1990）使用1e-17 截止E值（补充材料2）。
注：^ h 埃雷我们使用BLASTX，因为该数据集我们正在查询是小（上述组装读取，即737重叠群）; 但是对于大型数据集和有限的计算资源，我们建议使用Diamond （Buchfink 等，201 5 ）。

处理同源性搜索结果：
步骤A （在小号tepA.mp4视频tutoria 升指导您一步工序）：输出文件从两个同源性搜索，然后用MEGAN，其执行分类学分级一个软件处理使用最低共同祖先和受让人序列类群（LCA）-分配算法（Huson et al。，2007）。然后，使用MEGAN功能导出由MEGAN为每个重叠群进行的分类和功能分配。

注意：MEGAN通过在NCBI分类法中找到包含命中分类单元集的最低节点，并为该最低节点所代表的分类单元分配序列，来计算“物种概况” 。使用这种方法，每个序列都分配给某个分类单元。如果序列非常明确地仅与单个分类单元对齐，则将其分配给该分类单元；序列打到分类单元的次数越少，其在分类法中的位置就越高（有关详细说明，请参见“ MEGAN用户手册”）。我们之所以选择MEGAN，因为该软件使用了LCA-分配算法，并有一个简单的功能为出口荷兰国际集团日Ë 分类和功能从数据集中的每个序列信息（即“品种简介”每个序列可以很容易地访问和下载）。但是，也可以使用提供此功能（即从数据集中导出每个序列的分类/功能分配）的任何其他工具或平台。

步骤B （s tepB.mp4视频教程指导您逐步进行）：两种同源性搜索的输出文件也将使用自定义bash脚本进行处理。该脚本解析同源性搜索输出文件，并生成两个文件（每个同源性搜索一个文件），其中包含每个重叠群的名称，最佳匹配（或无效匹配）和相应的E值。

创建本地数据库：步骤C （在补充材料步骤C中找到stepC.mp4 视频教程，逐步指导您）：然后，将所有这些信息（来自导出的MEGAN文件和bash脚本输出文件）用于：创建一个本地SQLite数据库，其中包含每个重叠群的所有可用信息（来自两个同源性搜索）。
分析本地数据库：步骤d （该stepD.mp4 视频教程中找到的补充材料步骤d通过一步一步的引导你）：最后的分类作业，然后由纵横交错的和比较所有使用不同的SQLite的命令该信息执行。步骤E （在stepE.mp4 视频教程中找到的补充材料。步骤E通过引导您一步步骤）：文稿分配是通过执行一定的SQLite命令组的转录物来实现对应于mRNA，rRNA基因，那些不能被分配（未分配），以及那些必须手动修改（修订）的内容。步骤F （所述stepF.mp4 发现视频教程在补充材料步骤F引导你通过一步一步）：最后，被转录的功能分配由功能划分的数据库被集成在单个列中通过执行一定的SQLite命令。功能数据库只能推定“ mRNA”和“ Revise”类别中的转录本，但是由于这些参考数据库中的信息仍然受到很大限制，因此只有大约三分之一的功能被分配了功能。这些转录其余的功能分配可以手动完成的基础上的同源性搜索结果（其中包括在本地SQLite数据库）（见数据一nalysis ）。

图2. HoSeIn （何mology 硒拱在tegration）的工作流程。此图显示了构成工作流程的主要步骤的概述（有关详细信息，请参见教程）：I.使用局部序列比对器分析序列：将序列提交到针对核苷酸（nt16SLep）和蛋白质（nr）数据库的同源性搜索。二。处理结果：两种同源性搜索的结果均使用MEGAN和自定义的bash脚本进行处理。步骤A ：使用MEGAN功能导出包含MEGAN分类和功能分配的文件。步骤B ：自定义bash脚本会为两个同源性搜索生成包含每个序列名称，其最佳匹配（或无匹配）和相应E值的文件。三，创建本地数据库：步骤C ：然后，使用MEGAN和bash脚本文件创建本地SQLite数据库，该数据库包含每个序列的所有可用数据。IV。分析本地数据库：通过交叉交叉并使用不同的SQLite命令比较所有这些信息来执行最终的分类和功能分配。步骤D ：使用某些标准和过滤器定义分类分配：1）“宿主过滤器”确定哪些序列对应于S. frugiperda 肠道转录组；2）nt16SLep匹配的“ E值= 0过滤器”，将那些明确的匹配分组；3）“最低共同祖先准则”用于与nt16SLep序列命中表示E-值 0时，由纵横交错从两个同源性搜索的结果，并保持最低的共同祖先的分配限定重叠群的其余部分的身份。步骤E ：通过在匹配描述中搜索某些关键字来实现字幕分配。以这种方式，有可能组转录物对应于mRNA，rRNA基因，那些不能被分配（未分配），以及那些必须被手动修订（修订）。步骤F ：最后，将对应于mRNA的所有序列的功能注释（或“修订”）整合到单个列中。不适用，未分配。

我们提供各种文件作为补充材料，供读者阅读本教程并重现下面显示的相同结果：

-一个FASTA文件，其中包含已组装的序列（Sf_TV_contigs.fasta ）和一个文本文件（coverage.csv ），其中包含每个contig的组装信息（即contig名称，用于组装每个contig 的读取次数，读取长度和contig覆盖范围），作为补充材料3提供 ;

- 从BLAST成对格式（二者同源性搜索的输出文件blastn_nt16SLep_total-contigs_Sf-TV.txt 和blastx_nr_total-contigs_Sf-TV.txt ）被提供作为增刊乐mentary材料4 ;

- 处理该同源性搜索结果写在bash两个自定义脚本（search_parser.sh 和analyser_blast.sh ）是作为增刊乐mentary材料5 ;

- 通过MEGAN6生成处理所述同源性检索输出文件（后“RMA”文件blastn_nt16sLep_total-contigs.rma6 和blastx_nr_total-contigs.rma6 ）被提供作为增刊乐mentary材料6 ;

- 含有相交，分配不同的命令和文本文件分析在本地SQLite数据库中的数据：step_C_creating_taxonomy.txt 发现在补充材料步骤C，step_D_crisscrossing_taxonomy.txt 发现在补充材料步骤d，step_E_assigning transcripts.txt 发现在补充材料步骤E，step_F_functional_assignment.txt 发现在补充材料步骤F，和analysing_taxonomy.txt。

HoSeIn 教程（另请参见图2）：

I. 分析用序列升OCAL 小号层序一ligners ：如前所述，同源性搜索，使用BLASTN和BLAS本地执行TX（Altschul 等人。，199 0）对合并的核苷酸（nt16SLep）和蛋白质（NR）与数据库1E 截止E值分别为-50和1e-17 。同源性搜索结果可在blastn_nt16SLep_total-contigs_Sf-TV.txt 和blastx_nr_total-contigs_Sf-TV.txt 文件中找到（补充材料4）。视频教程download_db.mp4 显示了如何从NCBI下载不同类型的数据库文件，并且bash脚本download_db.sh 自动地一个接一个地下载这些数据库文件（补充资料1）。视频教程blast_tutorial.mp4 展示了如何构建和组合不同的数据库，以及如何使用BLAST在本地运行同源性搜索；该视频中使用的命令可以在blast_commands.txt （补充材料2）中找到。

二。处理同源性搜索结果：两次同源性搜索的输出文件都用MEGAN处理，并保存为blastn_nt16sLep_total-contigs.rma6 和blastx_nr_total-contigs.rma6 （补充材料6）。

导出的分类学和功能分配两者的同源性进行由MEGAN 搜索（图小号3 -9 ，StepA.mp4视频tutoria 升和补充˚F igure S1）：
使用MEGAN打开提供的RMA文件（blastn_nt16sLep_total-contigs.rma6 和blastx_nr_total-contigs.rma6 在补充材料6中找到）。要打开RMA文件，请选择“文件”>“打开”，然后浏览到所需的文件（图3 ）。主窗口用于显示分类法并使用主菜单控制程序。处理完数据集后，将显示该数据集引起的分类。节点的大小指示已分配给节点的序列数（有关详细说明，请参见“ MEGAN用户手册”）。
要从MEGAN中提取分类信息，必须将分类树从“域”逐步扩展到物种，选择所有叶子，然后以csv（逗号分隔值）格式提取文本文件。选择您要提取的分类级别（从域到物种）：“树”>“等级”（图4 ）。
选择叶子：“选择”>“所有叶子”（图5 ）。
在不取消选择叶子的情况下，将文件导出为csv格式：“文件”>“导出”>“ CSV格式”（图6 ）。
选择要导出的数据，并以哪种方式在csv文件中将其制表（选择“汇总”，以便导出所选分类标准以及所有较低分类中包含的序列）（图7 ）。我们建议的命名有代表性的名，指示同源性搜索和分类级别类型的文件，例如“ nucl_d omain ”。
通过这种方式，可以获取一个csv文本文件（可以在基本的文字处理器（如写字板）中查看）。这些文件中的每一个都有两个字段，一个具有序列名称，另一个具有相应的指定分类级别（域，Phylum 等）（图8 ）。
对每个分类水平和其他同源性搜索重复此过程。以此方式，获得了14个文件（每个同源性搜索为7个文件），每个文件对应于特定的分类标准（图9 ）。
提取功能信息的过程非常相似（请参见补充图S1和StepA.mp4视频教程）：1）选择要可视化的功能树，例如InterPro2GO（图S1A.1）；2）取消折叠所有节点：“树”>“ 全部折叠”（图S1A.2）；3）“选择”>“所有叶子”（图S1A.3）；4）在不取消选择叶子的情况下，将文件导出为csv格式：“文件”>“导出”>“ CSV格式”（图S1A.4）；5）选择要导出的数据：“ readName_to_interpro2goPath”（图S1A.5）。对要包含在最终分析中的所有功能树重复该过程；在本教程中，我们还导出了EggNOG 分配（图S1B）。

图3. 在MEGAN中打开提供的.rma 6文件。A.从“文件”叶子（红色矩形）中选择“打开”。B. 从保存文件的位置中选择提供的.rma 6文件之一（在此处选择blastn_nt16sLep_total-contigs.rma6 ；红色矩形）。C. blastn_nt16sLep_total- contigs.rma 6的外观已降至“物种”分类学等级。

图4. 选择一个分类等级。A.从“树”叶子（红色矩形）中选择“等级”。B.从下拉菜单中选择所需的等级（红色箭头表示此处已选择“域” ）。

图5. 从选定的生物分类等级中选择所有叶子。从“选择”叶子（红色矩形）中选择“所有叶子”。

图6. 以csv格式导出。从“文件” 叶子中选择“导出” ，然后从下拉菜单（红色矩形）中选择“文本（CSV）格式”。

图7. 选择导出数据的方式。从“选择要导出的数据”下拉菜单中选择“ readName_to_taxonName ”，从“选择要使用的计数”下拉菜单中选择“摘要”，然后从“选择要使用的分隔符”下拉菜单中选择“选项卡”（红色矩形）。

图8. 导出的“ nucl_domain.csv”文件的局部视图。第一列包含序列名称（例如Contig479），第二列包含分配给每个序列的分类等级（在此图中为“域”，例如“细菌”）。

图9 。导出的MEGAN文件。包含从MEGAN导出的全部14个文件的文件夹，根据相应的同源性搜索和分类级别（红色矩形）进行命名。

解析同源性搜索的输出文件（图10 和补充材料 stepB.mp4视频教程）：
Ť 他一步都必须进行的一个Linux操作系统，因为解析同源性搜索结果中的脚本，我们重新写在bash。脚本处理FASTA文件（包含查询序列）和同源性搜索输出文件：

提供的脚本（search_parser.sh 和analyser_blast.sh 从补充材料5，FASTA文件（）Sf_TV_contigs.fasta 从补充材料3根据同源性搜索（）和输出文件blastn_nt16SLep_total-contigs_Sf-TV.txt 和blastx_nr_total-CONT TXT 从补充材料4），毛里求斯T总为p 在同一文件夹系带（图10 甲）。
我们提供的两个bash脚本中，仅执行search_parser.sh 。该脚本通过同时执行各种analyser_blast.sh 脚本来加快处理速度。打开包含文件相同的文件夹中的终端并执行search_parser.sh bash脚本以下列顺序严格（也见下面的例子和图小号10 B- 10 C）：
bash search_parser.sh （查询fasta的名称和文件扩展名）（同源性搜索结果的名称和文件扩展名）（为输出文件选择名称和文件扩展名）

bash search_parser.sh Sf_TV_ contigs.fasta blastn_nt16Slep_total-contigs.txt nucl_hits.csv

图10 。使用bash脚本。答：淡蓝色矩形表示包含所有必要文件的文件夹，脚本可以正常工作。B.红色矩形表示如何执行脚本来处理BLASTN输出文件（针对核苷酸数据库的同源性搜索）。C.该图像显示在处理来自BLASTN同源性搜索（1和2）和来自BLASTX同源性搜索（3和4）的输出文件之后，出现在终端中的消息。

脚本会生成一个csv文件，其中三个字段之间用“％”分隔：第一个显示每个序列的名称，第二个显示其最佳匹配（如果没有匹配则不显示），第三个显示其对应的E值（或如果没有命中，则什么都不是）（图11 ）。

图11 。脚本生成的csv文件的部分图像。文件显示列出的BLASTN（A）和BLASTX命中（B）。在两个文件中，显示序列名称，其最佳匹配和相应E值的字段均以“％”分隔。

创建在DB4S数据库（图小号12-18 ，和step_C_creating_taxonomy.txt 和stepC.mp4 视频教程˚F 在ound 补充材料步骤C）：
包含所有用于组装的信息的文件读取（coverage.csv 发现在补充材料3 ;包括重叠群名称，读取用于组装每个重叠群，读出长度，并且重叠群覆盖数），则导出MEGAN文件（14页分类的文件和现在将使用来自步骤A的2个功能文件和bash脚本输出文件（来自步骤B的2个文件）创建具有DB4S的本地数据库，该数据库将包含每个重叠群的所有可用信息（来自同源搜索，BLASTN和BLASTX）。为此，首先必须将每个csv文件分别导入DB4S：

通过单击“ New Database”并选择保存位置来创建一个新数据库（图12 ）。
分别导入从MEGAN导出的csv文件（16个文件），由bash脚本创建的csv文件（2个文件）以及包含contig的程序集信息的文件（1个文件）：“文件”>“导入” > “来自CSV文件的表格”（图13 ）。
为表选择一个名称，并指示字段分隔符（对于从MEGAN导入的文件，Tab；对于bash脚本生成的文件，Other>％）（图14 ）。仅对于coverage.csv ，选中“第一行中的列名”框，这将自动为列提供正确的名称（图14 C ）。
我们建议重命名具有代表性名称的表列，如图15 所示，以便能够使用我们为步骤C6 ，D，E和F 提供的命令（并且还可以简化命令的解释并避免错误）。
图16 显示了重命名后的表列表。
下一步包括将来自所有导入文件的信息集成到一个新表中，如图17 和18所示。该集的命令step_C_creating_taxonomy.txt 从补充材料步骤C，创建一个名为“分类法”统一了所有导入的CSV文件列，并增加了空列（新表final_domain ，final_phylum ，等等）进行填充后续分类学交叉交叉的结果（步骤D）。它还添加辅助列“ state_taxo ”（以指示重叠群是否在分类上进行分配，并避免多次分配；步骤D）“ rna_type ”（以指示转录本是否对应于mRNA或rRNA；步骤E）“ state_function” ”（表示是否已分配成绩单或需要对其进行修改；步骤E）和“ function_type ”（集成功能数据库对那些成绩单进行的功能分配；步骤F）。

图12. 在DB4S中创建一个新数据库。答：单击“新数据库”（红色箭头）。B.将出现一个窗口，要求您选择文件名和位置来保存新数据库（红色矩形）。

图13. 导入csv文件。答：单击“文件”叶子（红色箭头），然后从下拉菜单（红色矩形）中选择“导入”和“来自CSV文件的表格”。B.选择要导入的csv文件（图中“ nucl_domain.txt”；红色矩形）。

图14. 命名导入的表。选择一个csv文件后，将出现一个新窗口，您必须在其中命名表并指出字段分隔符。A.对于从MEGAN导入的文件，字段分隔符为“ Tab”；该表被命名为“ nucl_domain ”（红色矩形）。B.对于由bash脚本生成的文件，字段分隔符为“其他”>“％”；该表被命名为“ nucl_hit ”（红色矩形）。C.对于“ coverage”文件，选中“第一行中的列名”框（由红色箭头指示），然后选择“ Tab”作为字段分隔符；浅蓝色矩形表示分配的列名称。

图15. 重命名表列。答：在主窗口中，用鼠标右键选择要修改的表，然后单击“修改表”（红色矩形）。B.将打开一个新窗口，其中显示字段（与列名称相对应）；双击每个以重命名。对于从MEGAN文件中获得的表格，将“ field1”重命名为“ sequence”，并根据用于同源性搜索的数据库（nucl 或prot ）命名表格和“ field2”，后跟适当的分类等级（例如，域）; 在图中，“ nucl_domain ”（红色矩形）。C.从bash脚本生成的文件中获得的表具有三列：将“ field1”重命名为“ sequence”；将“ field1”重命名为“ sequence”。对于BLASTN匹配，将“ field2”重命名为“ nucl_hit ”，对于BLASTX匹配，将其重命名为“ prot_hit ” ；对于BLASTN匹配，将“ field3”重命名为“ nucl_Evalue ”，对于BLASTX匹配，将“ field3”重命名为“ prot_Evalue ” （红色矩形）。

注意：“覆盖”文件中的列是在上一步中命名的，因此不需要进行修改。

图16. DB4S中的“数据库结构”窗口列出了所有导入和重命名的表。

图17. 统一所有导入文件中的信息以创建一个表。1）在“ Execute SQL”叶中，2）粘贴step_C_creating_taxonomy.txt中包含的命令，并3）用“ Play”执行它们；4）下面板指示命令是否成功执行。

图18 。上一步中创建的“分类”表的视图。答：在“数据库结构”叶子（红色箭头）中，将出现一个新的“分类”表（红色矩形）。B. 要浏览新的“分类”表，请从“浏览数据”叶子的下拉菜单中选择它（由红色箭头和矩形表示）；浅蓝色矩形显示在“分类法”中创建的列的局部视图。

确定分类配置文件（图19 以及在补充材料步骤D中找到的step_D_crisscrossing_taxonomy.txt 和stepD.mp4 视频教程）：
下一步是根据以下标准，将“分类法”表中包含的所有信息相交，以阐明样品的分类法概况：

在至少一种同源性搜索中分配给节肢动物的重叠群被分配给宿主转录切片机。
在nt16SLep搜索中具有E值= 0的命中的重叠群将直接分配给该分类单元。
其余重叠群通过根据LCA逻辑比较两个同源搜索的MEGAN分配来分配；也就是说，重叠群的分类分配水平是两个结果的共同点，或者如果在其他同源性搜索中没有命中的话，则是唯一的结果。
在任何同源性搜索中未由MEGAN分配给任何分类单元的重叠群均被视为“未分配”；在两个同源性搜索中均未命中的重叠群被认为是“无命中”。
这些分配进行通过执行这些命令step_D_crisscrossing_taxonomy.txt 在DB4S（图19 和stepD.mp4 视频教程从补充材料步骤d）。

图19 。在“分类”表中确定最终的分类分配。A.要执行这些分配：1）在“执行SQL”叶中，2）粘贴step_D_crisscrossing_taxonomy.txt中包含的命令，并3）使用“播放” 执行它们；4）下面板指示命令是否成功执行。B.要查看更新的“分类”表，请从“浏览数据”页面的下拉菜单中选择它（由红色箭头和矩形表示）；淡蓝色的矩形表示与最终分类分配的列之后纵横交错从两个同源性搜索的分类信息（final_domain ，final_phylum ，等等）。

对成绩单进行分类（图20 以及在补充材料步骤E中找到的step_E_assigning transcripts.txt 和stepE.mp4 视频教程）：
由于此样品是从总RNA中获得的，因此可以使用同源性搜索的命中描述中包含的信息（“ nucl_hit ”和“ prot_hit ”列）将这些序列进一步分为信使RNA或核糖体RNA ，基于以下条件：

如果重叠群在“ nucl_hit ”列中显示单词“ mRNA”，则被分配给mRNA 。
如果重叠群在“ nucl_hit ”列中显示单词“ rRNA /核糖体RNA”，则被分配给rRNA 。
如果重叠群在“ nucl_hit ”和“ prot_hit ”栏中分别显示“基因组/染色体/支架/重叠群”或“未表征/假设/未知/ ncRNA”，则在功能上被视为“未分配” 。
所有其他重叠群都包含在“修订”类别中，以手动进行更改。
这些分配进行通过执行找到的命令step_E_assigning transcripts.txt 在DB4S（图20 和stepE.mp4 视频教程从补充材料步骤E）。

图20 。在“分类”表中确定成绩单分配。在“执行SQL”叶1），2）粘贴包含在命令：A.为了执行这些任务step_E_assigning transcripts.txt 一个第二3）与“播放”执行它们; 4）下面板指示命令是否成功执行。B.要查看更新的“分类”表，请从“浏览数据”页面的下拉菜单中选择它（由红色箭头和矩形表示）；浅蓝色矩形表示具有最终成绩单分配的列：“ rna_type ”和“ state_function ”。“ rna_type ”列指示该成绩单被分配到的类别（即“ mRNA”，“ rRNA”，“未分配”或“修订”）。将成绩单分配给“ mRNA”，“ rRNA”或“未分配”时，“ state_function ”列中将显示“已分配”状态；如果成绩单包含在“修订”类别中，则为“ NULL”。

功能分配（图21 ，和step_F_ 功能分配的.txt 和stepF.mp4 视频教程发现在补充材料步骤F）：
此步骤将由功能数据库分类的那些成绩单的所有功能分配整合到单个列中（“ function_type ”）。这是通过执行的命令完成在发现step_F_functional assignment.txt 在DB4S（图21 和stepF.mp4 视频教程从补充材料步骤F）。从上一步可以推论，功能数据库只能推定“ mRNA”和“ Revise”类别中的转录本。尽管如此，只有约三分之一被分配的功能，因为在这些参考数据库中的信息仍然很大限制（见“数据一nalysis”）。

图21 。将功能分配集成到“分类”表中。A. 1）在“ Execute SQL”叶中，2）粘贴step_F_functional assignment.txt中包含的命令，并3）用“ Play”执行它们；4）下面板指示命令是否成功执行。B.要查看更新的“分类”表，请从“浏览数据”页面的下拉菜单中选择它（由红色箭头和矩形表示）；浅蓝色矩形表示“ function_type ”列，其中显示了集成的功能分配。功能数据库未分类的成绩单显示为“ NULL”。

数据分析

浏览“分类法”的表（补充˚F igures S2-S5和analysing_taxonomy.txt）：

我们终于准备好浏览和分析“浏览数据”叶中更新的“分类”表。可以应用一个或多个过滤器来促进数据分析。此外，可以执行一些命令来可视化，例如，样品的分类分布（补充图S2），转录本类型的分布（补充图S3）或在同源性搜索中获得的匹配的非冗余列表（补充图S4）。

为了更详细地分析功能概况，可以列出通过功能数据库分类的所有“ mRNA”和“ Revise”转录本，以及没有转录的（补充图S5）。如前所述，由于参考数据库并不全面，因此我们发现，实际上可以被功能数据库分类的所有转录本（“ mRNA”和“ Revise”类别）中只有大约30％被真正分类了。 ; 补充图S5 甲）。为了确定剩余的70％的功能谱（122个重叠群；补充图S5 B ），可以根据同源性搜索结果分别确定这些转录本的功能分配，然后手动将其输入数据库。为了确定优先顺序并帮助减少此大量工作量，可以根据覆盖范围查看重叠群（补充图S5 B ）。

所有这些命令都包含在analysing_taxonomy.txt中，并且可以进行调整以涵盖其他兴趣。

记事簿

由于文件大小的问题，我们举例说明与组装读取（737个重叠群），B使用我们的工作流程的UT，我们还使用HoSeIn 分析我们读（〜300,000）和它的作品完美。
此工作流最初是为分析高通量元转录组序列而开发的，但我们也已使用它来分析高通量宏基因组序列。此外，我们通过分析一个模拟宏基因组（BMock12）验证了我们的工作流程（塞维姆等人，2019）以及比较用我们所报道的合成宏基因组中获得的结果（塞维姆等人，2019）。该验证已包括在研究中，在该研究中我们介绍了本教程使用的数据集的分析，该数据集最近已被接受发表（Rozadilla 等人，2020年），并在此处作为补充分析（Supplementary Analysis_mock metagenome.docx ）包括在内。）。总之，我们将我们的结果与Sevim 等人报道的结果进行了对比。（2019）（表S1），发现我们的工作流程不仅确定了模拟元基因组的所有成员，而且我们确定的每个社区成员重叠群的数量大于（或相同，但绝不低于）作者报告了（表S1）。总之，我们的工作流程使我们能够比以前报告的方法更敏感地识别模拟元基因组的所有社区成员。
尽管我们的工作流程中有许多手动步骤，但这些步骤可与基于分类的基于比对的方法用来对来自转录组学/宏基因组学数据集的读数进行分类和标记的步骤数量相媲美。有一些用于元转录组数据集的生物信息学工作流，旨在通过将多个单独的工具连接到一个工作流中来简化这种复杂性，该工作流可以进行原始测序读取，对其进行处理并为数据文件提供分类学身份，功能基因和/或差异表达的转录本（ Shakya et al。，2019）。然而，为了定义分类和功能分配，这些平台针对蛋白质或核苷酸数据库（而非两者）执行基于序列的搜索（Shakya 等人，2019）。如已经提到的，对蛋白质数据库的搜索使得能够检测远距离相关的生物，但是容易被错误发现，而对核苷酸数据库的搜索则更加特异性，但是无法识别保守性不足的序列。因此，必须仔细解释使用这些简化的工作流程进行的元转录组分析。另一个主要缺点是，这些中的一些通过搜索针对设计用于功能表征数据库工作流分配分类学（释迦等人，2019 ）。
HoSeIn 工作流程中独特创新的摘要：
从同源性搜索和通过tevertever方法对序列进行分类和标记后，可将每个序列的所有可用信息组装并整合到本地数据库中，并且可以轻松查看和分析。
通过比较来自两个同源搜索的遵循LCA逻辑的每个序列的分类分配来定义样品的分类图谱。即，一个序列的生物分类分配水平是两个同源性搜索结果中共同发现的，或者是在另一个同源性搜索中未返回命中值时唯一的结果。
因此，我们工作流程的新颖之处在于，最终分配可以利用同源性搜索的优势来整合两个同源性搜索的结果，从而使它们更加健壮和可靠。特别是对于转录组学而言，结果难以解释，这是一个非常有用的工具。
通过首先分配成绩单，然后将所有功能信息集成到一个列中（在本地数据库中）来定义功能配置文件。我们观察到的是，功能数据库目前仅能够对所有可能被功能分类的转录本进行分类，大约30％。据我们所知，其他现有工具尚无法解析这些成绩单的其余三分之二的功能信息。相反，在我们的工作流程中，可以根据同源性搜索结果（包含在本地数据库中）确定这些成绩单的功能分配，从而提供更加完整和详细的功能配置文件。

致谢

本研究是由支持AGENCIA 国立Promoción Científica ý 技术网络（PICT PRH 112和PICT出租车司机3632），和理事会全国国立科学调查Científicas Ý TÉCNICAS （圆锥）（PIP 0294）授予CBM。CBM是CONICET研究事业的成员。GR和JMC是CONICET研究金的获得者，本文摘自McCarthy 等人。（2013年）和Rozadilla 等人。（2020）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考资料

Aguiar-Pulido，V.，Huang，W.，Suarez-Ulloa，V.，Cickovski ，T.，Mathee ，K.和Narasimhan，G.（2016）。用于微生物组分析的元基因组学，元转录组学和代谢组学方法。Evol Bioinform Online 12（增刊1）：5-16。
Altschul ，SF，Gish，W.，Miller，W.，Myers，EW和Lipman，DJ（1990）。基本的局部比对搜索工具。分子生物学杂志215（3）：403-410。
Ashburner，M.，Ball，CA，Blake，JA，Botstein，D.，Butler，H.，Cherry，JM，Davis，AP，Dolinski ，K.，Dwight，SS，Eppig ，JT，Harris，MA，希尔， DP，Issel- Tarver，L.，Kasarskis ，A.，Lewis，S.，Matese ，JC，Richardson，JE，Ringwald，M.，Rubin，GM和Sherlock，G。（2000）。基因本体论：统一生物学的工具。基因本体联盟。Nat Genet 25（1）：25-29。
布雷克，J. A.，克里斯蒂，K. R.，多兰，M. E.，德拉布坎，H. J.，希尔，D. P.，镍，L.，西特尼科夫，D.，等人。（2015）。基因本体联盟：向前迈进。核酸研究43（数据库问题）：D1049-1056。
Buchfink，B.，X 即C. and Huson，DH（2015）。使用DIAMOND快速灵敏的蛋白质比对。自然方法12（1）：59-60 。
Finn，RD，Attwood，TK，Babbitt，PC，Bateman，A.，Bork，P.，Bridge，AJ，Chang，HY，Dosztanyi ，Z.，El- Gebali ，S.，Fraser，M.，Gough，J 。，Haft，D.，Holliday，GL，Huang，H.，Huang，X.，Letunic ，I.，Lopez，R.，Lu，S.，Marchler- Bauer，A.，Mi，H.，Mistry， J.，Natale，DA，Necci ，M.，Nuka，G.，Orengo ，CA，Park，Y.，Pesseat ，S.，Piovesan ，D.，Potter，SC，Rawlings，ND，Redaschi ，N.，理查森，L.，Rivoire ，C.，Sangrador -Vegas，A.，Sigrist ，C.，Sillitoe，I.，Smithers，B.，Squizzato ，S.，Sutton，G.，Thanki ，N.，Thomas，PD，Tosatto ，SC，Wu，CH，Xenarios ，I.，Yeh，LS，Young，SY和Mitchell，AL（2017）。InterPro在2017年中超越蛋白质家族和领域注释。核酸研究45（D1）：D190-D199。
Glass，EM和Meyer，F。（2011）。的宏基因组学RAST 服务器：一个公共resourc e此自动系统发育和宏基因组的功能分析。在：分子手册微生物生态学我：宏基因组学和互补的方法，生物医学中心9 （1 ）：325 - 331。
Huson ，DH，Auch，AF，Qi，J. and Schuster，SC（2007）。MEGAN对宏基因组学数据的分析。Genome Res 17（3）：377-386。
Huson ，DH，Mitra，S.，Ruscheweyh ，HJ，Weber，N。和Schuster，SC（2011）。使用MEGAN4对环境序列进行综合分析。Genome Res 21（9）：1552-1560。
Kim，M.，Lee，KH，Yoon，SW，Kim，BS，Chun，J.和Yi，H.（2013）。下一代测序时代中宏基因组学的分析工具和数据库。Genomics Inform 11（3）：102-113。
Kotera ，M.，Moriya，Y.，Tokimatsu ，T.，Kanehisa ，M.和Goto ，S.（2015）。KEGG和GenomeNet，新进展，元基因组分析。在：Metagenomics百科全书：基因，基因组和元基因组：基础，方法，数据库和工具中。纳尔逊 KE（编辑）。马萨诸塞州波士顿，史普林格美国：329-339。
Marchesi ，JR和Ravel，J.（2015年）。微生物组研究词汇：一项建议。微生物组3:31 。
Marchler -Bauer ，A.，Bo，Y.，Han，L.，He，J.，Lanczycki ，CJ，Lu，S.，Chitsaz ，F.，Derbyshire，MK，Geer，RC，Gonzales，NR，Gwadz ， M.，Hurwitz，DI，Lu，F.，Marchler ，GH，Song，JS，Thanki ，N.，Wang，Z.，Yamashita，RA，Zhang，D.，Zheng，C.，Geer，LY and Bryant， SH（2017）。CDD / SPARCLE：通过亚家族结构设计师对蛋白质进行功能分类。核酸研究45（D1）：D200-D203。
Markowitz，VM，Chen，IM，Palaniappan ，K.，Chu，K.，Szeto，E.，Grechkin ，Y.，Ratner，A.，Jacob，B.，Huang，J.，Williams，P.，Huntemann ， M.，Anderson，I.，Mavromatis ，K.，Ivanova，NN和Kyrpides ，NC（2012）。IMG：在综合微生物基因组数据库和比较分析系统。Nucleic Acids Res 40（数据库问题）：D115-122。
McCarthy，CB，Santini，MS，Pimenta ，PF和Diambra ，LA（2013）。首次比较转录组学分析野生成年雌性和长形Lutzomyia longipalpis，内脏利什曼病的载体。PLoS 一8（3）：e58645。
McCarthy，CB，Cabrera，NA和Virla ，EG（2015）。南美亚热带地区田间采集和实验室培养的草地贪夜蛾幼虫肠道的转录组学分析。基因组公告3（4）：e00777-15。
H.Ogata ，H.，Goto ，S.，Sato，K.，W.Fujibuchi ，H.Bono ，M 。和Kanehisa ，M。（1999）。KEGG：《京都基因与基因组百科全书》。核酸研究27（1）：29-34。
Overbeek ，R.，Olson，R.，Pusch ，GD，Olsen，GJ，Davis，JJ，Disz ，T.，Edwards，RA，Gerdes，S.，Parrello ，B.，Shukla，M.，Wonstein ，W. ，Wattam ，AR，Xia F.和Stevens，R.（2014年）。使用子系统技术（RAST）的SEED和微生物基因组快速注释。核酸研究42（数据库问题）：D206-214。
皮尔森W.（2004）。查找与FASTA的蛋白质和核苷酸相似性。Curr Protoc 生物信息学第3章：Unit3 9。
Powell，S.，Szklarczyk ，D.，Trachana ，K.，Roth，A.，Kuhn，M.，Muller，J.，Arnold，R.，Rattei ，T.，Letunic ，I.，Doerks ，T.， Jensen，LJ，von Mering 和C.Bork，P.（2012年）。eggNOG v3.0：直系同源群体，涵盖41种不同分类范围内的1133个生物。核酸研究40（数据库问题）：D284-289。
Rozadilla ，G.，Cabrera，NA，Virla ，EG，Greco，NM和McCarthy，CB （2020）。通过转录组学分析揭示了Spodoptera frugiperda（JE Smith）幼虫的肠道菌群。应用昆虫学报n / a（n / a）。doi.org/10.1111/jen.12742 。
Sevim ，V.，Lee，J.，Egan，R.，Clum ，A.，Hundley，H.，Lee，J.，Everroad ，RC，Detweiler，AM，Bebout ，BM，Pett- Ridge，J.，Goker ，M.，Murray，AE，Lindemann，SR，Klenk ，HP，O'Malley，R.，Zane，M.，Cheng，JF，Copeland，A.，Daum ，C.，Singer，E。和Woyke ，T （2019）。使用牛津纳米孔，PacBio和Illumina技术的已定义模拟社区的Shotgun元基因组数据。科学日期6（1）：285。
Shakya，M.，Lo，CC和Chain，PSG（2019）。元转录组学分析的进展和挑战。创世纪10：904。
Tatusov ，RL，Galperin，MY，Natale，DA和Koonin ，EV（2000）。COG数据库：用于蛋白质功能和进化的基因组规模分析的工具。核酸研究28（1）：33-36。
Wooley，JC，Godzik ，A。和Friedberg，I。（2010）。一个例子是宏基因组学。PLoS Comput Biol 6（2）：e1000667。