材料和试剂

1. 12毫升超离心管（Beckman Coulter，目录号：344059）。
2. 1.5毫升Eppendorf安全锁管。
3. 脊柱针(BD，目录号：405256)
4. 75 cm2烧瓶
5. 胎牛血清(FBS)
6. OptiPrepTM 密度梯度培养基（碘克沙醇溶液，Sigma-Aldrich，目录号：D1556-250ML）。
7. 全套蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏，目录号：04906837001）。
8. 完全磷酸酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏，目录号：04693124001）。
9. 氯化钠（NaCl）
10. 氯化钾(KCl)
11. 氢氧化钠
12. KH2PO4
13. 盐酸三酯(Tris-HCl)
14. 乙二胺四乙酸(EDTA)
15. Triton X-100
16. 蔗糖
17. 磷酸盐缓冲盐水（PBS；预制或见配方）。
18. RPMI媒体
19. PBS(冰镇)(见食谱)
20. 解决方案A（见配方）
21. 溶液B（稀释剂）（见配方）。
22. 溶液C（工作溶液）（见配方）。
23. 溶液D（重悬介质1）（见配方）。
24. 溶液E（再悬浮介质2）（见配方）。

装备

1. 移液器
2. 离心机(Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R)
3. 超速离心机(Beckman Coulter，型号：Optima MAX-TL)
4. 超速离心机(Beckman Coulter，型号：Optima L-90K)
5. 双室梯度成形器（Sigma-Aldrich，目录号：Z340391）。
6. Misonix S-4000型超声仪，带微型探头。
7. 旋转斗转子（SW41 Ti或类似）
8. CO2孵化器
9. -80℃冷冻室

流程

本协议基于挪威 Alere Technologies AS 的技术手册。
1. 种子细胞在2×75厘米2的烧瓶中，以每烧瓶2.5×106个细胞的密度在9.5毫升含10％FBS的RPMI培养基中。在CO2培养箱中孵育48小时，在37℃。该持续时间应根据特定的细胞系进行优化。我们建议在30％汇合的种子。

注：以下所有程序均在冰上进行。
2. 用冷的PBS（7ml）洗涤细胞两次。
3. 刮取细胞，并在4℃下以1,000 xg旋转5分钟。取出上清液。
4. 通过低渗冲击制备膜部分。
a. 加入1毫升冷的5mM Tris-HCl（pH 7.5），含有完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒（1片/7毫升）。在冰上放置30分钟。涡流每10分钟。
b. 放进冰箱15-30分钟（至冻结），然后在冰上解冻。
c. 细胞碎片在400 xg下旋转5分钟，在4℃下。收集上清液。
d. 在超离心机中使用固定角度转子350,000 xg旋转上清液在4℃下90分钟。
5. 将颗粒（膜部分）重新悬浮在1毫升的溶液D中，在一个合适的管中（例如，1.5毫升Eppendorf Saf-Lock管）。
6. 将管子放在冰上，并将超声探头（直径约3毫米）的尖端引入到悬浮液的顶部和底部等距离的点。
7. 以每秒25 J/W的总功率超声处理一次，持续4秒。旋下未溶解的颗粒。用缓冲液D作为空白，用布拉德福德法估算蛋白质浓度。调整样品体积到2.16毫升与缓冲液D。
8. 将样品与1.84毫升溶液C混合，最终碘克沙醇浓度为23%(w/v)。
9. 制备两种梯度溶液。将溶液C与溶液E稀释(分别为1:4和2:3 v/v)，制得两种梯度溶液：10%(重量/体积)碘克沙醇(ρ=1.076 g/ml)和20%(重量/体积)碘克沙醇(ρ=1.125 g/ml)。
10. 产生8毫升连续10-20％碘克沙醇梯度在12毫升超离心管中使用一个标准的两室梯度前者。把梯度前者在磁力搅拌器上。倒入4毫升20％碘克沙醇到储液室和4毫升10％碘克沙醇到混合室（把小磁力搅拌棒到后者）。将管子从混合室阀门放入超离心管中，打开互连阀，开始形成线性梯度。我们建议在当天使用这种梯度溶液，但它可以在冰箱中保存过夜。
备注：对于处理多个样品或如果没有梯度仪，可采用其他协议来制备连续梯度。对于处理多个样品，或者如果没有梯度仪，采用其他协议来制备连续梯度可能更合适。
a. 制备两种梯度溶液。将溶液C与溶液E稀释(分别为1:4和2:3的体积，最终体积各为5毫升)，制成两种梯度溶液：10%(重量/体积)碘克沙醇(ρ=1.076克/毫升)和20%(重量/体积)碘克沙醇(ρ=1.125克/毫升)。
b. 将10％和20％的梯度溶液按2:1（v/v）的比例混合，生成13.3％的梯度溶液（最终体积2.5ml）。
c. 将10％和20％的梯度溶液按1：2的比例混合，生成16.7％的梯度溶液（最终体积2.5毫升）。
d. 轻轻地加入2毫升20％的溶液到12毫升超离心管中，确保没有气泡。
e. 用Parafilm覆盖管，并在-80℃下冻结溶液，直到溶液完全冻结（约30分钟）。确保管子保持垂直。
f. 重复步骤4和5，将16.7%的梯度溶液分层置于冷冻层之上。随后是13.3%，最后是10%的溶液。
g. 将形成的梯度溶液储存在-80℃的冷冻室中，直到需要时才使用。
h. 检索管18小时前旋转，并保持在4℃下解冻。
i. 检索管至少2小时前旋转，并保持在室温下。
11. 铺设用4毫升的样品的梯度使用长脊髓针和离心机在52,000 xg离心90分钟，在4℃下使用摇桶转子（SW41 Ti或类似）。
12. 收集顶部5毫升的梯度，转移到一个新的离心管中，并与4毫升溶液C混合。
13. 制作两种 OptiPrep 梯度溶液，分别为 5% 和 15%（用溶液 E 稀释溶液 C（分别为 100 µl + 900 µl 和 450 µl + 1,050 µl）。
14. 将1.0毫升15%和0.5毫升5%的OptiPrep溶液放在样品上，在4℃下以52,000 xg离心90分钟。
15. 从顶部收集约20个等分试样（每个100微升）。
16. 通过Western Blot分析蛋白质标记物和/或进行脂质组学分析的馏分。

预期结果
图1所示为从SH-SY5Y人神经母细胞中分离脂质筏的例子。在这个实验中，细胞胆固醇用[3H]胆固醇微量标记（标记方法见低 et al., 2012)），并将标记胆固醇浓度最大的馏分定义为脂筏馏分（馏分5-9）。最近发表了一个使用flotillin-1（膜蛋白大量存在于脂质筏中，并被认为是筏标记）来识别脂质筏馏分的例子，也显示了该标记在馏分5-9中的最大丰度（Mukhamedova等人，2019）。

图1。从SH-SY5Y人神经母细胞的浆膜的梯度离心的代表性剖面图。

食谱

1. PBS（冰冷）
以预制溶液或片剂的形式从多家供应商处购买，或手工制备。
137毫摩尔（8克/升）氯化钠；
2.7 mM (0.2 g/L) KCl.
10 mM (1.44 g/L) Na2HPO4-2H2O；
1.8mM(0.24g/L)KH2PO4，pH值至7.4。
2. 解决方案A
OptiPrep (60%碘克沙醇，ρ = 1.32 g/ml)
3. 溶液B（稀释剂
0.25M蔗糖
6mM EDTA
120mM Tris-HCl，pH值7.6。
4. 解决方案C(工作解决方案)
50%碘克沙醇(ρ=1.282克/毫升)
将5体积的A溶液与1体积的B溶液混合在一起。
5. 溶液D(重悬介质1)
0.25M蔗糖
1mM EDTA
20mM Tris-HCl，pH 7.6 + 完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒
6. 溶液E（再悬浮介质2）
0.25M蔗糖
1mM EDTA
20mM Tris-HCl，pH值7.6。

篇二：脂质组学分析之脂质筏子

该脂质组学协议提供了相对于适当的内部标准的大范围的脂质物种的量化。人们认识到，不可能为每个脂质种类提供稳定的同位素内标，而且分析物的反应因子和相应的内标之间的差异没有调整。因此，脂质组的测量应被视为相对而非绝对的定量。

材料和试剂

1. Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030125.150）。
2. ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱（2.1 x 100 mm 1.8 μm）（安捷伦，目录号：959758-902）。
3. 氯仿(默克公司，目录号：1.02445.2500)
4. 甲醇(默克公司，目录号：1.06018.2500)
5. 丁醇(默克公司，目录号：1.01988.2500)
6. 甲酸铵(Sigma-Aldrich，目录号：516961-100G)
7. 内部标准(根据需要而不同)
8. 异丙醇(默克公司，目录号：1010404000)
9. 乙腈(默克公司，目录号：1000292500)
10. SPLASH® LIPIDOMIX®质量规格标准品，甲醇溶液（Avanti，目录号：330707，也可参考配方部分）。
11. 去离子（百万分之一）H2O
12. 液相色谱法溶剂A（见配方）。
13. 液相色谱法溶剂B（见配方）。
14. 萃取溶剂（见配方
15. 水饱和丁醇(见配方)
16. 甲醇与甲酸铵（见配方）。
17. 内部标准混合物（见配方）

装备

1. SpeedVac (Thermo Scientific Savan RVT5105 冷冻蒸汽阱)
2. 声纳槽(Soniclean 500TD声纳器)
3. 正向位移移液器（Gilson）
4. 涡旋混合器(Ratek VM1)
5. 台式离心机(Beckman Coulter Microfuge 22R离心机)
6. 旋转式搅拌机(Ratek)
7. 安捷伦6490三重四极质谱仪
8. 安捷伦1290高效液相色谱仪（二元泵、自动进样器、柱室、分流阀）。

軟件

1. 天际线(MacCoss实验室软件)

流程

A. 质量控制样品
1. 确保在提取样品之前采取适当的控制措施。所需的控制措施包括：
2. 无内部标准的空白解决方案。
3. 有内部标准的空白溶液（内部标准见"配方"）。
4. 汇集的质量控制样品（重复），可以监测整个分析运行的变化。这可以是全细胞裂解液的制备。

B. 脂类的分离
这个程序是改编自Weir等人（2013）。在提取之前，解冻内部标准品至室温一小时，在超声仪浴中超声15分钟，然后涡旋。
1. 在Eppendorf管中的SpeedVac中干燥样品。这将需要大约1小时，每100微升的样品。
2. 用10μl的MilliQ H2O重组样品。根据每个馏分的相对浓度，这些都可以汇集。一般来说，5微克至50微克的蛋白质是理想的良好脂质组信号。
3. 添加10微升的预混合标准使用一个积极的位移移液器（使用前在标准混合预湿喷嘴）。不要将预混合的标准品添加到空白处。
4. 使用正置换移液管向每个样品中加入200μl的氯仿和甲醇提取溶剂。对于体积低于10μl的萃取，可适当调整，加入20倍体积的2:1氯仿甲醇混合物。
5. 涡流样品并在旋转混合器上混合15分钟。
6. 在高功率（100%功率）设置下，将样品在超声仪槽中超声30分钟，确保槽温保持在28℃以下。确保水浴的温度保持在 28℃以下。样品应部分浸没在水浴中，以确保适当的接触。
7. 将样品在室温下静置20分钟。由于物流原因，在不影响提取效率的情况下，可延长至2小时。
8. 离心样品在13,000 xg离心10分钟，在20℃下，确保蛋白质已被造粒。
注意：如果蛋白质没有颗粒，很可能是水/氯仿/甲醇的比例不正确。尽可能多地吸出样品，同时避免任何沉淀的蛋白质，以挽救样品。
9. 将上清液转移到新鲜的Eppendorf管中，并在真空下干燥（SpeedVac）。
10. 在50微升的水饱和丁醇中重新溶解样品。
11. 将管子在超声仪浴中超声10分钟。
12. 加入50微升含10mM甲酸铵的甲醇。
13. 离心管10分钟，在13,000×g，在20℃。
14. 转移到0.2毫升的微插在32 x 11.6毫米的玻璃瓶中，用特氟龙插入帽和存储在-80℃，直到需要。
注意：使用具有特氟龙底层的帽盖非常重要，因为基于硅的帽盖会渗出并增加背景信号。

C. 定向综合脂质组分析的设置
脂质组学是一种高级技术，需要对液相色谱和质谱法有基本的了解。供应商提供的一些在线资源可作为概念和技术的入门指南（请点击这里）。

在脂质组学中，液相色谱与质谱联用通常用于在一次运行中筛选数百种化合物。特别是使用多反应监测的技术，由于其在选择性和灵敏度方面的优势，被广泛使用。然而，质谱仪在每个给定时刻只能进行有限的扫描次数。我们的脂质组学方法使用液体色谱仪在15分钟的时间内分离和洗脱脂质。通过结合每个脂质的已知洗脱时间，我们可以指定特定区域进行特定的多重反应监测（MRM）扫描。一起，这将减少花费的时间扫描不必要的过渡，并最大限度地提高我们的方法的广度。图2中显示了描述这一点的一个数字。所述方法（液相色谱质谱法）的简要示意图在图3和4中提出。
D节中的协议描述了一种方法，即在没有事先了解的情况下确定脂类的具体洗脱时间。

图2.利用预定的MRM来改善停留时间，减少反相色谱的周期时间。脂质在梯度的某些时期洗脱之前，其在质谱仪上的电离（图3）。通过利用这一点，某些扫描只需要在特定的时间点进行时，使用时间表多个反应（图4）。这允许最小化浪费的扫描，其中感兴趣的脂质不洗脱。这里的一个例子是，在15分钟，只需要2次扫描（底部）与11，如果不安排（顶部）通常执行。

图3.通过反相色谱分离脂类。用反相色谱法分离脂类。在反相条件下，脂类主要根据其极性进行分离。极性较强的化合物如酰基肉碱首先洗脱到质谱仪中，随着溶剂B比例的增加（最高可达100%），不溶于水的化合物（胆固醇酯、三酰甘油）最后洗脱。

图4.使用三四极质谱仪检查脂质。使用三重四极杆质谱仪检查脂类。这个特殊的工作流程利用三重四极杆质谱仪与MRM的。MRM的使几个实验发生在一个给定的时间。每个实验都有条件，使一个特定的质量在第一阶段的分离（前体离子），其次是碎片（在一个定义的碰撞能量）和分离和测量的碎片（产品离子）。这些条件加在一起，使得在检查不同大小和类别的脂质时，能够有一定程度的特异性，这也是这个特定协议的核心。

定时多反应监测的原理。
1. 预定的多种反应监测
多种反应监测设置。
a. 前体（Q1）和产品离子（Q3）是基于脂类的系统生成。表1提供了所用条件的概要。
b. 每种脂质的前体转变是通过将每种脂质的质量与其加合物的质量相加来发展的，即，PC（34:1）是通过将其确切的质量（759.5778）与其加合物（+H，所以1.0073）相加来生成的。
c. 靶向脂质组学分析需要多反应监测，以最大限度地延长停留时间（仪器检查前体/产物组合所允许的时间），同时最大限度地缩短周期时间（在给定时间内执行所有扫描所需的时间）。
d. 高停留时间对于良好的信号重现性和灵敏度是必要的。一般来说，在Agilent 6490上，每个过渡需要至少2毫秒。为了实现这一目标，根据峰形，为每个过渡提供相对较小的扫描窗口（20-60秒）（窄峰需要较小的窗口）。然而，由于扫描窗口较小，有可能由于保留时间的变化（通常是由于色谱柱老化或溶剂成分的蒸发等变化）而无法扫描到感兴趣的化合物。因此,为每一种感兴趣的脂质设置准确和合适的扫描窗口是非常重要的。
e. 柱和溶剂更换后，进行保留时间检查，其中分析运行较大的扫描窗口（从而减少停留时间，但允许每个峰的视觉对齐）和每个过渡中心向感兴趣的MS峰。
2. 设置校正系数
a. 在某一脂质或脂质类别没有合适的内部标准品的情况下，可以通过生成合适的响应因子来确定脂质浓度的估算。响应因子是必需的，因为在质谱仪上，来自不同类别（有时在类别内）的两种脂类的等量信号并不相等。
b. 这是通过在最合适的内部标准品旁运行等浓度（即，1 µM）的感兴趣的脂质标准品来实现的。信号的相对差异被用作响应因子。

表1.脂类的串联质谱分析条件
脂类/子类速记母离子碎片化* 碰撞能量(V) 品种示例转化实例(m/z, Q1/Q3)
鞘氨醇 Sph [M+H]+ NL，18.0 Da 8 Sph(d18:1) 300.3 282.3
鞘氨醇-1-磷酸 S1P [M+H]+ 狮身人面体特异性^ 11-16 S1P(d18:1) 380.2 264.3
二氢甘油胺 dhCer [M+H]+ 狮身人面体特异性^+H2O 31 dhCer(d18:1/24:0) 652.7 284.3
神经酰胺 Cer [M+H]+ 狮身人面体特异性^ 23-29 Cer(d18:1/20:0) 594.6 264.3
单六烷基甘油酰胺 HexCer [M+H]+ 狮身人面体特异性^ 33 HexCer(d18:1/24:0) 812.7 264.3
二十六烷基甘油酰胺 Hex2Cer [M+H]+ 狮身人面体特异性^ 53 Hex2Cer(d18:1/24:1) 972.7 264.3
三羟甲基氨基甲烷 Hex3Cer [M+H]+ PI，m/z 264.3 57 Hex3Cer(d18:1/20:0) 1080.7 264.3
GM3神经节苷脂 GM3 [M+H]+ 狮身人面体特异性^ 57 GM3(d18:1/24:1) 1263.8 264.3
GM1神经节苷脂 GM1 [M+2H]2+ PI，m/z 366.2 9 GM1(d18:1/16:0) 760.1 366.2
硫化物硫化物 [M+H]+ PI，m/z 264.3 56 硫化物(d18:1/24:0) 892.8 264.3
神经酰胺-1-磷酸酯 Cer1P [M+H]+ PI，m/z 264.3 29 Cer1P(d18:1/16:0) 618.4 264.3
鞘氨醇 SM [M+H]+ PI，m/z 184.1 25 SM(d34:1) 703.6 184.1
磷脂酰胆碱个人电脑 [M+H]+ PI，m/z 184.1 21 PC(34:2) 758.6 184.1
烷基磷脂酰胆碱 PC(O) [M+H]+ PI，m/z 184.1 21 PC(O-38:4) 796.6 184.1
烯基磷脂酰胆碱 PC(P) [M+H]+ PI，m/z 184.1 21 PC(P-38:6) 790.6 184.1
溶磷脂酰胆碱 LPC [M+H]+ PI，m/z 184.1 21 LPC(16:0) 496.3 184.1
赖氨酰磷脂酰胆碱(Lysoalkylphosphatidylcholine) LPC(O) [M+H]+ PI，m/z 104.1 21 LPC(O-18:0) 510.4 104.1
赖氨酰磷脂酰胆碱(Lysoalkenylphosphatidylcholine) LPC(P) [M+H]+ PI，m/z 104.1 21 LPC(P-18:1) 506.3 104.1
磷脂酰乙醇胺 PE
[M+H]+ NL，141.0 Da 17 PE(36:2) 744.6 603.6
烷基磷脂酰乙醇胺 PE(O) [M+H]+ NL，141.0 Da 17 PE(O-36:4) 726.5 585.5
烯基磷脂酰乙醇胺 PE(P) [M+H]+ 特定酰基 17 PE(P-16:0/20:4) 724.5 361.3
溶血磷脂酰乙醇胺; 溶血磷脂酰乙醇胺 LPE [M+H]+ NL，141.0 Da 17 LPE(20:4) 502.3 361.3
Lysoalkenylphosphatidylethanolamine (赖氨酸磷脂酰乙醇) LPE(P) [M+H]+ NL，171.9 Da 19 LPE(P-16:0) 438.3 266.4
磷脂酰肌醇 PI [M+NH4]+ NL，277.0 Da 17 PI(32:1) 826.5 549.5
溶血磷脂酰肌醇(Lysophosphatidylinositol) LPI [M+NH4]+ NL，277.0 Da 17 LPI(20:4) 638.3 361.3
磷脂酰丝氨酸 PS [M+H]+ NL，185.0 Da 25 PS(38:4) 812.5 627.5
磷脂酰甘油 PG [M+NH4]+ NL，189.0 Da 21 PG(36:2) 792.6 603.6
游离胆固醇 COH* [M+NH4]+ PI，m/z 369.3 23 COH 369.4 161.2
胆固醇酯 CE
[M+NH4]+ PI，m/z 369.3 10 CE(18:2) 666.6 369.3
脱氢胆甾醇酯 DE [M+NH4]+ PI，m/z 367.3 12 DE(18:1) 666.6 367.3
酰肉碱交流电 [M+H]+ PI，m/z 85.1 30 AC(16:0) 400.4 85.1
二酰甘油 DG [M+NH4]+ NL，脂肪酸 21 DG(16:0_18:2) 610.5 313.2
三酰甘油 TG [M+NH4]+ NL，脂肪酸 21 TG(54:3) [NL-18:1] 902.8 603.5
烷基双乙酰甘油 TG(O) [M+NH4]+ NL，脂肪酸 21 TG(O-52:2) [NL-16:0] 862.8 589.5
联苯醌联苯醌 [M+NH4]+ PI，m/z 197.0 17 联苯醌 880.7 197.0
PI，产物离子；NL，中性失落，^人面虫特异性PI为：d18:1，264.3，d18:0，266.3，d16:1，236.3，d18:2，262.3，d17:1，250.3，d19:1，278.3。* COH为源内片段

D. 准备液相色谱仪和质谱仪运行样品
目前的脂质组学方法的适应性是来自Huynh等人（2019）。设置和条件报告为安捷伦6490 QQQ质谱仪利用MRM与调度，结合1290安捷伦HPLC系统。
方法可以适应其他QQQ仪器，但将需要重新优化。额外的背景/更深入地描述三重四极杆质谱仪背后的关键概念和参数可以在供应商手册中找到（即，安捷伦6400系列）。

1. 将溶剂A和B设置到HPLC的相应管路中。
2. 净化管路，确保没有气泡存在。
3. 将柱室设置为60℃，并使用起始条件（90%溶剂A，10%溶剂B）以0.4ml/min的流速运行，以确保没有泄漏。
注：保留时间指数必须以仪器的方式生成。由于死体积的差异、溶剂组成的准确性和色谱柱的差异（即使是同一制造商的色谱柱），单个化合物的保留时间可能会有几秒钟的差异。
4. 准备一个一次性的质量控制样品（即，集合控制细胞），并提取脂质。
5. 所用的色谱溶剂梯度见表2。作为反相条件下脂类的一般规则。增加酰基链长度，即，PC(28:0)与PC(30:0)，将增加保留，导致较晚的洗脱时间(即，5.2至6.2分钟)，而增加不饱和度水平，即，PC(30:0)与PC(30:1)，将减少保留，导致较早的洗脱时间(即，6.2至5.3分钟)。图5中描述了一个例子。

表2.脂质组分析中使用的HPLC梯度脂质组分析中使用的HPLC梯度。
时间（分钟）溶剂A(%) 溶剂B(%) 流量（毫升/分钟）
0 90 10 0.4
2.7 55 45 0.4
2.8 47 53 0.4
9 35 65 0.4
9.1 11 89 0.4
11 8 92 0.4
11.1 0 100 0.4
11.9 0 100 0.4
12 90 10 0.4
12.9 90 10 0.4
13 90 10 0.4
14 90 10 0.4
14.1 90 10 0.4
15 90 10 0.4

图5.识别化合物以确定方法生成的保留时间。确定化合物的鉴定，以确定方法生成的保留时间。PC（34:1）和PC（34:2）之间的保留差异的例子。由于13C在自然界中的普遍性，大约1％的信号将携带到更高的质量（即，758.6进入759.6），并最终与其他物种的单同位素过渡重叠。同位素需要考虑和避免（红色的名称）时，整合和分配保留时间为每个化合物。PC-磷脂酰胆碱，SM-鞘氨醇。

6. 在所述色谱条件下，在质谱仪上以非计划的方式运行质控样品的洗脱液（无保留时间窗口）。这将用于确定每个脂质种类的保留时间（特定脂质洗脱的时间）。该保留时间是用来分配一个时期，其中质量规格执行MRM实验为感兴趣的脂质结合已知的个别过渡（一组条件与前体离子质量，产品离子质量和碰撞能量，这是在表1中给出）。该程序在图3和4中示出。这将有助于在调度脂质特异性的过渡在质量规格的最终方法的样品运行（程序的E节）。
7. 将来自不同脂质类别的控制质量样品的计划外运行的保留时间数据合并到一个单一的方法中。根据峰宽分配保留窗口（作为粗略的指导，一个0.2分钟的色谱峰应该有一个大约0.7分钟的窗口）。这将非计划（时间不受限制）扫描转换为计划（时间依赖）扫描。图3描述了一个例子。
8. 使用相同的梯度条件运行每个未计划的方法。然后，这是用来分配每个给定的感兴趣的脂质的扫描窗口。例如，在图5中，PC（34:2）（上图）将被分配的保留时间为6.36。最后的方法，然后将有PC（34:2）和保留时间指定的过渡。这是一个单独的运行为每个感兴趣的脂类。如果一切都执行到一个单一的计划外运行，我们将被限制在200测量。我们选择在这里运行每个类计划外，分配保留时间和扫描窗口，然后将它们合并成一个单一的方法，在最后为真正的样品。这就需要在第一时间对单个样本进行多次注入。
注：确保避免出现同位素峰。同位素峰的产生是由于自然界中存在丰度约为1.1%的碳-13。脂质主要由碳-12组成，不同种类的质量相差1～2Da。在某些情况下，一种极其丰富的脂质可以出现在几个质量范围内，与其他物种的单异位质量重叠。图5所示为PC(34:2)与PC(34:1)重叠的一个例子。色谱法可以分离重叠的同位素化合物。
9. 在该方法中，确保分流阀是分流溶剂前（通常是前1.2分钟，取决于死体积）。由于大量的碘克沙醇和非挥发性化合物的最终提取物，未能转移将导致大的信号变化，在多个样品运行期间，由于这些分子的积累在质谱仪源。

设置。
1. Agilent 1290 HPLC设置
自动取样器设置在25℃。
柱子室设置为60°C
高效液相色谱柱采用ZORBAX eclipse plus C18柱（2.1 x 100 mm 1.8 μm，Agilent）。
流量设置为0.4毫升/分钟
2. 质谱设置
气体温度，150℃
气体流量17升/分钟
雾化器 20 psi
护套气体温度200 °C
毛细管电压3,500 V
护套气体流量10升/分钟
循环时间为600毫秒
Q1、Q3隔离宽度设置为0.7 amu（单位分辨率）。

E. 运行样本
1. 解冻含有提取样品的玻璃瓶，让它们在室温下静置1小时。
2. 在超声仪浴上超声15分钟，并进行涡流。
3. 在室温下静置3小时。
4. 将样品插入自动取样器中。
5. 插入一个含有50%丁醇和50%甲醇的清洗瓶，在两次注射之间用此瓶清洗针头。
6. 继续用开发的方法运行样品。通常情况下，每个样品的进样量为5 µl，这样可以最大限度地提高灵敏度，同时不影响色谱峰的形状。

F. 数据整合和分析
1. 可以使用任何供应商(MassHunter)或开源(Skyline)软件对数据进行整合(计算峰值的面积)。这为每个化合物提供了一个值，是脂质组学工作的终点。
2. 每一个峰区都要进行整合，确保没有同位素峰意外整合。
3. 为了确定每个脂质的浓度，将每个感兴趣的脂质的面积除以相关内标的面积，然后应用任何适当的校正因子（见步骤C2"设置校正因子"）。然后应用任何适当的校正因子（见步骤C2"设置校正因子"）。
4. 数据可以进一步归一化到筏丰度的措施（例如，flotillin-1或胆固醇的丰度），蛋白质或总磷脂酰胆碱。
5. 图6中提供了一个提取离子色谱图（所有结果叠加）和1种脂类的拉出示例。

图6.等离子体样品在目标平台上运行的结果示例。在目标平台上运行等离子体样品的示例结果。A.提取的离子色谱图的所有转换测量。这表示计数（y轴）和时间（x轴）。B.LPC(18:0)的一个例子，其中每个峰面积被单独集成。当计算出相对于其内部标准的面积时，所得面积用于定量。
食谱

1. 液相色谱法溶剂A
50% H2O
30%乙腈
20%异丙醇(v/v/v)
10毫米甲酸铵（每1升630.6毫克）
2. 液相色谱法溶剂B
1% H2O
9%乙腈
90%异丙醇(v/v/v)
10毫米甲酸铵（每1升630.6毫克）
3. 萃取溶剂
氯仿：甲醇混合物，2:1(v/v)
4. 水饱和丁醇
a. 将等量的水和丁醇混合在一起，充分搅拌。
b. 使用前需静置约4小时。
c. 沉淀后，使用含有丁醇的面层。
5. 甲醇与甲酸铵
甲醇
10毫米甲酸铵（每1升630.6毫克）
6. 内部标准混合
a. 可以使用内部标准品（适当的浓度），但建议使用预制标准品（SPLASH® LIPIDOMIX® Mass Spec Standard）。
SPLASH® LIPIDOMIX®质量规格标准品（Avanti Polar Lipids Inc.）包括：
15:0-18:1(d7)个人计算机。 [160微克/升]
15:0-18:1(d7) PE [5微克/升]
15:0-18:1(d7) PS [5微克/升]
15:0-18:1(d7) PG [30 µg/L]
15:0-18:1(d7) PI [10 µg/L]
15:0-18:1（d7）PA [7微克/升]
18:1(d7) LPC [25微克/升]
18:1(d7) LPE [5微克/升]
18:1(d7) 胆甾醇 [350 µg/L]
18:1(d7) MG [2 µg/L]
15:0-18:1(d7) DG [10 µg/L]
15:0-18:1(d7)-15:0 TG [55 µg/L]
18:1(d9) SM [30 µg/L]
胆固醇(d7) [100微克/升]
b. 将标准品干燥后，用提取溶剂重新配制成适当体积的标准品。
c. 确保彻底混合

竞争性利益

提交人声明没有与这项工作相关的竞争利益。

鸣谢

作者得到了美国国家卫生研究院的资助（HL131473给DS）。
这个协议是从以前的工作中修改的。Mukhamedova等人（2019年）和Huynh等人（2019年）。

参考文献

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6. Weir, J. M.、Wong, G.、Barlow, C. K.、Greeve, M. A.、Kowalczyk, A.、Almasy, L.、Comuzzie, A. G.、Mahaney, M. C.、Jowett, J. B.、Shaw, J.、Curran, J. E.、Blangero, J. 和Meikle, P. J. (2013)。大型人群队列中的血浆脂质分析。J Lipid Res 54(10): 2898-2908。